Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, In vitro Kinaz aktivitesinin LRRK2 assaying ve varsayılan yüzeyleri ve hastalığı LRRK2 potansiyel disfonksiyon fosforilasyon incelemek için deneysel bir sistem sağlayarak, mutant bir seçim açıklanmıştır.
Yöntem makalesi
LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro
Bu makalede
Özet
Özet
Lösin Zengin Tekrar Kinaz 2 (LRRK2) GTPaz etki alanı (Kompleks proteinlerin Ras, ROC olarak adlandırılır) ve bir kinaz 1 de dahil olmak üzere karmaşık, çoklu yapısını sahip proteinlerin ROCO ailesinin 2527 amino asit üyesidir. Parkinson hastalığı (PH) neden LRRK2 mutasyonlar 2004 yılında keşif normal işlevi, büyük bir araştırma hacmi odağı olmak LRRK2 sonuçlandı ve protein 2,3 hastalık durumu nasıl ters gider . LRRK2 fonksiyonu içine İlk incelemeler, enzimatik faaliyetleri 4-6 odaklandı. Mutasyonlar nedeniyle bu tutarlı bir değişiklik ortaya henüz net bir görüntü olmasına rağmen, gruplar bir dizi veri mutasyonlar 7,8 bağlantılı hücre ölümü LRRK2 kinaz aktivitesini önemini ön plana çıkarmıştır. Yeni yayınlar, anahtar bir deney aracı 9-11 LRRK2 kinaz aktivitesini hedef inhibitörleri bildirdin. Bu verilerin ışığında,LRRK2 enzimatik özellikleri Parkinson için potansiyel ilaç hedefleri olup olmadığı tartışmaya açık olmasına rağmen, bize bu proteinin biyoloji içine önemli bir pencere göze olduğu muhtemeldir.
Farklı yaklaşımların bir dizi tahlil LRRK2, kinaz aktivitesi için kullanılır olmuştur. Başlangıçta, yazı, memeli hücre hatları aşırı epitopu etiketli protein kullanılarak yapıldı ve deneyleri agaroz boncuk 4,5,7 immobilize bu proteini kullanarak yürütülen immunoprecipitated . Daha sonra, çözelti içinde LRRK2 rekombinant parçaları arıtılmış de örneğin LRRK2 12, 2527 artıkları 970 içeren böcek hücrelerinin arınmış bir GST etiketli parçası kullanılır olmuştur. Son zamanlarda, Daniels ve ark., Insan embriyonik böbrek hücreleri, çözüm, tam uzunlukta LRRK2 izolasyonu bildirdi, ancak bu proteinin 13 yaygın olarak kullanılabilir değil. Buna karşılık, GST füzyon LRRK2, şeklinde ticari availabl olduğunu kesilmişe (Invitrogen, ayrıntılı bilgi için bakınız tablo 1) ve LRRK2 kinaz aktivitesi gösteren bir tahlil için uygun bir araç sağlar. LRRK2 kinaz aktivitesi için birçok farklı çıkışları bildirilmiştir. Moesin içinde 558 treonin fosforilasyonu dayalı olarak adlandırılan LRRKtide - LRRK2 kendisi, yapay bir substrat genel bir kinaz substratı ve fosforilasyon gibi Miyelin Temel Protein (MBP) fosforilasyon otofosforilasyon kullanılmış olan, olası fizyolojik yüzeylerin bir dizi var α-sinüklein, Moesin ve 4-EBP 14-17. LRRK2 için substrat olarak bu proteinlerin durumu belirsizliğini koruyor ve aşağıda açıklandığı gibi protokol MBP kullanarak tahlil LRRK2 kinaz aktivitesini potansiyel yüzeylerin bir dizi yöneltilen bu sistemin yararı belirterek, genel bir substrat olarak durulacak.
