Method Article

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

DOI:

10.3791/3599

⸱

May 27th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, UMR 631, Parc scientifique de Luminy, 2Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6102, Parc scientifique de Luminy, 3Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Aix-Marseille University, 4École Centrale Marseille, Technopôle de Château-Gombert, 5Institut Fresnel, Aix-Marseille University, 6Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6133, Aix-Marseille University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoklu Hedef İzleme canlı hücrelerinin plazma membranı içinde ayrı ayrı işaretli moleküllerin izlenmesi için geliştirilen ev yapımı bir algoritma. Verimli, tespit nano ölçekli membran dinamiğini incelemek için kullanıcı dostu, kapsamlı bir araç sağlamak, yüksek yoğunluklu zaman içinde moleküller tahmin ve izleme.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amacımız farklı biyolojik fonksiyonları hücre zarının meydana gelen moleküler süreçlerin kapsamlı bir açıklaması elde etmektir. Çoklu Hedef İzleme (MTT) 1: Biz yüksek yoğunlukta Tek Parçacık Takibi (SPT) adanmış analitik araçları geliştirerek, tek-molekül düzeyinde karmaşık organizasyon ve plazma zarı dinamikleri karakterize hedefliyoruz. Milisaniye ve nanometrik 1-11 çözünürlük sunan tek-molekül videomicroscopy, doğru, hücre reseptörlerine lokalizasyonu, mobilite, tutuklama veya etkileşimleri gibi tanımlayıcılar eşleyerek membran organizasyonu 12-14 ayrıntılı bir temsilini sağlar.

Biz hem deneysel hem de algoritmik, SPT gözden. Deneysel açıdan moleküler dinamik dinamik bir anlık sağlamak için, mümkün olan en yüksek etiketleme yoğunluğu ulaşan özel bir vurgu ile, kurulum ve hücre etiketleme optimize dahilHepsi bu zarının içinde oluşur. Tepe algılama, tahmin ve yeniden bağlanma, görüntü analiz 15,16 belirli araçları tarafından ele: Algoritmik sorunları yörüngeleri yeniden inşası için kullanılan her adımı ilgili. Algılama sonra deflasyon Uygulama tahlisiye zirveleri başlangıçta komşu, güçlü zirveleri tarafından gizli sağlar. Not olarak, algılama geliştirerek doğrudan yörüngeleri içindeki boşlukları azaltarak, yeniden bağlanma etkiler. Performans genellikle yüksek zamanmekansal çözünürlükte paralel ölçümleri için iki büyük sınırlama temsil eden çeşitli etiketleme yoğunluğu ve gürültü değerleri, Monte-Carlo simülasyonları kullanılarak değerlendirilmiştir.

Photoswitching veya non-lineer optik on / off ya arda kullanarak, tek moleküllerin için elde edilen nanometrik doğruluk 17, ayrıntılı gözlemler sunabilirsiniz. Bu tür 17 STORM 18, PALM 19,20, 21 ya da RESOLFT 22,23 STED, WHI olarak nanoscopy yöntemlerin temelich genellikle görüntüleme sabit örnekleri gerektirebilir. Merkezi görevi tek moleküllerin kaynaklanan kırınım-sınırlı pik tespit ve tahmin edilmesidir. Bu yüzden böyle Brown hareketi yerine sürekli bir pozisyon hassasiyetini ele almak gibi yeterli varsayımlar sağlayarak, MTT ve sade bir dille Ortaölçek analizleri için uygundur. Dahası, MTT temelde herhangi bir ölçekte kullanılabilir: moleküller için değil, aynı zamanda hücreleri veya hayvanlar için değil, sadece örnek olarak sayılabilir. Bu nedenle, MTT, moleküler ve hücresel ölçeklerde uygulamaları bulur güçlü bir izleme algoritması olduğunu.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu videoda, belirli bir membran reseptör hedefleyen kuantum noktaları kullanarak, tam bir tek parçacık izleme deneyi sunuyoruz. Bu deneyin temel amacı canlı hücrelerin plazma zarının içinde ölçülen moleküler difüzyon davranışları ayırt farklı tipte oluşur. Gerçekten de, membran ortaya çıkan moleküler hareketleri genellikle doğrusal olarak yönlendirilmiş veya örneğin nanodomains 26-29, içinde sınırlı kalarak Brownian difüzyon sapabilir. Biz canlı bir hücre zarı içinde meydana dinamikleri ortaya çıkan çeşitli bir anlık sağlamak için, aynı zamanda teknik olarak mümkün olduğunca çok sayıda reseptör olarak takip hedefliyoruz. Bu, nihai olarak hücre yüzey reseptörü sinyalleşme düzenleyen mekanizmalarının deşifre izin beklenmektedir.

