Zebra balığı embriyonik kalp immün yapmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Tüm montaj immün yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çok daha az işlem süresi içinde kalp hücre / hücre içi yapıları ortaya yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde sağlayan antikorlar, penetrasyon önemli ölçüde artırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün
Bu makalede
Özet
Özet
Zebra balığı embriyo kalp gelişimi ve avantajlı embriyoloji ve genetik 1,2 nedeniyle insan kalp hastalıkları eğitimi için in vivo omurgalı modeli popüler bir hale gelir. Hakkında 100-200 embriyolar tek bir yetişkin balık çifti her hafta hazır. Eski utero geliştiren şeffaf embriyolar kalp kusurları 3 değerlendirmek için ideal. Herhangi bir gen ifadesi morfolino teknoloji veya RNA enjeksiyon 4 üzerinden manipüle edilebilir . Ayrıca, ileri genetik ekranlar zaten cardiogenesis 5 farklı bakış açılarını etkileyen mutant bir liste yarattı.
Tüm montaj immün bu hayvan modelinde belli bir doku 6 hedeflenen protein ifade desenini ortaya çıkarmak için önemli bir tekniktir. Ancak, hücre içi veya hücre yapıları ortaya çıkarabilir yüksek çözünürlüklü görüntüleri, özellikle fiziksel locat nedeniyle olarak zor olmuşturkalp ve antikorların zayıf penetrasyon iyon.
Burada, ilk kalp diseksiyon ve sonra bir mikroskop lamı yüzey boyama işlemi yapan bu darboğazları gidermek için bir yöntem sunar. Küçük kalp örneklerinin kaybını önlemek için ve çözüm kullanımını kolaylaştırmak için, bir immEdge kalem ile çizilmiş mikroskop slaytlar yüzey üzerinde bir daire içinde kalp örnekleri kısıtlı. Boyama sonra, floresan sinyalleri doğrudan bir bileşik mikroskop ile gözlemlenebilir.
Embriyonik bir balık kalp sadece birkaç hücre tabakalarından oluşan antikorları için yeni bir yöntem, penetrasyon önemli ölçüde artırır. Sağlam kalpleri yüksek kaliteli görüntüler gün 2 gün 6 yaş Zebra balığı embriyolarının için çok daha alayı süre içinde elde edilebilir. Bizim metodumuz, potansiyel olarak diğer organlara ya da Zebra balığı veya diğer küçük hayvanlar disseke leke uzatılabilir.
Protokol
1. Slayt hazırlanması ve nemlendirilmiş odasına
- Nemlendirilmiş odası boşaltılmış bir ucu kutusu gibi bir kutu yapılabilir. Odası ve örnekleri ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kapağı sarın.
- Odanın içinde, kalbinde örnekleri kurumasını önlemek odanın içinde nem, korumak için bir yığın ıslak kağıt havlu koyun. Slaytlar için bir raf olarak kağıt havlu üstüne küçük bir mikroplak ayarlayın.
- Kalp 5x5 mm boyutunda numuneler için kuyu immEdge kalem kullanarak bir mikroskop lamı yüzeyinde ya çizgiler veya daire çizin. Slaytları kurumasını bekleyin.
- Nemlendirilmiş odasında slaytlar koyun ve her iyi 50ul taze% 4 formaldehit ekleyin.
2. Embriyonik kalp diseksiyonu
- Balık balık durdurmak vücut hareketleri kadar yaklaşık 1 dakika boyunca% 0.4 tricaine içeren E3 yumurta su 7 embriyo anestezisi ama yine de normal kalpdayak.
- Diseksiyon mikroskobu sahnede içbükey bir mikroskop lamı koyun. Concaved iyi embriyolar transfer.
- Kalp açıkça ortaya çıkarmak için diseksiyon mikroskop ışık kombinasyonu ayarlayın. Kişisel tercihinize bağlı olarak, bu karanlık alan veya DIC gibi polarize ışık durumu olabilir.
- Sonra kuru, iki insülin şırıngaları% 75 etanol ile temizleyin.
- Diseksiyon mikroskobu, kalp yüksek büyütme ve odak ayarlayın. Fiziksel kafasına yakın yumurta sarısı-hücre gruplarının sınır içine bir iğne ucu takarak bir embriyo düzeltin. Başka bir iğne yakın kalp bölgeye yerleştirin ve hızlı bir şekilde kalp çekin. Kalp embriyo tamamen ayrılmış değildir, kalp ve yumurta sarısı arasında kalan bağlı doku kesti.
- Mikroskop ayrılan kalp düşük büyütme ve odak ayarlayın. 10μl pipetteman kullanın ve 1μl hacim olarak ayarlayın. Çizin veya dokunmatik pipetteman ucu uygulaizole kalp içinde veya ucu yüzeye bağlı ya olacak, böylece kalp örnek.
- % 4 formaldehit hazırlanan slaytlar pipet ucu batırın ve çözüm kalp serbest pipetle piston bastırın. Su yüzey gerginliği de pipet çözüm kalp serbest bırakmak için yardımcı olur. Her kuyuda 3 kalpleri daha az koyun.
3. Immün
- Odasına kapatın ve yumuşak bir sallanan hareketi ile bir çalkalayıcı üzerine koydu. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kalp örnek sabitleyin.
- Slaytların arka su damlacıklarını ve tampon alışverişi için bir diseksiyon mikroskobu aşamasında slayt koymak.
- Her bir kuyunun boş bir bölgeye, bir 10μl pipetteman ucu batırın ve kalp örneklerinden ucu mümkün olduğunca tutmak. Çözüm ucu içine çekilir kalpleri su akışı ile hareket edebilir, ucuna takılı kalp önlemek için tedbirleri almak. DeğiştirmekGerekirse ucu yerelleştirme.