Protokol
Güvenlik
Aşağıda açıklanan protokol, ATP LRRK2 kinaz aktivitesini takip γ fosfat pozisyonda radyoaktif 32 P etiketli kullanır . Bu laboratuvarda kullanılan standart protokollere dayalı ve jeller çalıştıran gibi süreç içinde birçok adımlar konusunda, batı, vesaire blot malzemeleri ve hassas koşullar ekipman ve protokolleri gibi bir rehber olarak kabul edilmelidir Bu süreçler için kullanılan laboratuvardan laboratuvara değişir. Iyonize radyasyonun yayarlar izotopları içeren bileşikler, insan sağlığı ve sıkı lisanslama ve düzenlemeler, kurumsal ve ulusal düzeyde kontrol kullanımı potansiyel olarak zararlı. Bu protokol deneyler (kılavuzlar ava üniversitede güvenlik servisleri tarafından sağlanan iyi laboratuvar uygulamaları kurallarına University College London, açık kaynak kodlu radyasyon kullanımı eğitim ve takip yapılmıştırilable http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). Açık kaynak kodlu radyasyon kullanımı, uygun eğitim ve düzenleyici onayı öncesinde teşebbüs edilmemelidir. Laboratuvar araştırma açık kaynak radyasyon sorumlu düzenleyici kurum, ülkeden ülkeye değişir. Bunlara örnek olarak: Birleşik Krallık, Amerika Birleşik Devletleri Sağlık ve Güvenlik İdaresi ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), Nükleer Düzenleme Komisyonu ( http:// www.nrc.gov / malzeme / miau / regs rehberleri-comm.html ), Kanada, Kanada Nükleer Güvenlik Komisyonu ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), ve Almanya Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / de / bfs ). Diğer ülkelerdeki kullanıcılar kendi radyasyon güvenlik görevlisi ile yerel kural, yönetmelik ve ruhsat otoriteleri teyit etmelidir. Bu protokol ile ilgili Güvenlik önlemleri, radyoaktif yonca sembolü (vurgulanır, metin içinde rastlanmıştır 
.)
1. Kinaz reaksiyonlar hazırlanması
Tüm tepkime radyoaktivite yayılmasını önlemek için bir O halka içeren, vidalı kapakları ile 1.5ml numune tüpleri hazırlanmıştır.
- Buz üzerinde çözülme protein LRRK2 yabani türü, D1994A, G2019S.
- - 10nm LRRK2 5ul 10x kinaz tampon, 0.5μg/μl MBP, su ile 50μl kadar yapılan buz üzerinde reaksiyon oluşturur.
2. Tahlil Koşu
32 P ATP kullanan tüm adımları p almalıbelirlenen radyasyon alanlarda dantel.
Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir - laboratuarımızda standart işletim prosedürü altında bu laboratuvar önlüğü, çift eldiven ve koruyucu gözlük.
32 P ATP içeren numuneler maruziyeti en aza indirmek için 6mm Perspex ekranlarında kullanıcılar korumalı olmalıdır.
Uygulanabilir, kişisel izleme cihazları kullanılmalıdır - UCL içinde, herhangi bir sertifikalı açık kaynak kodlu radyasyon kullanıcı deneyler sırasında radyasyona maruz kalma izlemek için bir film rozeti sahip olması gerekir.
Tüm deneysel yüzeyler gei kullanarak kullanımdan önce ve sonra radyoaktif kirlenme değerlendirilmelidirger sayacı.
Tüm potansiyel olarak kontamine sarf malzemeleri, radyoaktif atık bertarafı için kurumsal kurallarına sıkı sıkıya bağlı kalmanın bertaraf edilmelidir.
- Tahlil başlamadan önce, 30 ° C ve 100 ° C sırasıyla ısıtma bloklarını ayarlamak
- -20 Derin dondurucu (saklama koşulları fro 32 P ATP kullanılan radionucleotides tedarikçi veya türüne göre değişebileceğini unutmayın) 32 P ATP çıkarın. akrilik perde arkasına çözülme, kullanmadan önce kabın dışında tarama.