1. Hücre Kültürü

  1. Hücresel örnek hazırlayın: endojen epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) 30 ifade yapışık COS-7 hücreleri kullanır. Ne zamanantibiyotik hazırlanması sırasında her zaman uygun steril teknikleri kullanarak herhangi bir gizli alt saptanabilir kirlenme var emin olmadan canlı hücreleri ile çalışıyor.
  2. Bunların sahip özen,% 7 CO 2 ile 37 ° C 'de, tam bir ortam (% 10 buzağı serumu ile DMEM,% 1 glutamin,% 1 HEPES ve% 1 sodyum piruvat, aşağıda özel reaktiflerin tablosu bakınız) hücre büyümesi Lab-Tek onları yayılmadan önce alt birleşmiş, üstel büyüme.
  3. Gün deneyden önce, 8-kuyu odaları (Lab-Tek) in / de 5.000 hücreleri yayılmış ve bir gece inkübe edin. Hücrelerin sayılması, hücre başına kuantum nokta tekrarlanabilir bir oranı böylece sabit bir hücre yoğunluğu sağlar.

2. Hücre Etiketleme

Özel bir kaplama ile kuantum noktalar hazırlayın. Kuantum-nokta yarıiletkenler oluşan floresan nanopartiküller vardır. Onlar klasik kıyasla çok parlak ve ışığa, çünkü bu nanopartiküller yüksek bir faiz sunmaktek bir molekül görüntüleme için gürültü oranı (SNR) için uygun bir sinyal başarı sağlayan floresan probların 31,32.

  1. Daha önce tarif edildiği gibi 21 deneyden önce, papain ile sindirim, hibridom hücre çizgisinden (mAb 108, ATCC HB-9764) gelen EGFR karşı Fab parçaları üretir.
  2. Konjuge biotin ile Fab, üreticinin talimatlarına (EZ-link sülfo-NHS-LC-biyotinilasyon Kiti; Thermo Scientific, Şekil 1A.) Başı olarak.
  3. 605 nm (hücresel otofloresans gelen parlaklık, algılama ve ayrılması için en uygun emisyon dalga boyu) streptavidin (Invitrogen) ve yayan ile fonksiyonelleştirilmiş kuantum nokta kullanın.
  4. Kuantum nokta çevresinde Mevcut streptavidins yanı sıra, toplama ve hücrelere ve coverslip üzere spesifik olmayan bağlanma önlemek için doyurmak üzere, (spesifik reaktiflerin tablosu) tam medyum içinde etiketleme çözeltisi hazırlayın.
  5. Iki ara çözümler hazırlayın:Kuantum-nokta-streptavidin biyotinile Fab ile başka biri, 20 nM her ile bir.
  6. Bu iki çözüm eşit hacimde bir karıştırın: kuantum nokta kompleksi: 10 nM Fab son bir çalışma konsantrasyonunu elde etmek için 1:1 oranında Fab ile kuantum noktalar karıştırın. Eşmolar bir oranı kullanılarak bir kuantum-noktalı ve bir biyotinile Fab parçası oluşan mono-fonksiyonlu kompleksleri oluşumu birleştirmektedir. Bu reseptör 33,34 çapraz bağ nedeniyle artifakı gözlemler sınırlayıcı monovalan, etiketleme yanadır.
  7. Agregasyonunu önlemek için dakikada 1200 dönüş bir çalkalayıcı kullanarak, 25 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Karışımı canlı hücreler üzerinde kullanıma hazırdır.
  8. 7% CO 2 ile 37 ° C de 5 dakika için karışımın 100 ul hücre inkübe.
  9. Olmayan autofluorescent görüntüleme ortamı (HBSS tampon,% 1 HEPES, özel reaktiflerin tabloya bakınız) 37 önceden ısıtılmış ° C hücreleri yıkayın
  10. Dikkatle un önlemek için etiket aşırı kaldırmakGerekli geniş görüntüleme ortamı, son yıkama önce en az 5 dakika gecikme ile oda sıcaklığında tipik olarak 5 kez, her iyi yıkayarak, odak dışında kuantum nokta, ilişkisiz tarafından SNR bozulmadan.

