Encapsulated Hücre Agregalar içinde Takip Hipoksik Sinyalizasyonu

Summary

Bir çapraz PEG hidrojel hücrelerin fotoğraf kapsülleme için bir yöntem açıklanmıştır. Kapsüllü fare İnsulinoma (MIN6) agrega içinde Hipoksik sinyal floresan marker sistemi kullanılarak izlenir. Bu sistem değişiklikleri ile hücre fenotipi hipoksik sinyal hidrojel iskele ve korelasyon içinde hücre seri muayene sağlar.

Abstract

Diabetes mellitus tip 1, insülin üretim kaybı ve potansiyel olarak öldürücü hiperglisemi, pankreas beta-hücrelerinin sonuçları otoimmün yıkım. Eksojen insülin enjeksiyonuna alternatif bir tedavi seçeneği olarak, fonksiyonel pankreatik doku nakli ^1,2 incelenmiştir. Bu yaklaşım, normoglycemia daha doğal, uzun vadeli bir restorasyon söz sunuyor. Konağın bağışıklık sistemi donör doku Koruma ret ve kapsülleme bu amaca ulaşmanıza yardımcı olmak için kullanılan bir yöntemdir önlemek için gereklidir.

Aljinat ³ ve agaroz ⁴ biyolojik olarak elde edilen malzemeler, kapsül yapımı için geleneksel bir seçim var ama inflamasyon veya fibrotik aşırı ^çoğalma 5 besin ve oksijen taşıma engel neden olabilir . Alternatif olarak, sentetik poli (etilen glikol) (PEG) bazlı hidrojel, yüksek saflıkta, kolayca Fonksiyonlu, olmayan onur kırıcıkontrol edilebilir gözenek büyüklüğüne sahip ve son derece ^6,7,8, biyouyumlu. PEG hidrojeller ek bir fayda olarak, fizyolojik olmayan sıcaklıklarda ^6,7 uygulama gerektirmez, basit bir fotoğraf crosslinking reaksiyon hızla oluşmuş olabilir . Böyle bir prosedür burada tanımlanmıştır. Crosslinking reaksiyon, photoinitiator UV bozulması, 1 - [4 - (2-metil)-fenil]-2-hidroksi-2-metil-1-propan-1-(Irgacure 2959), serbest radikaller üretir saldırı hangi zincir dimethacrylated PEG (PEGDM) indükleyici crosslinking vinil karbon-karbon çift bağları sona erer. Crosslinking 10 dakika içinde elde edilebilir. Olumlu hücreleri ^7,9 desteklemek için böyle bir şekilde inşa PEG hidrojeller gösterilen, düşük photoinitiator konsantrasyon ve kısa UV radyasyona ^maruz kalma, 10 kapsüllü bir doku canlılığı ve fonksiyonu için zararlı değildir. PEG yöntemi ile aşağıda açıklanan biz metakrilat iken, PEGDM dir.Basınçlı Sigma gibi sunucuları satın aldı.

Kapsülleme doğal bir sonucu vasküler bir ağ hücrelerin izolasyonu. Bu nedenle besin temini, özellikle oksijen azalır ve difüzyon ile sınırlıdır. Bu düşük oksijen kullanılabilirliği, özellikle insülin salgı ^işlevi 11-13 oksijen son derece bağımlı β-hücreleri etkileyebilir . Kapsül kompozisyon ve geometri için difüzyon oranları ve uzunlukları aynı zamanda oksijen etkisi olacaktır. Bu nedenle, biz de PEG kapsül içinde hipoksik hücrelerin belirlenmesi için kullanılan bir tekniktir açıklar. Rekombinant adenovirüs hücreleri Enfeksiyon, hücre içi hipoksi-indüklenebilir faktör (HIF) ^yollar 14 aktive edildiğinde bir floresan sinyali sağlar . HIFs hipoksiye transkripsiyonel yanıt birincil düzenleyiciler olarak, hipoksik sinyalizasyon ⁽¹⁵⁾ tespiti için ideal bir hedef işaretleyici temsil eder. Bu yaklaşım, Hypoxi kolay ve hızlı algılama sağlarc hücreleri. Kısaca, adenovirüs, hipoksi duyarlı bir unsuru (HRE) trimer kontrolü altında kırmızı floresan proteini (Clontech Ds Kırmızı DR) için sıra vardır. Düşük oksijen koşullarının HIF-1 stabilizasyonu floresan protein (Şekil 1) transkripsiyonunu sürücü olacaktır. Bu virüsün inşaat Ek ayrıntılar daha önce ¹⁵ olarak yayınlanmıştır . , Virüs -80% 10 gliserol saklanır ° C 3.4 x ¹⁰ 10 pfu / ml 'lik bir konsantrasyon 1,5 mL santrifüj tüplerine 150 mcL alikotları .