- Buz üzerinde reaksiyonlar, soğuk ATP 10μM ile birlikte her 32 P ATP 1μl ekleyin.
- Pipet yardımıyla iyice karıştırın. Darbe santrifüj kontaminasyon riskini en aza indirmek, dibine sıvı getirmek için.
- Sıfır zaman noktası bir 15μl kısım çıkarınd 100 4x SDS örnek tampon ve denatürasyon 5μl ek kısım reaksiyon ° C de 10 dakika sona erdirebilir. Darbe santrifüj kontaminasyon riskini en aza indirmek, dibine sıvı getirmek için.
- Kalan örnek ısıtma bloğu yerleştirilir ve 30 ° C'de 60 dakika inkübe edildi.
- 15μl 10 dakika 4x SDS örnek tampon ve denatürasyon 5μl Ayrıca tarafından sonlandırıldı 100 60 dakikalık bir zaman noktasında ve reaksiyon ° C kaldırıldı. Darbe santrifüj kontaminasyon riskini en aza indirmek, dibine sıvı getirmek için.
3. Örnekleri İmmünoblotting ve sonuçları analiz
- Örnekler SDS-PAGE çalıştırmak
- 10% 4-12 Bis-tris polyacrilamide jel elektroforezi için MOPS çalışan tampon kullanarak hazırlanmıştır.
- Her numunenin 20μl kavuz, 7μl birlikte jel yüklenirtain protein standart merdiven.
- Jel, 90 dakika için 160V çalışma veya boya ön jel sonuna ulaşıncaya kadar. Radyoizotoplar ile temas bölgesindeki tüm sıvı radyoaktif atık olarak tedavi ve kurumsal kılavuzların olarak başına bertaraf edilmelidir. Sıvı radyoaktif atık, bol su ile belirlenen radyoaktif bertaraf lavabolar aşağı dökerek atılmalıdır UCL düzenlemeleri devlet.
- Protein western blot ile PVDF membran aktarılır.
- Transfer tampon, 1x Tris Glycine artı% 20 Metanol hazırlanmıştır. PVDF Membran ve filtre kağıdı jel boyutu doğru kesilmiş ve membran veya filtre kağıdı durumunda transfer tampon ile ön ıslak durumda buzul metanol ile aktive. Membran yönelim tanımlanabilmesi için, tükenmez kalem mürekkebi ile önceden etiketli olmalıdır. Jel plast kaldırıldıic gövde ve fazla akrilamid kaldırılır ve radyoaktif atık olarak bertaraf.
- Membran ve jel arasındaki hava kabarcığı var olmasını sağlamak, jel, membran ve filtre kağıdı ile bir sandviç oluşturduğu ve daha sonra, jel ve anot arasındaki membran ile western blot aparatı düzenlenmiş olmalıdır.
- Transfer 16 saat için 25V gerçekleştirdi.
- Transfer tampon, 1x Tris Glycine artı% 20 Metanol hazırlanmıştır. PVDF Membran ve filtre kağıdı jel boyutu doğru kesilmiş ve membran veya filtre kağıdı durumunda transfer tampon ile ön ıslak durumda buzul metanol ile aktive. Membran yönelim tanımlanabilmesi için, tükenmez kalem mürekkebi ile önceden etiketli olmalıdır.
- PVDF protein Transferden sonra, membran, oda sıcaklığında kurutulmuş olmalıdır. Son olarak, kuru membran selüloz asetat sayfaları arasında izole ve fosfor ekran veya radyoaktif protein algılanmasına izin vermek için x-ray film maruz olmalıdır. Maruz kalma süresi, kullanılan radyoizotop ve reaksiyon enzim kinetiği spesifik aktiviteye bağlı olarak bir hafta boyunca birkaç saat çalıştırabilirsiniz.
