Method Article

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

DOI:

10.3791/3599

⸱

May 27th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, UMR 631, Parc scientifique de Luminy, 2Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6102, Parc scientifique de Luminy, 3Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Aix-Marseille University, 4École Centrale Marseille, Technopôle de Château-Gombert, 5Institut Fresnel, Aix-Marseille University, 6Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6133, Aix-Marseille University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoklu Hedef İzleme canlı hücrelerinin plazma membranı içinde ayrı ayrı işaretli moleküllerin izlenmesi için geliştirilen ev yapımı bir algoritma. Verimli, tespit nano ölçekli membran dinamiğini incelemek için kullanıcı dostu, kapsamlı bir araç sağlamak, yüksek yoğunluklu zaman içinde moleküller tahmin ve izleme.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amacımız farklı biyolojik fonksiyonları hücre zarının meydana gelen moleküler süreçlerin kapsamlı bir açıklaması elde etmektir. Çoklu Hedef İzleme (MTT) 1: Biz yüksek yoğunlukta Tek Parçacık Takibi (SPT) adanmış analitik araçları geliştirerek, tek-molekül düzeyinde karmaşık organizasyon ve plazma zarı dinamikleri karakterize hedefliyoruz. Milisaniye ve nanometrik 1-11 çözünürlük sunan tek-molekül videomicroscopy, doğru, hücre reseptörlerine lokalizasyonu, mobilite, tutuklama veya etkileşimleri gibi tanımlayıcılar eşleyerek membran organizasyonu 12-14 ayrıntılı bir temsilini sağlar.

Biz hem deneysel hem de algoritmik, SPT gözden. Deneysel açıdan moleküler dinamik dinamik bir anlık sağlamak için, mümkün olan en yüksek etiketleme yoğunluğu ulaşan özel bir vurgu ile, kurulum ve hücre etiketleme optimize dahilHepsi bu zarının içinde oluşur. Tepe algılama, tahmin ve yeniden bağlanma, görüntü analiz 15,16 belirli araçları tarafından ele: Algoritmik sorunları yörüngeleri yeniden inşası için kullanılan her adımı ilgili. Algılama sonra deflasyon Uygulama tahlisiye zirveleri başlangıçta komşu, güçlü zirveleri tarafından gizli sağlar. Not olarak, algılama geliştirerek doğrudan yörüngeleri içindeki boşlukları azaltarak, yeniden bağlanma etkiler. Performans genellikle yüksek zamanmekansal çözünürlükte paralel ölçümleri için iki büyük sınırlama temsil eden çeşitli etiketleme yoğunluğu ve gürültü değerleri, Monte-Carlo simülasyonları kullanılarak değerlendirilmiştir.

Photoswitching veya non-lineer optik on / off ya arda kullanarak, tek moleküllerin için elde edilen nanometrik doğruluk 17, ayrıntılı gözlemler sunabilirsiniz. Bu tür 17 STORM 18, PALM 19,20, 21 ya da RESOLFT 22,23 STED, WHI olarak nanoscopy yöntemlerin temelich genellikle görüntüleme sabit örnekleri gerektirebilir. Merkezi görevi tek moleküllerin kaynaklanan kırınım-sınırlı pik tespit ve tahmin edilmesidir. Bu yüzden böyle Brown hareketi yerine sürekli bir pozisyon hassasiyetini ele almak gibi yeterli varsayımlar sağlayarak, MTT ve sade bir dille Ortaölçek analizleri için uygundur. Dahası, MTT temelde herhangi bir ölçekte kullanılabilir: moleküller için değil, aynı zamanda hücreleri veya hayvanlar için değil, sadece örnek olarak sayılabilir. Bu nedenle, MTT, moleküler ve hücresel ölçeklerde uygulamaları bulur güçlü bir izleme algoritması olduğunu.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu videoda, belirli bir membran reseptör hedefleyen kuantum noktaları kullanarak, tam bir tek parçacık izleme deneyi sunuyoruz. Bu deneyin temel amacı canlı hücrelerin plazma zarının içinde ölçülen moleküler difüzyon davranışları ayırt farklı tipte oluşur. Gerçekten de, membran ortaya çıkan moleküler hareketleri genellikle doğrusal olarak yönlendirilmiş veya örneğin nanodomains 26-29, içinde sınırlı kalarak Brownian difüzyon sapabilir. Biz canlı bir hücre zarı içinde meydana dinamikleri ortaya çıkan çeşitli bir anlık sağlamak için, aynı zamanda teknik olarak mümkün olduğunca çok sayıda reseptör olarak takip hedefliyoruz. Bu, nihai olarak hücre yüzey resept....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek parçacık izleme, hücre ve mikroskop yönleri yanında, analiz çalışmalarının önemli bir bölümünü temsil eder. , Tespit tahmin ve her kare üzerinde zirve reconnecting: Bu üç ana görevleri gerçekleştirmek için kullanılan algoritma giderir. Ama bu işin sonucu yönü son, ekstra adımlar (örneğin, hareket tarzları, etkileşimleri veya stokiyometri deşifre gibi) için aslında herhangi bir yeni özel soruşturma için adapte edilmesi gerekebilir algoritması kendisi, tertipleyerek bulunur.