Laboratuarımızda Önceki çalışmalar, agrega,% 20 oksijen kültür 4 hafta boyunca canlılığını korumak MIN6 hücreleri kapsüllü göstermiştir. MIN6 2 kültüre agrega veya% 1 oranında oksijen etidyum bromür ile boyanarak yanı sıra% 20 oksijen hücrelere göre morfolojik değişiklikler nekrotik hücreler her iki işaretleri (% 85-90 hakkında hala canlı) gösterdi. Agrega,% 20 oranında görüntülenir pürüzsüz bir küre şeklini lost ve agrega hücrelerin düzensiz gruplar gibi göründü. Düşük oksijen stres canlılığı içinde belirgin bir düşüşe neden olmasa da, açıkça MIN6 agregasyonu ve glukoz ile uyarılmış insülin salgılanması ¹⁵ olarak ölçülen fonksiyonu etkiliyor. Kapsüllü hücrelerin% 20 ve% 1 oranında oksijen Western blot analizi de HIF-1α DsRed DR protein ekspresyonu ile ilişkilidir düşük oksijen şartlarında kültür hücreleri için önemli bir artış gösterdi.

Protocol

1. PEGDM sentezi ve fotoaktif PEGDM macromer çözeltisi

1. PEG 2g (lineer, 10.000 Da), sert plastik bir kap ile 40ml cam şişenin içine tartılır.
2. Metakrilik anhidrit yaklaşık 308μL ekleyin ve gevşek flakon kapağı.
3. Mikrodalga, standart bir ev mikrodalga 2 dakika için yüksek flakon. Giyim ısıya dayanıklı eldiven, ek bir 5 dakika sonra iyice girdap yüksek flakon, mikrodalga.
4. Kısaca flakon eldiven ile ele alınması için yeterli soğumaya izin verir. Şapkasını çıkarmak ve flakon dönen metilen klorür yavaş yavaş ekleyin. Çözüm gerektiği gibi örnek vorteks, berrak ve homojen görünmesi için yeterli ekleyin. 2 mL kullanılan metilen klorid toplam hacmi 1.5 olmalıdır.
5. 200 ml soğuk Çökelme PEGDM çözüm damla damla ekleyerek, dietil eter karıştırılır.
6. Vakum filtrasyon PEGDM toplayın ve kurutun.
7. Yeterli miktarda PEGDM çözülürdeiyonize su (genellikle 100 -150 mL).
8. 1000 Da molekül ağırlığı kesme ile 5 gün süreyle diyaliz tüp deiyonize suya karşı çözüm Dialyze. Su günde bir kez değiştirin.
9. -80 ° C gecede, uygun kaplarda ve donma içine çözüm kısım. Saflaştırılmış beyaz PEGDM toz verimi için 4 gün boyunca çözüm Lyophilize. 4 ° C kullanılmadığı zaman toz saklayın.
10. Fotoaktif PEGDM çözelti hazırlamak için, ilk deiyonize su Irgacure 2959 eriterek 0.5 kilo yüzde photoinitiator stok solüsyonu hazırlayın. Vorteks çözüm ve karanlık bir yerde saklayın.
11. 10 ağırlıkça% PEGDM ve Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) 0.025 ağırlıkça% Irgacure 2959 çözüm hazırlayın. Vortex iyice PEGDM dağılması sağlamak. Biz genellikle bir seferde bu çözeltinin 1ml hazırlamak.
12. 1.8 mL mikrosantrifüj tüpe 0,2 mikron şırınga filtresi aracılığıyla filtreleme çözümü sterilize edin. Alüminyum folyo ile tüp sarınve 4 mağaza ° C

