Yalıtımlı LacZ ifade Sitometrisi kullanarak Fare İç Kulak Dokular Hücreler

Özet

Flow sitometrisi, belirli hücre popülasyonlarının izolasyonuna ve incelenmesine izin veren güçlü bir araçtır. Bu protokol, yenidoğan transgenik farelerden alınan koklear dokulardan LacZ eksprese eden hücrelerin izole edilmesi için adımları açıklar. Ayrışmış koklear hücreler, akış sitometrisi ile ayrılmadan önce floresan konjuge β-galaktosidaz substratları kullanılarak etiketlendi.

Özet

Belirli hücre tiplerinin izolasyonu, kök/progenitör hücreler gibi nadir hücre popülasyonlarının analiz edilmesini sağlar. İç kulak dokularını incelemek için böyle bir yaklaşım, ilgilenilen hücrelerin azlığı ve az sayıda transgenik raportör fare modeli nedeniyle benzersiz bir zorluk teşkil etmektedir. Burada, yenidoğan koklealarından LacZ pozitif hücreleri seçici olarak etiketlemek için floresan konjuge problar kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Sensörinöral işitme kaybının altında yatan en yaygın patoloji, ses dalgalarını nöral uyarılara dönüştürmek için gerekli olan koklear duyusal tüy hücrelerinin geri dönüşümsüz hasarı ve kaybıdır. Son kanıtlar, murin, işitsel ve vestibüler organların, rejeneratif potansiyele sahip olabilecek kök/progenitör hücreleri barındırdığını göstermektedir^1,2. Bu bulgular, kök / progenitör hücre özelliklerine sahip spesifik hücre tiplerinin tanımlanması da dahil olmak üzere daha fazla araştırmayı garanti eder. Wnt sinyal yolunun, çeşitli organ sistemlerinde kök / progenitör hücre popülasyonlarının korunmasında kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir^3-7. Yakın zamanda yenidoğan kokleasında Wnt'ye duyarlı Axin2 eksprese eden hücreleri tanımladık, ancak işlevleri büyük ölçüde bilinmemektedir⁸.

Wnt'ye duyarlı bu hücrelerin davranışını in vitro olarak daha iyi anlamak için, Axin2-LacZ raportör fareler^9'un koklealarından Axin2 eksprese eden hücreleri izole etmek için bir yöntem geliştirdik. Axin2-LacZ pozitif hücreleri yenidoğan koklealarından izole etmek için akış sitometrisi kullanarak, kök / progenitör hücreler olarak davranışlarını sorgulamak için canlı hücreler üzerinde çeşitli deneyler yapabiliriz. Burada, neonatal kokleanın mikrodiseksiyonu, bu dokuların ayrışması, LacZ pozitif hücrelerin florojenik bir substrat kullanılarak etiketlenmesi ve hücre sınıflandırması için adımları ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Kokleaları tek hücrelere ayırma ve koklear hücreleri akış sitometrisi ile izole etme teknikleri tanımlanmıştır^2,10-12. LakZ eksprese eden hücreleri neonatal kokleadan izole etmek için yeni bir protokol oluşturmak için bu tekniklerde değişiklikler yaptık.