Ancak, bir kez.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onların destek ve verimli tartışmalar için, ekibimizin üyeleri, teknik yardım için özellikle MC Blache yanı sıra M Irla ve B Imhof teşekkür ederiz. Deflasyon ve lohusalık ile ilgili rakamlar Doğa Yöntemleri izniyle çoğaltılamaz. Bu proje, CNRS, İNSERM ve Marseille Üniversitesi, ve Région Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Kanser, Agence Nationale de la Recherche (belirli hibe tarafından kurumsal hibelerle desteklenmektedir ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 blan 1214 01) ve Fondation pour la Recherche medicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR Ligue Nationale Contre le Kanser bir burs ile desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Şirket Katalog numarası Miktar
COS-7 hücre hattı ATCC CRL-1651 5.000 hücreler / kuyu
Ca 2 olmadan HBSS + GIBCO 14175 1 ml
% 0.05 Tripsin EDTA GIBCO 25300 1 ml
Lab-Tek 8-iyi Nunc 155441 1
QDot-605 streptavidin Invitrogen Q10101MP 20 mM
Tinile Fab (Fab sentezi için, referans 21)
MAb 108 den Fab ATCC HB-9764 200 mikrogram
NHS-Biotin Thermo Scientific 21435 18.5 mikrogram
Orta tamamlayın
DMEM GIBCO 41965 500 ml
Sığır fetüs serumu SIGMA F7524 50 ml
L-Glutamine GIBCO 25030 5 ml
HEPES GIBCO 15630 5 ml
Sodyum piruvat GIBCO 11360 5 ml
Görüntüleme orta
Ca 2 ile HBSS + GIBCO 14025 25 ml
HEPES GIBCO 15630 250 ul

1 "> Ekipman Şirket Referans Inverted mikroskop Nikon Eclipse TE2000U Floresan lambası Nikon Intensilight C-HGFIE 1.3 NA 100x objektif Nikon Fluor 1.30 planlayın 1.49 NA 100x objektif Nikon APO TIRF 1.49 Kamera Roper Bilimsel Cascade 512 B Termostatlı kutusu Yaşam Görüntüleme Hizmetleri Kutu

Ek: MTT ek analiz örneği script

fonksiyonu MTT_example (file_name)
MTT çıkış sonuçlarını nasıl kurtarılacağını gösteren%%% Temel örnekleri
%%% Her trac çizmek içine ve histogram oluşturmak için
Floresans yoğunluğu%%%

nargin <% 1 eğer hiç file_name sağlanmaktadır?
Dosyaları = dir ('* stk.');
Boşsa (dosya), disp ('simdiki veri yok'), dönüş, sonu ise
. file_name = dosya (1) adı;% varsayılan: İlk stk dosyası
disp (['varsayılan' file_name 'kullanarak'])
son

file_param = [file_name '_tab_param.dat'];% çıktı dosyası

%% Yük verileri
versiyonuna göre bir CD ('output23')% veya ('output22'), kullanılan
% Yasal Uyarı: sürüm 2.2, sadece 7 parametre üretir
% Ekstra bir parametre, gürültü, sürüm 2.3 'de eklendi

Tek bir tabloda, aynı anda tüm parametreleri okumak için%
% Tab_param = fread_all_param (file_param);
% Tab_i = tab_param (02:08: sonunda :); tab_j = ...

Ayrı tablolarda tüm parametreleri (frame_number hariç) okumak için%
% [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param);

tab_i = fread_data_spt (file_param, 3); eser sayısı ve kare sayısı, bilgilendirici olmayan, atılır, çünkü% dizini 3'tür!
tab_j = fread_data_spt (file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8);

Iz üzerinden%% Döngü
N_traces = boyut (tab_i, 1);
% Tablolar N_frames kolon tarafından N_traces hatları

N_traces: ITRC = 1 için
No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)> 0; sadece% dışı yanıp adımları
arsa (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index))
& Nbsp; xlabel ('i (piksel)'), ylabel ('j (piksel)')
başlık (['iz #' num2str (ITRC)])
disp ('sonraki izleme için herhangi bir tuşa grev Lütfen'), duraklatma
son

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum (tab_blk (:)> 0);% dışı yanıp adımlar yalnızca
2sqrt (N) kutuları kullanılarak geçmiş (tab_alpha (tab_blk> 0), 2 * sqrt (N_datapoints))%
xlabel ('yoğunluğu (au)'), ylabel ('olay')
title ('parçacıkların floresans şiddetinin histogram')

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
  2. Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiple Target TracingSingle Particle TrackingEpidermal Growth Factor ReceptorQuantum Dot LabelingHigh Density ImagingTrajectory ReconstructionPeak DetectionDeflation AlgorithmTransient Confinement AnalysisMonte Carlo Simulations

Related Articles