2. Kültür, enfeksiyon, ve MIN6 hücrelerin agregasyon

1. 37 nemlendirilmiş bir ortamda% 10 FBS, 7mm şekeri, 100 adet / ml penisilin / streptomisin ve 0.5 mg / ml amphotercin B ° C ve% 5 CO ₂ ile desteklenmiş RPMI 1640 orta MIN6 hücreler kültür.
2. Tedavi edilen kültür flask yüzeyinden hücrelerin serbest bırakmak için, 37 ile hücreleri durulama, orta aspire ° C kalsiyum / magnezyum HBSS HBSS aspirat, daha sonra 2 ml 37 ° C tripsin-EDTA çözüm ekleyin ve hücreler izin 3 dakika inkübe edin.
3. Sıkıca ücretsiz hücrelerini vurmak için balonun yan kavanozu, daha sonra 8 ml 37 ° C orta ve şiddetle hücre süspansiyonu pipetle ve aşağı kabarcıklar tanıtmak için özen.
4. 15 ml steril bir santrifüj tüpü içine hücreleri Pipet ve bir hemasitometre ya da diğer hücre sayma işlemi kullanarak bir hücre sayımı gerçekleştirmek.
5. Yapıcı hücreleri enfekte etmek için hazırlanıyorvirüs, enfekte hücrelerin toplam sayısı ilk enfeksiyon istenen çokluğu (İçişleri Bakanlığı) (hücre başına 50 ila 100 enfeksiyöz partiküller) ulaşmak için gerekli olan virüs süspansiyonu hacmi belirlemek ve hesaplamak.
6. Dikkatle HBSS bir ön aliquoted hacmi 1.8 mL mikrosantrifüj tüp içine uygun miktarda virüs süspansiyonu pipeting HBSS virüs sulandırınız. HBSS toplayarak hücreleri de ortalama 50 mcL uygundur.
7. Pipetlemeyin 6-iyi bir süspansiyon kültür plakasına kuyulardan ortalama 400.000 hücre elde etmek için gerekli hacim kendi tüp içinde, sonra onları pipeting ve aşağı hücreleri tarafından dağılırlar.
8. İstenen İçişleri Bakanlığı ulaşmak için her kuyuya uygun seyreltilmiş virüs hacmi ekleyin.
9. Toplam hacmi 1.7 ml kadar getirmek için her biri iyi orta ekleyin.
10. Orbital çalkalamalı inkübatör içinde bir tabak yerleştirin. Orta nazikçe kuyular (~ 100 rpm) etrafında yıkar, böylece düşük bir ayarı çalkalayıcı ayarlayın. Aggrega için hücrelerin izin ver24-36 saat te. 75-175 mikron yaklaşık bir çapa sahip agregalar oluşturulmalıdır.

3. PEGDM hücreler, Encapsulation

1. Hücreler dispersiyonu (adım 2.4) ya da aşağıdaki toplama (adım 2.10) olarak kapsüllü olabilir. Hidrojel habercisi PEGDM çözümü bir sıvı olduğundan, hücreler crosslinking ve hidrojel oluşumu için önce çökmemesi için. Yerleşme büyük agrega gibi hızla ortaya çıkması bekleniyor ise, bu hücrelerin jel merkezi bir düzlemde yerleşmek böylece iki adımda hidrojel üretmek için yararlı olabilir. Dağınık hücreler için uygun bir adım hidrojel sentezi prosedür gösterilmiştir (Şekil 2) ve iki aşamalı bir prosedür de gösterilmiştir (3,2-3,9) (Şekil 3) ve aşağıda ayrıntılı.
2. Hidrojel 1 ml plastik şırınga kapalı sivri ucu kesme ve raf sonuna kadar açık yerleştirerek oluşturduğu olacağı bir gemi oluşturun.
3. Fotoaktif PEGDM pipetleyin 20 mcL böylecepiston üzerine şırınganın açık ucunu geçirdikleri evrim hacmi tüm piston yüzeyini kaplayan emin olun. Küçük artışlarla piston, düz bir sıvı yüzey elde etmek için ayarlayın.
4. Raf ve yaklaşık 8 dakika (365nm, ~ 7 mW / cm ^2), bir UV lamba altında raf hidrojel crosslinking için izin pozisyonu pipetlemeyin yerleştirin. Bu süre zarfında, hücrelerin hazırlık başlamış olabilir
5. 1.8 mL mikrosantrifüj tüpe pipetleyin istenilen sayıda hücre / agrega içeren bir ses, şapka ve 5 dakika boyunca 130 g tüp santrifüj.
6. Bir micropipettor kullanarak, tüpün ucunda hücre pelletini bozmadan özenle medya çıkarın. Medya kafa pelet yaklaşırken, bir ince kullanmak için 10 mcL pipetlemeyin ucu yararlı olabilir.
7. Fotoaktif PEGDM çözüm (agrega ile çalışıyorsanız, geniş ağızlı pipetlemeyin uç) 20 mcL yavaşça hücre pelletini tekrar süspansiyon ve inci üstüne enjektöre hücre süspansiyonue daha önce hidrojel kısmı çapraz bağlı.
8. Hidrojel inşaatı tamamlamak için ek bir 8 dakika UV ışık şırınga Açığa. Bittiğinde, hücrelerin tam silindirik (Şekil 3) hidrojel içinde kapsüllü olmalıdır.
9. Şırınga ve kısaca jel yıkamak için 24-iyi plaka iyi HBSS 1 mL içine hidrojel çıkarın. İstenen şartlar altında, 24 plaka ve kültürünün iyi medya 1 ml jel aktarın.