3. Optik Ayarı

Video-mikroskopi kurulum dört ana bölümden oluşmaktadır:

  1. Belirli bir floresan küp (FF01-457/50 uyarma, FF495-DI02 dikroik ve FF01-617/73 emisyon filtreleri, Semrock) ve yüksek sayısal açıklık (1.3 veya 1.49) yağ immersiyon 100x amacı ile bir inverted mikroskop.
  2. A 100 W civa lambası (termoregülasyon engel kaçınarak, bir fiber optik aracılığıyla mikroskop akuple).
  3. Bir 512 x 512 piksel yüksek hassasiyeti yeterli SNR ulaşmak için kamera EMCCD.
  4. Deney süresince 37 ° C'de biyolojik örnekler tutmak için bir kuluçka.

4. Edinme

  1. Izole ve iyi yayılmış hücreleri seçin. Buiyi membran moleküllerini düzlemsel hareket aramak için adapte güzel, düz lamellipodia, uzatılması yanadır.
  2. Iletilen ışık ve floresan hem de görünüşü ile hücresel fizyolojik durumunu değerlendirin: yoğun veziküler trafik, nekrotik ya da apoptotik işaretler, düşük otofloresans ve ortalama güçlü kuantum nokta etiketleme (genellikle hücre başına en fazla 1.000 kuantum nokta olmaması, bkz Şek. 1B, C).
  3. Aynı anda mümkün olduğunca çok reseptörleri izlenmesi için kritik bir yüksek etiketleme yoğunluğu seçin. Bu aslında her ikisi tarafından fizyolojik (yüzey ekspresyonu, epitop erişilebilirlik, yanal hareket) ve algoritmik parametreleri (örtüşmeyen noktadan yayılan fonksiyonları (PSF), hatta uygun algılama ve yeniden bağlanma izin vermek için, hareket nedeniyle hesap bulanıklık dikkate alınarak). Sınırlıdır
  4. Her hücre, önce daha fazla, hücre yönü kontrol izin veren bir aydınlık alan görüntüsü (varsa tercihen, DIC kullanarak) eldeve lamellipodia mekansal sınırları.
  5. Bu sözleşmeler ile bu yana, dic adlı bir alt klasörde, video-yığını (örneğin örneğin cell1.tif & cell1.stk gibi) aynı ismi kullanarak bu görüntüyü kaydet, algoritma otomatik olarak eşleşen görüntüyü bulabilirsiniz Her yığını.
  6. Tipik olarak 36-ms oranı, bu fotoğraf makinesi ile full frame ulaşılabilir en hızlı oranda, sürekli hücre başına 1 ila 3 videoları edinin. Ancak bir artmış duyarlılık ve / veya daha az piksel ile özel CCD kullanarak, yukarı 1-ms oranı, yüksek frekanslarda edinebilirler. Çerçeve aktarım teknolojisi kareler arasında ihmal edilebilir bir gecikme sağlar.
  7. Elektron çarpma geliştirme her zaman, en az 20 dB (verimli doruk tespit 1) Yukarıda, yeterli SNR, tipik olarak yaklaşık 25-30 dB tek bir molekül hassasiyeti ulaşmasını sağlamak için azami (sadece doygunluk altında, ilgili ise) olarak ayarlanmalıdır.
  8. Genellikle video, günah başına 300 kare eldece yörüngeleri çoğunlukla uzun yanıp sönen olayları ile sınırlı ortalama ~ 100 kare üzerinde yeniden inşa edilir. Video frekansı ve uzunluğu, örneğin daha uzun izleri gerektirebilir verilen bir ölçüsüdür için adapte edilebilir.

5.. MTT Analizi

  1. Matlab veya Octave verilen bir veri kümesi değerlendirmek video dosyalarını içeren dizinin yolunu seçin.
  2. Tam automatized analiz 1,35 başlatmak için, Matlab Octave, ya MTT23i, komut detect_reconnex23 yazın. Bu program "kullanıcı arayüzü ile, sürüm 2.3" anlamına gelir ve 2.2 önceki sürümü ile birlikte yüklenebilir. Şek olarak ilk olarak, kullanılan tüm parametreleri listeleyen bir grafik ara gösterir. 2.

6. Temsilcisi Sonuçlar

MTT otomatik olarak daha da tamamlanan tespit ve tahmin hedeflerinin izleri, teslim etmek, her kaydedici video analizgibi kapatılma algılama gibi vestigations. Bu sonuçta hücre görüntüleri (Şekil 1C & 3) üzerinden haritalama izleri sağlar.