- Çözüm bir doku üzerine atın ve kalp örnek hava kabarcıklarının varlığı kolayca kayıp olduğundan uç kabarcıkları üreten kaçının. Kalp örnekleri kısa bir süre için kısmen kuru tutulması, kalpleri slaytlar bağlı kalmanıza yardımcı olabilir.
- Kalp örnek kapak ve 5 dakika boyunca yavaş bir sallanan hareketi nemlendirilmiş odasında inkübe 50μl PBST ekleyin. Durulama bir kez daha tekrarlayın. Bu adımdan sonra, kalp örnekleri nemlendirilmiş, 4 oda 1 haftaya kadar ° C saklanabilir
- PBST oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 10 oranında koyun serumu ile kalp örnek engelleyin.
- Β-katenin antikor 1:200 seyreltme ve mef2 spesifik antikor 1:200 seyreltme gibi birincil antikorlar, kalp örnek inkübe, oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 10 oranında koyun serumu / PBST.
- Oda sıcaklığında PBST üç defa (5 dk. Her biri) ile kalp örnek yıkayın.
- Ikincil örnek inkübePBST 0.5 saat alexa-etiketli anti-fare ve / veya anti-tavşan antikorları 1:1000 dilüsyon gibi antikorlar,.
- PBST üç kez kalp örnekleri ile yıkayın (5 dk.) Oda sıcaklığında.
4. Görüntüleme
- PBST çıkarın ve her bir kuyuya 10 ul montaj orta ekleyin. Çözelti berrak olana kadar birkaç dakika süreyle odasının Rock.
- Montaj orta çıkarın ve mikroskop kapağı cam (24x50) ile bir slayt tüm kuyuların kapağı.
- Zeiss Axioplan 2 mikroskop kullanarak balık kalp ApoTome (Carl Zeiss) ile donatılmıştır.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil tüm zebrafish kardiyomiyositlerde membran ve çekirdekler gösteren bir görüntü bir örnek gösterilmiştir. 1. mef2c ve β-katenin antikorları, disseke 52 hpf zebrafish embriyo kalp örnekleri leke birlikte kullanılmıştır. Iken mef2c antikor lekeleri kardiyomiyositlerinin çekirdekleri, β-kateninantikor her hücre 8-10 sınırında ortaya koymaktadır. Bileşik mikroskop sahne ayarlayarak, kalp örnekleri görüntüleri aynı yönde, dış eğrilik ve kalp 11 iç eğrilik gözlem sağlayacak şekilde ayarlanabilir. Toplam kardiyomiyosit numarası, kardiyomiyosit hücre boyutu ve dairesellik sonra ölçülebilir.
Şekil embriyonik bir kalbin sarkomerik yapısı ortaya başka bir örnek gösterilmiştir. 2. Biz bir disseke embriyonik kalp F59, miyozin antikor, immün yapıldı. Kalın filament çizgili bir bant, yüksek büyütme (Şekil 2) 6 açıklanacak, bütün bir embriyonik kalp myofibril ağ açıkça daha düşük büyütme açıklanacak.
Şekil 1 mef2 (kırmızı) ve β-katenin (yeşil) çekirdek ve outl göstermek için immünzebrafish ventrikül kardiyomiyositlerinin ines. Ölçek çubuğu = 10μm
Şekil 2 ya da düşük büyütme (A) veya daha yüksek büyütme (B) zebrafish ventrikül kalın filament göstermek için miyozin Immnostaining ölçekli bar = 10μm
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Klasik tüm montaj immün yöntemleri ile karşılaştırıldığında, yöntem, aşağıdaki avantajları vardır. Öncelikle, çok daha güçlü floresan sinyalleri sürekli olarak geliştirilmiş penetrasyon nedeniyle elde edilebilir. Tüm montaj immün yöntemi, kalp çevresindeki yoğun cilt dokusu, tüm vücut önemli ölçüde yüksek arka planda birçok antikor penetrasyon azalır. Bu sorun özellikle büyük embriyolar için 3 gün sonrası fertilizasyon (dpf) şiddetlidir. Disseke kalpleri aksine, sadece çok daha iyi bir penetrasyon render birkaç hücre ta...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz Beninio Jomok Zebra balığı yetiştiriciliği yaptığı yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü, HL81753 tarafından finanse edilmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifi Adı | Şirket | Katalog numarası | |
| tricaine | Araştırma organik | 3007T | |
| Formaldehit | Polysciences | 04018 | |
| Insülin enjektörü | Becton Dickinson | 329461 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Anti-β-katenin antikor | Sigma | C7207 | |
| Anti-Mef2c antikor | Santa Cruz Biotech | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-aktinin antikor | Sigma | A7811 | |
| Anti-Ilk antikor | Hücre içi sinyal | # 3862 | |
| Alexa Florlu 568 keçi anti-tavşan IgG td> | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa Florlu 488 keçi anti-fare IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Montaj orta floresan | Vektör | H-1200 | |
| ImmEdge kalem | Vektör | H-4000 | |
| Poli-L-Lysin kaplı slaytlar | Elektron mikroskobu bilimleri | 63410-01 | |
| Mikroskop kapak cam | Balıkçı | 12-543-D | |
| Concaved mikroskop kızakları | Balıkçı | 7-1305-8 | |
| Diseksiyon mikroskobu | Leica MZ95 | ||
| Bileşik mikroskop | Zeiss | Axioplan2 | |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
% 0.5 'lik Triton-X 100
400 mg Tricaine
97.9 ml GKD 2 O
2.1 mL (1M Tris pH9)
PH 7.0 'a ayarlayın
Kaynaklar
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