4. Hipoksi izleme

1. Herhangi bir noktada kültür, görüntü sırasında hücreler hipoksik sinyal başlaması izlemek için floresan mikroskobu kullanarak. Eğer çok iyi bir plaka görüntü ya da mikroskop aşamasında yerleştirmeden önce bir mikroskop lamı jel transfer görüntülü olmanın bağlı. Ds Kırmızı Tepe uyarma 556nm elde etti ve zirve emisyon 586nm oluşur. Emisyon oldukça yoğun olduğu ve böylece photobleaching bazı gözlemcilere olmamıştıred sorunlu olabilir. Protein üretimi ve ilk sinyali algılama başlangıcı arasındaki gecikme süresi yaklaşık 12 saattir. Sinyal bireysel sinyalizasyon hücreleri tanımlamak için yeterince spesifik, ancak çözünürlüğü, hücre içi sinyal localisation belirlemek için yetersiz olabilir. Sinyal hücreleri, sinyal genellikle sitoplazma boyunca eşit olarak görülmektedir. Sinyal yoğunluğu artmış protein ifadesi, genel protein birikimi, veya gecikmeli protein olgunlaşması nedeniyle henüz tam olarak belirlenmemiştir olsa da, hipoksi için uzun pozlama ile artırabilirsiniz.

5. Temsilcisi sonuçları

PEG hidrojel MIN6 agrega kapsüllü bir temsili örnek Şekil 4'te gösterilmiştir. Tepki gerçekleştirildiği geminin şeklini alarak, çapraz jel boyunca katı olacaktır. Implantasyon yabancı bir cisim yeniden önlenmesinde yardım etmek için pürüzsüz bir dış yüzeye sahip bir jel tercih ediliryanıtlarının yokluğu. Jel içinde, hücre agrega matris tamamen kapalı ve homojen, daha iyi besin taşınması için izin dağıtılmış olmalıdır.

Şekil 5 MIN6 agrega hipoksik sinyalizasyon Temsilcisi görüntüler resmedilmiştir. Görüntü yakalama önce marker virüsü ile enfekte Özdeş MIN6 agrega,% 20 _O 2 (5a) veya% 1 _{O 2} (5b) 44 saat süreyle ya kültüre edildi .

Şekil 1 bizim hipoksi marker sisteminin etkinliği şematik. Ds Kırmızı DR gen ve upstream HRE organizatörü adenoviral ekleme hipoksinin neden olduğu HIF-1 kontrolü altında floresan protein üretimi için izin verir.

Şekil 2 tek adım kapsülleme Usul akış şeması bir cr MIN6 hücrelerinin dağınıkosslinked PEGDM hidrojel. Her jel için, dağınık hücrelerin fotoaktif PEGDM macromer çözüm 40μL askıya alınır. Bu bir dekapite 1mL şırınga yerleştirilir ve hidrojel, 10-12 dakika sonra 365nm UV ışık altında oluşur. Tamamlandığında, hidrojel disk, enjektörden çıkarılır, yıkanır ve kuluçka için bir orta dolu bir plaka yerleştirilir.

