Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Özet

Kraniofasial kıkırdaklar diğer dokuları ile yakın temas içinde gelişir ve canlı hayvan işlemek için zordur. Elektroporasyon erken embriyonik etkileri atlayarak kraniyofasiyal iskeletin büyüme sırasında moleküler araçlar sunmak için kullanıyor. Bu yaklaşım, aday moleküllerin etkin bir şekilde test etmek için bize izin verecek In vivo.

Özet

Elektroporasyon, hassas zaman noktalarında dokulara ve hassas yerlerde DNA ve diğer ücret makromoleküllerin teslim etkili bir yöntemdir. Örneğin, elektroporasyon Xenopus sinir ve retina gelişimini incelemek için büyük bir başarı ile kullanılan, tavuk ve fare ^1-10. Ancak, tüm bu çalışmalarda, araştırmacılar yumuşak dokuların hedefleyen çalışmalar olduğunu not etmek önemlidir. Kraniyofasiyal gelişim ile ilgilenen, çünkü biz bir yöntem yüz mezenşimin hedef uyarladı.

Edebiyat aradı, biz, bizim için sürpriz, kıkırdak dokusu içine başarılı gen transferi çok az raporlar bulundu. Bu çalışmaların çoğu, gen terapisi çalışmaları, chondrogenic hücre hatları içine siRNA veya protein teslimat, ya da ^artrit 11-13 hayvan modelleri gibi . , Tavuk ya da fare gibi diğer sistemleri, yüz mezenşimin elektroporasyon zorlu olmuştur (kişisel HABERLEiyonlar, Kraniofasial Geliştirme Bölümü, KCL). Biz Xenopus procartilaginous ve kıkırdak dokulara elektroporasyon daha iyi çalışması olabileceği varsayımında bulunduk. Çalışmalarda, biz yüz kıkırdaklar gen transferi yüz primordium hala kıkırdak farklılaşması önce yumuşak doku oluşur erken evrelerinde (28), verimli bir şekilde oluşur.

Xenopus kraniyofasiyal gelişim analizi için çok erişilebilir omurgalı sistemi. Xenopus embriyoların en erken aşamalarında analizler sağlayan, dışarıdan döllenmiş ve canlı tek bir hücre çözünürlükte görüntüleme yanı sıra annelere ¹⁴ yeniden kolaylaştırılması Kraniofasial yapıları nedeniyle daha kolay görünür Xenopus başka herhangi bir omurgalı modeli daha, öncelikle. Dışarıdan gelişmekte olan omurgalı modeller arasında, Xenopus larvaları di daha büyük ve daha kolay olarak Xenopus zebrafish daha kraniyofasiyal analizi için daha yararlı .ssect ve gelişmekte olan yüz bölgesine balık eşdeğer bölgesi dışında görüntüleme için daha erişilebilir. Buna ek olarak, Xenopus zebrafish (~ 100 milyon yıl yakın) ¹⁵ daha insanlar için evrimsel olarak yakın. Son olarak, bu aşamada, Xenopus tetarlar şeffaf ve floresan proteinlerle veya moleküller eşzamanlı ifade gelişmekte olan kıkırdaklar daha kolay görsellik sağlayacaktır. Biz bu yaklaşımı bize daha hızlı ve verimli bir şekilde in vivo model sistem bir aday molekülleri test etmek için izin olacağını tahmin ediyoruz.

Protokol

Bölüm 1A. Ekipman

Mikroskop: düşük güç amacı ile dik stereo diseksiyon kapsamı

• Gerilim / Pulse Generator: BTX ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistemi
• Pipet çektirmesi: P-87 Mikropipet Çektirme (Sutter Instrument Company, CA)
• Manipulator: kaba, ya da kombine kaba ve ince hazırlık bağlı.
• Mikropipet sahibi: Güzel Bilim Araçları
• Elektrot: ev yapımı
• Elektroporasyon kamara: ev yapımı

L-şekilli elektrotlar:

1. Yüksek saflıkta 8 cm 0.4 mm tungsten tel (Goodfellow) ve orta noktasında yapıştırmayın kesin 1ml şırınga kullanarak bir macun (Blu-Tack). 4 cm tungsten tel L şekline bend ucu ve şırınga ucu açık bırakın, ucundan 1 cm (Şekil 1A).
2. Ucu sonuna kadar uzunluğu 0.5 mm boyutlarında kesin. Tonun ucu elektrot uçtur.
3. Şırıngaya aşırı tungsten tel paralel ve elektrot nabız jeneratörü bağlamak için onu kullanabilirsiniz.
4. Bir çift elektrot verme işlemi tekrarlayın.
5. DC kablolar üzerinden kare dalga darbe jeneratörü elektrotları takın.