MTT Açıklama

Çekirdek MTT analizi 3 ana görevleri (Şekil 3) çağırarak, her kare üzerinde gerçekleştirilir:

  1. Sürgülü iki hipotez karşılaştırıldığında arda her piksel etrafında bir alt bölge içinde bir hedef (kuantum nokta), varlığı veya yokluğunun tespiti: PSF ile varlığını ya bir sinyal, bir iki boyutlu bir Gauss pik olarak modelized veya kare başına daha az bir sahte algılama ile, yeterince düşük yanlış alarm sigortalanması bir eşik kullanarak sadece gürültü. Bu tespit bir olasılık haritası yol açar. Her yerel maksimum onun olasılık seviyesinde Yanlış Alarm (PFA) istenen Olasılık göre ayarlanmış bir minimum değer, daha yüksek olduğunu sigortalanması, varsayılan bir hedef olarak kabul edilir. Bu sınır verimli sig ayrımcılık yeterince düşük ayarlıGürültüden nals hala tespit yeterince yüksek bir olasılık verirken teorik olarak tahmin edilen optimum ulaşan 1, en ​​iyi sahte tespitleri (varsayılan olarak 10 -6 PFA, 512 x 512 piksel görüntülerde daha az bir hata sigorta) de kaçınmak. Bir alt-bölge kullanarak şartı görüntü sınırlarının (7 x 7 piksel varsayılan pencere için 3 piksel) değerlendirilemez ima ettiğine dikkat edin.
  2. Gibi alt-piksel konumu ve sinyal yoğunluğu olarak ilgili parametreler, her tespit edilen hedefin, Tahmin,. Her tespit edilen hedefin, bir en-kare Gauss-Newton uyum yanındaki tespit Gauss pozisyonunu, genişliğini ve yüksekliğini tahmin etmek için yapılır. Bu özellikle boyanın alt-piksel pozisyonlar (tipik SNR değerleri ve hareketsiz veya yavaş difüzyon boyalar için 10 ila 20 nm doğruluğu, 0.1 mikron 2 / s difüzyon boyalar için ~ 100 nm kadar artan) sağlar.
  3. Ile yeni hedeflerin Reconnectionizleri zaten önceki çerçeve üzerine inşa. Yeni hedeflerin seti önceki izleri seti ile eşleşti. Bu amaç için, bir iz üzere her bir hedef tayin etmek için mümkün olduğunca, algılama adımda elde edilen mevcut tüm istatistiksel bilgi pozisyonu sadece, kullanılabilir, fakat, aynı zamanda yoğunluğu, genişliği, yanıp sönen ve ilişkili istatistikleri edilir. Bu nedenle, hedefler, sadece en yakın iz atanmamış: geçen izleri, yoğunluk, hız, genişlik ve yanıp sönmesi durumunda dikkate alınacaktır. Bu istatistiksel optimum yeniden bağlanma skoru sunar. Yakın komşularına karşı yeniden bağlanma kutuplama mümkün olduğunda, bu strateji, kaçınır.

Tespit zirveleri kendi tahmin veya yeniden bağlanma başarısız olursa reddedilir sonradan olabilir. Özel bir test yeni izleri önerge sunacağını yeni zirveler tespiti, işler. Bu test, daha sıkı PFA (10 -7) kullanan bir iz için bir zirve yeniden bağlamadan yana bir doğrulama o gibi fiili yorumlanabilir f alaka (bu kriter yeni zirveleri için geçerli değildir tanımı olmak üzere).

Yörünge Analizi

Olası geçici doğumdan sonraki ters yerel difüzyon 24-29 ile ilgili bir fonksiyon tarafından değerlendirilir. Bir eşik uygulamak bölüm sınırlı tanımlamak veya olmayan sağlar. Bütün izlerini üzerinden bu yineleme, biz geçici hapsetme açısından / olayları yavaşlatmak, membran dinamikleri eşleyebilirsiniz. Bu alternatif ikili veya doğumdan indeksi ayrık değerler kullanılarak temsil edilebilir.

Varsayılan olarak, MTT otomatik olarak bir metin dosyasına 8 zirve kaydetme parametrelerini, bu görevleri gerçekleştirir: kare sayısı, i ve j konum, sinyal şiddeti, yarıçapı, ofset ve videonun her karesini (7 satır grubu) ve eser (sütun) için, yanıp sönmeye . Örneklendiği gibi bu çıkış parametreleri, Matlab veya Octave fazla yani izleri veya sinyal yoğunlukları analizi için fread_data_spt alfabeyi kullanarak tekrar edilebilir Ekinde "https://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example komut.