Şekil 3, çapraz PEGDM hidrojel toplu MIN6 hücrelerinin çift adım kapsülleme Usul akış şeması . Her jel için, bir yarı-jel ilk 8 dakika fotoaktif PEGDM macromer çözüm 20μL UV crosslinking oluşur. MIN6 agrega dikkatle öncesi kurulan yarı-jel üstünde eklenir fotoaktif macromer çözüm ek bir 20μL askıya alınır. Tam jel tam medial kapsüllü agrega ile UV ışınlarına maruz kalma ek bir 8 dakika oluşurjel düzlem.

Şekil 4. 20X büyütme altında 40μL hidrojel Image. MIN6 agrega (~ 400.000 toplam hücreleri) jel içinde açıkça görülür. Hidrojel çapı yaklaşık 6mm (bar = 1mm).

Şekil 5 Floresan hipoksi PEGDM hidrojel toplu MIN6 hücreleri sinyal. 44 saat boyunca% 20 O ₂ kapsüllü ve sonra kuluçka yerleştirilen hücreler% 2 O ₂ 44 saat süreyle inkübe sonra kapsüllü hücreler açık, her yerde sinyal ekran hipoksi sinyalizasyon (a) gösterilecek. (Bar = 100μm) (b).

Discussion

Burada sunulan yöntem, fizyolojik olmayan koşullarda minimum kullanımı ile PEG hidrojel hücre kapsülleme için hızlı ve basit bir yöntem sunuyor. PEG biyouyumluluk ve modifikasyon kolaylığı için çok yararlı kapsülleme malzemesi temsil eder. Basit farklılıklar fotoaktif çözüm PEG yüzdesi, örneğin, gözenek boyutu ile mekanik basınç modülü gibi özellikleri, ve taşınım özellikleri ayarlamak için kullanılır. Ayrıca, PEG yan zincirler ilavesi ile kolayca değiştirilebilir. PEG hidrojeller, bu nedenle, gelecek vaat eden bir klinik cihaz ve in vitro araştırma için esnek bir platform temsil

PEG-kapsüllü hücreleri hipoksi izleme için bir yöntem de sunulmuştur. Bu yöntem, hipoksi algılama basitliği ve ilgi hücreleri feda etmeye gerek önlemek için yararlıdır. Teknik koşulları, bize çeşitli hücre tiplerinin çeşitli uygulanabilirgeniş efulness. Örneğin, kök hücre farklılaşması için bir işaret olarak hipoksi, kök hücre Micromass kültürlerde takip edilebilir. Ancak, bu yöntem sadece hücreleri daha sonra toplanmış dağınık olan hücre sistemleri veya sistem dağıtmak için uygulanabilir. Ayrıca, floresan sinyal algılama, büyük ya da yoğun dokularda zor olabilir.

Materials

Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı
PEG	Sigma-Aldrich	309.028-500G
Metakrilik Anhidrit	Sigma-Aldrich	276.685-100ML
Mikrodalga	Emerson	MW8784SB
Vortexer	Bilimsel Sanayi	SI-A236
Metilen Klorür	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Dietil eter	Sigma-Aldrich	346.136-1L
Diyaliz Boru	Spektrum	132640
	Laboratuvarlar
Derin dondurucu
Lyophilizer	Labconco	7670521
Vakum pompası	Şartları yerine getirmemek	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21-022-CV
Şırınga Filtre	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	* Özel formülasyonu
FBS	PAA Laboratuvarları	A15-351
Penisilin-Streptomisin	Mediatech	30-002-CI
Amfoterisin B	Mediatech	30-003-CF
Kuvöz	Thermo Scientific	3597	NAPCO Serisi 8000 WJ w / O2 bastırma
Tripsin EDTA	Mediatech	25-052-CI
Orbital Çalkalayıcı	VWR	12620-926
UV Lambası	Sanyo Denri	FLR40SBLB / M	İki 40W, 365nm BlackLight mavi UV ampulleri tutan
Santrifüj	Eppendorf	5811 000.010 *	* Sipariş numarası. Model 5810 R
Mikroskop	Nikon	TI-ND6-PFS	556nm uyarma / 586nm emisyonu filterset ile