Elektroporasyon kamara

1. Hat alt ~ 5 mm non-toksik hamuru ile 90 mm çanak.
2. Elektroporasyon medya ile çanak doldurun.
3. No: 5 saatçilik forseps T-şekilli bir kuyu (Şekil 2) bölmek. ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm ve kısa ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm uzun iyi ölçmelidir. Elektroporasyon bulaşık yıkanır ve tekrar kullanılabilir.

Bölüm 1B. Reaktifler

DNA veya tahsil makromoleküllerin

• Mikropipetler: 1 mm genişliğinde 4 "uzun borosilikat cam kapilerleri (TEFE, TW100-F)
• Kültür medya: Normal Amfibi Medya (NAM)
• > 10 X stoğu: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO _{3) 2} • 4H ₂ O, 1 mM EDTA.
  • 4 ° C'de Otoklav ve mağaza
  • 1 X NAM: 10x stok, tampon 0.1 mM NaHCO ₃ ve 0.2 mM Na ₃ PO ₄ ile seyreltilir.
• Xenopus laevis tetarlar, sahne 28

DNA hazırlığı:

1. Ifade plazmid standart protokolleri kullanarak hazırlayın.
2. Nükleaz serbest H ₂ 0 1 mcg / ml final konsantrasyonda DNA tekrar

* PCS2 gibi güçlü bir CMV organizatörü içeren vektörler, başarı vardı + [16]. Soy analizi için, biz genellikle son bir 0.1 mg / ml konsantrasyonda yeşil floresan proteininin (pCS2 GFP) kodlayan DNA içerir. [0.1-3 mg / ml arasında DNA konsantrasyonları da test edildi. Biz bulduğu konsantrasyonları 0.8 mg / ml verimsiz etiketli hücre altında, daha fazla DNA konsantrasyonları ise 2 mg / mu; l elektroporasyon verimliliğini artırmak vermedi].

Morfolino oligonükleotid hazırlanması:

(Not:. Pratisyenler fluoresceinated gerekir (3'-carboxyfluorescein değiştirilmiş) veya başka bir ücret)

1. Süspanse edin morfolino oligonükleotidler (MOS) (Genetools, www.genetools.com nükleaz serbest H ₂ 0 2 mM konsantrasyonda).
2. Isı kısım stok solüsyonu 65 ° C'de 5 dakika.
3. Son konsantrasyonu 0.5 mM nükleaz ücretsiz su sulandırınız.

* 0.1-1mm MO çözümleri test edildi. 0.5 mM MO çözümler birçok mezenkimal hücreler elektroporasyon için yeterli oldu.

Mikropipetler

1. Borosilikat cam kılcal damarlar (1 mm genişliğinde, 4 "uzun, TEFE yok. TW100-F) mikropipetler hazırlayın. Mikropipetler hazırlamak, 8-12 mm uzunluğunda konik ve ince uçlu iğne çektirmesi kullanın.
2. Crush ucu ~ 2 mmucundan, forseps kullanarak pürüzlü bir duraklama.

Medya

1. Kuluçka medya: 1x stok taze 3 / 4 Normal Amfibi Medya (NAM) hazırlayın. 0.025 mg / ml gentamisin ekleyin.
2. Elektroporasyon medya: yukarıdaki gibi,% 0.1 Benzocaine (Sigma, 06.950).

2. Elektroporasyon

Mikropipet kurulum

1. Mikropipet ~ 1 ul enjeksiyon solüsyonu ile doldurun.
2. Mikromanipülatör mikropipet Güvenli ve mikroenjektör (Picospritzer II) ekleyin.
3. Masa üstü ile 50 ° açı mikropipet.
4. Enjeksiyon basıncı 20 PSI olarak ayarlayın.
5. Puls başına 30 nl enjekte mikropipet kalibre edin.

Tadpole hazırlık

1. 5 dakika elektroporasyon medya kuluçka aşamasında 28 Xenopus larvaları anestezisi.
2. Elektroporasyon medya ile dolu elektroporasyon odasına anestezi larva transferi. Pozisyonu embriyoUzun içinde baş, aşağı dorsal tarafına ve ventral tarafta maruz T kavşak aittir. Kafa, kuyruk göre biraz yüksek olmalıdır.
3. Forseps kullanarak, hafifçe hamuru çevreleyen ile larva güvenli. (Not:. Larva güvenli değilse, seğirme ve elektroporasyon sırasında elektrot ile irtibata Bu durumda yüz dokular ciddi hasar görecek olması, tetra atmak)

Elektroporasyon

1. Mikropipet ucu hemen çimento bezi ve arka yüz mezenşimin içine yerleştirin.
2. 30 nl çözüm mezenşimin içine enjekte edilir.
3. Mikropipet geri çekin.
4. Hızla embriyonun kafası (Şekil 3) paralel elektrot uçları aynı hizaya getirin.
5. 8 50 ms, 20mV kare darbeleri uygulayın.
6. Elektrotlar geri çekin.
7. Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde larva serbest ve 3 / 4, NAM, 0.025 mg / ml gentamisin transfer.
8. 3 / 4, NAM, 0.025 mg / ml overn tetarlar inkübe edilmelidir.ight, ya da daha uzun.
9. 24 saat sonra floresan mikroskobu ile verimli elektroporasyon Ekran embriyolar.