- Phosphoscreen / film işlenmiş taradı. Fosfor ekran kullanıyorsanız, görüntü, film kullanılarak, daha sonra ortaya çıkan tran, yüksek çözünürlüklü TIFF veya bitmap dosyası olarak kaydedilmiş olmalıdırsparency, bir masaüstü tarayıcı kullanılarak taranmış ve yüksek çözünürlüklü TIFF veya bitmap dosyası olarak kaydedilmiş olmalıdır. ImageJ, ücretsiz bir programdır, Ulusal Sağlık web sitesi Enstitüleri (görüntü analiz edilebilir http://rsbweb.nih.gov/ij/) .
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 temsilcisi genel bir fosfat acceptor substrat olarak Miyelin Temel Protein ile yabani türü, G2019S ve D1994A LRRK2 kullanarak yürütülen bir tahlil sonuçlarını gösterir. LRRK2, otofosforilasyon görünür fosforile MBP 20-40kDa temsil eden birden çok bantları ile ≈ 200kDa görünür. D1994A (kinaz ölü) şeritte otofosforilasyon yokluğu ve G2019S mutasyon nedeniyle fosforilasyon arttı. Kinaz ölü şeritte MBP de artık fosforilasyon unutmayın. Bu D1994A mutant LRRK2 kinaz aktivitesini eksik ablasyon nedeniyle varlığı o ya da yansıtıyor olabilirf reaksiyon kinazlar kirlenmesine neden olan iz.
Şekil 1.
Tartışma
Bu kağıt, in vitro sistemi kullanarak LRRK2 kinaz aktivitesini assaying için temel bir protokol tanımlamaktadır . Kısalık çıkarlarını, bu genel bir substrat kullanarak bir saatlik bir bitiş noktası şablonu sınırlı, ama genel bir protokol potansiyel yüzeylerin bir dizi için geçerli ve LRRK2, kinaz aktivitesi kinetik inceleyerek daha sofistike analizler için uygun olan . Bu in vitro sistemde bu gibi bir protein kinaz davranışlarını incelemek için bir kullanmanın en önemli avantajlarından biri vurgulamaktadır: enzim ve substrat konsantrasyonları üzerinde tam bir kontrol olmadığı için, bu kinetik verileri oluşturmak ve K m hesaplamak mümkün reaksiyon ve V max değerleri. Daha detaylı kinetik değerlendirmeler ya da varsayılan inhibitörlerinin etkisinin değerlendirilmesi için, daha yüksek bir verim sistemi (Invitrogen edinilebilir LRRKtide substrat kullanarak sağladığı gibi) üstün bir alternatiburada açıklanan yaklaşım ve
Önemlidir, ancak, in vitro kinaz deneylerindeki tarafından sağlanan indirgemeci model sistem olduğunu kabul ama bir kinaz ve potansiyel substratları ile ilişkileri biyoloji incelemek için tek bir araç . Bu gibi testlerin verileri bir kinaz in vitro ve hücresel bir bağlamda nasıl davrandığını kapsamlı bir resmini elde etmek için diğer yaklaşımlar ile birlikte kullanılmalıdır. Örneğin, in vitro fosforile olası substrat sonra fonksiyonel incelemek için hedeflenen mutagenez (örneğin dönüştürme serin veya treonin fosfat alıcı gibi alanin hiçbiri phosphorylatable kalıntılarının artıkları) tarafından manipüle edilebilir phosphosites tanımlamak için kütle spektrometresi ile analiz edilmesi fosforilasyon ex vivo sonuçları.
Burada önemli olan nokta bu gibi bir in vitro test sisteminde verileri yorumlarken eithe olasılığır Tip I veya Tip II (yanlış pozitif veya yanlış negatif) hataları. Bu sistemin indirgemeci doğa, hem de ne yazık ki bulunmaktadır - eski durumda, saflaştırılmış bir olası substrat (hücresel ortamına göre) ve yapay yakın ve yüksek konsantrasyonda kinaz saflaştırılmış artefactual fosforilasyon olayları neden olabilir. Tersine, birçok kinazlar hücre kapsamında bir kompleksin bir parçası olarak işlev görür ve ortaya belirli bir substrat fosforilasyon için ko-faktörler gerektirir. Yukarıda da belirtildiği gibi, varsayılan bir substrat fosforilasyon olumlu bir sonuç in vitro test sisteminde kullanma sonucu doğrulamak için bir hücresel sistemin test edilmesi gerektiğini ve olumsuz bir sonuç dikkatli yorumlanması gerekir .