Protokol

1. Kokleanın mikrodiseksiyonu

1. Yüzeyleri p etanol ile silerek ve buz bloklarını yerleştirerek kaput altında diseksiyon mikroskobu hazırlayın.
2. Steril koşullarda 10-15 adet 35 mm Petri kabı hazırlayın ve yarısına kadar (~ 2 ml) steril Hank'in Kalsiyumlu Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile doldurun.
3. Steril koşullarda iki adet 35 mm'lik Petri kabı hazırlayın ve yarısına kadar (~ 2 ml) steril 1x fosfat tamponlu çözelti (PBS) ile doldurun.
4. Mikro forsepsleri 50 ml'lik konik Falcon tüpünde p etanol ile sterilize edin.
5. Steril başlıktan ayrı bir odada, 12-15 doğum sonrası (P) 0-3 günlük Axin2^LacZ/+ muhabir farelerin kafasını kesmek için iris makası kullanın ve kafaları buz bloğu üzerinde 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
6. # 5 Dumont forseps ve iris makası kullanarak, mandibula ve dili kesin ve kafatası tabanını damak hizasında kesin.
7. Kalvaria'nın üstteki derisini çıkarın ve foramen magnumun alt kısmından damağın ortasına makası sokarak kafa tabanını kesin.
8. İris makası ile damağın kesik kenarından her iki taraftaki kalvarianın üst yönüne doğru otik kapsüle zarar vermemeye dikkat ederek bir kesi daha yapın.
9. Foramen magnumun üst yönünden başlayarak sert damakta koronal kesiye kadar uzanan 45 derece açılı iki adet kesi yapılarak temporal kemiğin tam izolasyonu.
10. İzole edilmiş temporal kemikleri buz bloğu üzerine HBSS içeren 35 mm'lik Petri kaplarına yerleştirin.
11. Kurban edilen yaklaşık 12-15 hayvandan toplam 24-30 temporal kemik için temporal kemikler toplayın.
12. İzole edilmiş temporal kemiklere sahip Petri kabını önceden hazırlanmış steril diseksiyon başlığına (1.1) aktarın.
13. HBSS (1.2) içeren önceden hazırlanmış her 35 mm'lik Petri kabına dört temporal kemik aktarın ve buz bloğu üzerine yerleştirin.
14. Otik kapsülün üzerindeki temporal kemikteki korteksi, beyin sapını ve beyinciği nazikçe çıkarmak için iki # 55 forseps kullanarak mikrodiseksiyona başlayın.
15. Otik kapsülü çıkarmadan, vestibülokoklear sinirin girişinden başlayarak koklear kapsülün parçalarından otik kapsüle doğru kopun.
16. Koklea tabanının açığa çıkmasının ardından, kokleayı ve çevresindeki dokuları nazikçe dışarı çekin. Tabandan başlayarak kalan spiral ganglionu ve stria vaskülarisi çıkarın.
17. Kokleayı buz bloğu üzerinde PBS içeren 35 mm Petri kabına aktarın.
18. Optimal doku canlılığı için toplam diseksiyon süresi 60 dakikadan az olmalıdır.
19. Axin2-LacZ fareleri için kontrol olarak 3-5 vahşi tip (WT) P0-P3 fare için yukarıdaki adımları tekrarlayın.

2. Hücre ayrışması (daha önce açıklanan yöntemlerden değiştirilmiş)^2,10

1. 50 μl steril PBS'yi 6 oyuklu kaplamasız bir kültür kabına bir kuyunun ortasına yerleştirin.
2. Her 50 μl'lik PBS damlasına 20 adede kadar Axin2^LacZ/+ koklea aktarın. 20'den fazla koklea için 50 μl'lik yeni bir PBS damlası kullanılmalıdır.
3. 37 ° C'lik bir su banyosunda ~ 2 dakika boyunca% 0.125 tripsin içeren 50 μl alikotları önceden ısıtın.
4. Koklea içeren PBS'ye 50 μl önceden ısıtılmış% 0.125 tripsin ekleyin.
5. 6 oyuklu tabağı 37°C'de 8 dakika bekletin, tabağı sallamamaya dikkat edin.
6. Tripsinizasyonu sonlandırmak için, her 100 μl damlacığa 50 μl soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin.
7. İlave 50 μl Tam Ortam (FM) ekleyin (DMEM/F12'de IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampisilin)²
8. 125 μl'ye ayarlanmış bir p200 pipetteman ile 300 μl'lik künt bir pipet ucu kullanarak, kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek hücreleri 80 kez nazikçe ezin.
9. Her damlacığın öğütülmesinin ardından, her bir oyuğa 200 μl daha FM ekleyin.
10. Hücreleri 40 μm'lik mavi bir Falcon hücre süzgecinden yeni bir kuyuya geçirin.
11. Hücreleri standart Falcon FACS tüplerine aktarın (öğütme ve filtrasyondan sonra yaklaşık 300 μl kalır).
    1. Vahşi tip koklealardan hücreleri üç tüpe bölün ve her tüpte 100 μl'yi 300 μl FM ile seyreltin. Bir tüp boş kontrol olarak kullanılacak, biri sadece propidyum iyodür (PI, 1 μg/ml) ile boyanacaktır (bu adımda eklenmeyecektir), sonuncusu ise arka plan floresansını tespit etmek için 3-karboksiyumbelliferil β-D-galaktopiranosid (CUG, bkz. 2.15) ile boyanacaktır.
    2. Her bir FACS tüpüne Axin2-LacZ koklealarından 400 μl ayrışmış hücre yerleştirin. Sadece bir CUG kontrolü olarak, 10 μl hücreyi 390 μl FM'de seyreltin (Adım 2.15'teki tüp F'ye bakınız). Kalan tüplerin hacmini 400 μl'ye getirin.
12. Hücreleri 37 ° C nemlendirilmiş bir inkübatörde 10 dakika inkübe edin.
13. CUG çözeltisini hazırlayın:
    1. Boyama gerektiren her FACS tüpü için 200 μl CUG hazırlayın.
    2. Minimum ışığa maruz kalacak şekilde karanlık bir başlıkta CUG'yi FM 1:50'de seyreltin.
    3. Seyreltilmiş CUG'yi 37°C'de 3-5 dakika önceden ısıtın.
14. Daha sonra, her uygun FACS tüpüne 200 μl seyreltilmiş CUG ekleyin. CUG'ye sahip olarak tasarlanmamış tüpler için yalnızca FM ekleyin (bkz. 2.15).
15. Bu noktada, aşağıdaki içeriğe sahip beş tüp kategorisi olmalıdır (bu adımda PI eklemeyin):
    1. Wildtype - CUG veya PI olmadan (tazminat için adım 3.5-6'ya bakın)
    2. Wildtype - yalnızca PI ile (tazminat için)
    3. Wildtype - CUG ve PI ile (Axin2-LacZ hücrelerine karşı kontrol için)
    4. Axin2-LacZ - sadece CUG ile (tazminat için)
    5. Axin2-LacZ - CUG ve PI ile (gerçek hücre sıralaması için)
    6. Axin2-LacZ - CUG ve PI ile (olay analizi için)
16. Tüm tüpleri ışıktan koruyun ve 37 ° C nemlendirilmiş bir inkübatörde 25 dakika inkübe edin.
17. İnkübasyondan sonra reaksiyonu durdurmak için taze HEPES + Fetal Sığır Serumu (FBS) solüsyonu hazırlayın:
    1. 400 μl taze çözülmüş FBS'yi 15 ml'lik bir Falcon tüpünde 10 ml steril 10 mM HEPES (PBS cinsinden) içinde seyreltin.
    2. Tüpü 2.16 tamamlanana kadar buzun üzerine yerleştirin.
18. Işığa maruz kalmayı en aza indirmek için ışıkları kapalı steril bir başlık altında her bir FACS tüpüne 1,8 ml buz gibi soğuk HEPES solüsyonu ekleyin.
19. Hücreleri 1200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin.
20. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 300 μl FM'de yeniden süspanse edin, ayırma numunesi için tüm alikotları toplayın (CUG ve PI ile boyanmış Axin2-LacZ).
21. 1 μg / ml'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için her tüpe PI ekleyin.
22. Hücreleri buzun üzerine yerleştirin ve ışıktan koruyun.