3. Temsilcisi Sonuçlar:

Floresan moleküllerin electroporated embriyoların kullanımı kolay tarama sağlar. Şekil 4 14.5 inkübe MO electroporated tetarlar ~ 12, 48 ve 96 saat sonra elektroporasyon tipik bir parti, ° C Floresan mikroskobu kullanarak, katille elektroporasyon sonra hemen görüntülenebilmekte ve elektroporasyon sonra birkaç gün süreyle devam edilebilir. Bizim tecrübelerimize göre, floresan aşamada 46 (~ 5 gün sonra) zayıf açıktır. Kıkırdaklar, floresan farklılaşma (~ St 42) başladıktan sonra dramatik bir şekilde azalır, ancak MO floresan gibi faringeal endoderm gibi diğer hücre tiplerinde daha güçlü devam. Floresan mikroskopi oligonükleotidler kıkırdak dahil olmak üzere birçok kraniyofasiyal dokular dahil olduğunu gösterir. Oligonükleotid floresans cgenellikle başın iki tarafında doku görüntülenebilmekte. Bu büyük olasılıkla elektroporasyon önce gevşek kraniyofasiyal mezenşimin boyunca enjeksiyon solüsyonu hızlı difüzyon nedeniyle.

Şekil 1 Homemade elektrotlar. L-şekilli tungsten tel, toksik olmayan kil veya macun kullanarak 1 ml şırınga eklenir. (A) elektrot terminus, 5 mm. (B) Termini paralel olarak, bir çift elektrot takın. Elektrotlar DC kabloları ile darbe jeneratörüne bağlı.

Şekil 2 Elektroporasyon kamara. (A) hamuru ile kaplı 90 mm çanak medya ve No 5 saatçilik forseps ile oyulmuş bir T-şeklindeki haznesi ile doludur. (B) uzun kenarı 2 mm X 2 mm X10 mm boyutlarındakısa önlemleri 2 mm X 2 mm x 5 mm iken. Embriyonun baş T-kavşak, ventral tarafta aittir.

Şekil 3 şematik gösteren elektroporasyon prosedür. St 28 larva ventral yüzü yukarı, elektroporasyon odasında yerleştirilir. Mikropipet yüz mezenşimin yatan çimento bezi içine yerleştirilir. Enjekte edilir. Mikropipet kaldırılır ve L-şekilli elektrotlar kafa paralel yan hizalanır. Sekiz 50 ms, 20 mV kare darbeleri uygulayın. Elektrotlar geri çekin. Istenilen safhalarında tetarlar büyütün. Pratisyenler veya floresan mikroskobu kullanarak GFP ifade görselleştirin.

Şekil 4 Temsilcisi tetarlar 12 (A), 48 (B) ve 96 (C) saat elektroporasyon (sırasıyla aşamaları 30, 34 ve 44). (A-B ") Floresan MO geyik kraniyofasiyal mezenşimin içinde görüntülenebilmektees 30 ve 34. Floresans aşamada 44 (ok ucu, C'-C ") az kıkırdaklar tespit edilebilir. Gut yüksek autofluorescent.

Tartışma

Bu video, Xenopus iribaşların yüz mezenşimin elektroporasyon aracılı gen teslim fizibilite göstermiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, bize daha sonraki zaman noktalarında belirli dokuları hedef sağlayan genin fonksiyonu manipüle erken gelişimsel etkileri atlayabilir. Çalışmalar bize electroporated hücrelerin yanı sıra ilgi proteinlerin hücre özerk gereksinimleri soy incelemek için izin, heterojen toplumlarda kraniyofasiyal mezenkimal hücreler etkilenmiş olabileceğini göstermektedir. Canlı görüntüleme ile birlikte, biz kraniyofasiyal gelişimi sırasında, zaman içinde gen fonksiyonunu incelemek için bu yaklaşımı kullanabilirsiniz. Bu yeni bir yöntem organogenez çalışma Xenopus tractability vurgulamaktadır. Biz genel olarak bu yöntem de morfolojilerinden ve diğer dokulara farklılaşma çalışma adapte edilebilir olduğunu tahmin ediyoruz.