Bunun ışığında, ilgi kinaz aktivitesini karşılaştırmalı bir çalışma izin vermek için hem pozitif ve negatif kontrolleri mümkün nerede kritik. Olumlu bir contro dikkatli seçimil, olası substrat phosphorylate olası bir negatif kontrol ile birlikte, faiz protein doğru bilinen bir aktiviteye sahip, son derece değerli. LRRK2 Bir aday kontrolü LRRK2 kinaz etki alanına yakından ilgili birincil dizisi var ama çok farklı bir genel etki alanı yapısı, 18 kinaz 3, etkileşim Reseptör. Bu Invitrogen rekombinant protein olarak mevcuttur ve bizim laboratuvarda standart bir kontrol olarak kullanılır.
LRRK2 piyasada bulunan formu proteinin N-ucu yoksundur ve Glutatyon-s-transferaz ve bu protein kinaz deneyleri yaparken bu potansiyel bir karıştırıcı faktör olarak dikkate alınmalıdır tagged olduğunu da belirtmek gerekir Bilindiği gibi LRRK2 N-terminal, bu proteinin normal işlevini nasıl bir rol oynayabilir. Örneğin, protein yoktur LRRK2 N-terminal kısmı bu protokol,sonra bu gözlenen fosforilasyon üzerinde önemli bir etkisi olacak LRRK2 kinaz etki alanı için belirli bir substrat alımı için kritik in vitro sistemde substrat yukarıda açıklanan söyledi .
Ancak, bu uyarılar bile, Parkinson araştırma LRRK2 biyolojisi önem in vitro ortamda bu proteinin davranışı araştırmak için değerli bir araç olarak bu protokolü yararını vurgulamaktadır.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Yazar, Parkinson UK Araştırma Görevlisi (hibe F1002). Bu çalışma üyeleri Nöroloji UCL Enstitüsü, Sheffield Üniversitesi ve MRC Protein Fosforilasyon Birimi az Birleşik Krallık Parkinson Kullanıcı Hastalık Konsorsiyumu Nörodejenerasyon ödül Wellcome Trust / MRC Ortak Çağrı (WT089698) (UKPDC) tarafından kısmen desteklenen oldu Dundee Üniversitesi.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif | Şirket | Katalog Numarası | Yorum |
| LRRK2 vahşi tip | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinaz tampon | Hücre Sinyalizasyon | 9802S | |
| MBP | Sigma | M1891 | |
| 32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci / mMole |
| 4x LDS örnek tampon | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Protein standartları | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS tampon çalışan | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris akrilamid jel | Invitrogen | NP0321 | % 4-12 1mm 10well |
| PVDF membran | Millipore | IPVH00010 | |
| Transferi tampon | Invitrogen | NP0006 |
Tablo 1. Reaktifler
Damıtılmış ve de-iyonize su seyreltme tüm adımlar için kullanılan
| Ekipman tipi | Şirket | Yorum |
|---|---|---|
| Gayger sayacı | Mini Aletleri | |
| SDS PAGE tanker | Invitrogen | |
| Transferi tankı | Invitrogen | |
| Isı blokları (2) | Eppendorf | |
| Fosfor ekran | GE | X-ray film ikame edilebilir |
| Fosfor imager | GE | |
| Pozlama kaset | GE | |
| Santrifüj | Eppendorf | |
| Perspex koruyucu | ||
| 1.5ml tüpleri | VWR | O halkalı vida top |
Tablo 2. Ekipman
Kaynaklar
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
Yeniden basım ve izinler