3. Akış Sitometrisi

1. 488 nm, 633 nm ve 407 nm lazerlerle donatılmış bir BD Aria II kullanıyoruz. CUG'nin tespiti, Stanford Shared FACS Facility'de 407 nm mor lazer ve PI 488 nm mavi lazer kullanılarak yapıldı.
2. Eğitimli bir akış sitometresi operatörü gereklidir. Lazerleri ısıttıktan, üretici talimatlarını kullanarak sitometre dedektörlerini kalibre ettikten ve optimum sıralama parametrelerini ayarladıktan sonra bir sonraki adıma geçin. Deneyimlerimize göre, 100 μm'lik bir nozulun kullanılmasının sonraki deneyler için hücre canlılığını optimize ettiğini gördük.
3. Aşağıdaki parametreler kullanıldı: 5.000 olayda eşik, 3.000 olay/saniyeden az akış hızı, 125 voltta ileri saçılma (FSC) ve 250 voltta yan saçılma (SSC), PI için PE-Cy5 kanalı ve CUG için Cascade Blue kullanıldı.
4. Sitometre odasını bu sırayla iki kez% 70 etanol ve PBS ile yıkayın.
5. Analize boyanmamış, vahşi tip hücrelerle başlayın (Adım 2.15'teki tüp A). FSC ve SSC grafiğindeki hücre dağılımını belirlemek için 1.000 olay toplayın. Dağılım istenmiyorsa, FSC ve SSC parametrelerini ayarlayın.
6. Boyanmamış WT (tüp A), PI ile boyanmış WT (tüp B) ve CUG ile boyanmış Axin2-LacZ (tüp D) hücreleri kullanarak kompanzasyon gerçekleştirin. Kompanzasyon, farklı lazer dalga boyları arasında daha doğru sinyal ayrımına izin verecektir.
7. Vahşi tip PI ve CUG lekeli hücrelerle (tüp C) analize başlayın ve aşağıdakiler için geçit parametrelerini ayarlayın:
   1. FSC'ye karşı SSC grafiğine dayalı olarak enkazın hariç tutulması.
   2. FSC yüksekliğine karşı FSC alanı grafiği kullanılarak çiftlerin ve kümelerin hariç tutulması.
   3. FSC alanına karşı PE-Cy5 alan grafiğine dayalı olarak ölü hücrelerin dışlanması.
   4. Herhangi bir kapı yerleşimi ile FSC alanı ile Cascade Blue alanı arasında bir çizim ayarlayın.
8. Ardından, Axin2-LacZ PI ve CUG lekeli hücreler (tüp F) içeren sıralama numune tüpünden 10.000 olayı analiz edin.
   1. Vahşi tip hücreler kullanılarak ayarlanan tüm kapılar burada uygulanmalıdır.
   2. Vahşi tip hücreler için çizimleri kullanarak, toplam olay sayısının %1'inden daha az olan Cascade Blue-high hücreleri için geçitler oluşturun.
   3. Cascade Blue-high'ın aynı kapıları şimdi Axin2-LacZ örneğindeki hücrelerin yaklaşık% 15-20'sini kapsıyor ve bu Axin2 yüksek hücreleri yapıyor.
   4. Axin2-LacZ hücrelerinin analiz grafiğini kullanarak, hücrelerin en az florojenik -20'si, bundan böyle Axin2-düşük hücreler için bir kapı oluşturun.
9. Yukarıda bahsedilen geçit stratejisine dayanarak, hücreleri 500 μl FM içeren FACS tüplerine, bir tüp Axin2-yüksek ve diğeri Axin2-düşük hücreler için sıralayın. Sıralama sırasında toplama tüplerinin 4°C'ye soğutulmuş bir odada olduğundan emin olun.
10. Her popülasyon için akış sitometresi tarafından sayılan hücre sayısını kaydedin.

4. Temsili Sonuçlar (bkz. Şekil 2):

Yukarıdaki protokolle, tipik olarak hem vahşi tip hem de Axin2^LacZ/+ koklealarından (Şekil 2A ve B) @-45 oranında kalıntısız hücreleri kurtarırız ve bunların yaklaşık p'i çiftsiz olarak (bkz. Şekil 2A' ve B'). Sıralanan hücrelerin çoğu canlıdır ve PI'yi (~% 95) almamıştır (Şekil 2A '' ve B ''). Ortalama olarak, en üst ~% 20 CUG-pozitif hücreler Axin2-LacZ-pozitif hücreler olarak kabul edilir (Şekil 2B'') ve 10-12 hayvan başına yaklaşık 15.000 Axin2-LacZ-yüksek hücre ile ilişkilidir.

Tartışma

Bağımsız araştırma çalışmaları, yenidoğan koklealarında sınırlı rejeneratif kapasiteyi karakterize etmiştir^2,10,12,13. White ve meslektaşları, bir GFP raportör faresi ve akış sitometrisi kullanarak, spesifik koklear destekleyici hücreleri izole ettiler ve bunların progenitör hücre özelliklerine sahip olduklarını buldular¹².

Kanonik Wnt yolunun beyin, meme bezi, hematopoietik sistem, deri ve gastrointestinal bağırsak kriptleri dahil olmak üzere çoklu organ sistemlerinde kö...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Petri kabı, polistiren, steril Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR uluslararası	82050-540
BD Falcon Hücre Süzgeçleri, Steril, BD Biosciences, mavi, 40 & mu; m	VWR uluslararası	21008-949
Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). Kalsiyum, Magnezyum ve Fenol Kırmızısı içermeyen çözelti, Steril	VWR uluslararası	45000-456
Cellstar santrifüj tüpleri, polipropilen, steril, greiner bio-one, 50 ml	VWR uluslararası	82050-346
Cellstar santrifüj tüpleri, polipropilen, steril, greiner bio-one, 15 ml	VWR uluslararası	82050-278
B-27 Serumsuz Takviye (50x), sıvı	Invitrogen	17504-044
N-2 Takviyesi (100x), sıvı	Invitrogen	17502-048
bFGF, fibroblast büyüme faktörü-temel insan	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, fareden insülin benzeri büyüme faktörü-1	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, epidermal büyüme faktörü insan	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta/Jambon' s F-12 50/50 Karışımı: 1X, L-Glutamin ve 15 mM HEPES	VWR uluslararası	45000-350
BD Falcon Yuvarlak Tabanlı Borular, Tek Kullanımlık, Polistiren, 12x75	VWR uluslararası	60819-295
Tripsin, %0.25 (1X) EDTA 4Na ile, sıvı	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter İPUÇLARI 300uL, 960 İPUÇLARI	Eppendorf	22491245
Tripsin İnhibitörü, Soya Fasulyesi, Saflaştırılmış	Worthington Biyokimyasal	LS003570
BD Falcon 40um Hücre Süzgeçleri	BD Biosciences	21008-949
Çok Kuyulu Plakalar, Polistiren, Greiner Bio-One, İşlenmemiş Plakalar, 6 kuyu	VWR uluslararası	82050-846
Marker Gen FACS Blue LacZ beta-Galaktosidaz Tespit Kiti	Marker Gen Teknolojileri	M0255