Ayrıca analizler her hücrenin üzerinde izleri eşlemek için (Şekil 1C & 3) ve ilgili parametreleri (örneğin pik şiddetlerini, SNR veya yerel difüzyon değerleri gibi) için histogram dağılımını sağlamak için yol. Her dosya için, ortalama ve her parametrenin standart sapma histogramlarının bir görüntü ile birlikte, bir metin dosyasına kaydedilir. Böyle r 2 kare yer değiştirme gibi Logaritmik dağılımları, geometrik ortalama yol açar. Difüzyon katsayısı D MSD eğrisinin ilk beş puan üzerinden bir doğrusallaştırma hesaplanır. Bu değerler, hücresel reaksiyonlar veya membran organizasyonu etkileyen ilaç / enzimatik tedavilerin örneğin kinetiği için içeren bir deney genel bir bakış sağlar. MTT bir açık kaynak kodu olduğu için, bu yönü kolayca herhangi bir özel soruşturma adapte edilebilir.

599fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil 1.. MTT ile membran reseptörleri dinamikleri izlenmesi. Gibi EGFR (A) Membran bileşenleri, olan biyotinile Fab parçaları (her molekülün yaklaşık olarak doğru ölçeklendirme ile şematik çizim) ile birleştiğinde kuantum nokta ile etiketlenmiş. (B) Tipik floresan görüntüyü tek tek etiketli reseptör karşılık kırınım-sınırlı zirveleri gösteren, 36-ms pozlama süresi ile, canlı bir COS-7 hücre elde. (C) MTT analiz çıktısı hücrenin aydınlık görüntü üzerinde kaplanmış reseptörlerinin rekonstitüe yörüngeleri, görüntülenmesi.

figure-protocol-1
Şekil 2. MTT giriş parametreleri. MTT23i Koşu olarak bizim daha önceki yayın 1 açıklanan tüm giriş parametreleri, adları ve varsayılan değerleri listeleyen bir grafik kullanıcı arayüzü açılır. Algoritması, uzay ve zaman parametreleri (arama pencereler, tepe çapı, maksimum difüzyon ve yanıp sönen) boyutsuz standart birimleri, piksel ve çerçeveler bulunmaktadır. Kalibrasyon çıkış sonuçlar dönüştürmek için sonradan uygulanabilir. 156 nm / pxl ve çerçeve gecikmesi: 36 ms / çerçeve 100x büyütme ile Cascade 512BFT karşılık Varsayılan değerler, piksel boyutu vardır.

Müfettişler bu beklenen maksimum difüzyon katsayısı ("Fark max") ve maksimum yanıp yok ("T kapalı") gibi birkaç kritik parametreleri, optimize gerekir. Bu iki uzay ve zaman sınırları hemen hemen belli bir deneysel durum için, diğerleri sağlam varsayılan değerlerine ayarlı yeniden ele alınması gereken tek olanlardır. Örneğin, yanlış alarm sayısını doğrudan çoğu durumda tatmin edici kare başına bir daha dolayısıyla daha az milyon piksel başına daha az bir hata sağlamak için ayarlanır. Tüm parametreler kullanıcılar analiz için kullanılan hangi ayarları daha sonra doğrulamak için izin çıktı klasöründe bir metin dosyasına kaydedilir.

s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" Şekil 3 "/>
Şekil 3. MTT analizi önemli adımlar atıldı. Floresans görüntülerin deneysel bir yığın başlayarak, zirveleri sırayla ve otomatik olarak algılandı, bir Gauss uyum ve çerçeveler üzerinden yeniden (operasyonlarının ilk aralığı, akış şeması üst kısmı) tarafından tahmin edilmektedir. Izleri daha sonuçta ilgili tanımlayıcıları (operasyonların saniye aralığında, alt kısım) ile dinamik bir haritası yol açan, örneğin olası sınırlandırıcı için analiz edilebilir.

figure-protocol-2
Şekil 4. Etiketleme değerlik MTT etkilemez. Artefactual multivalan etiketleme ile getirilen olası yanıltıcı değerlendirmek için, MTT analizi yörüngeleri haritaları oluşturmak ve analiz etmek için, 2 farklı şemaları kullanarak tagged endojen EGFR izlemek için yapıldı. Protokolü açıklandığı gibi (A) Reseptör, biyotin Fab ve kuantum-dots605-streptavidin etiketlenen.Bu durumda, kuantum-noktalar ve streptavidins bir çok-değerliği tek bir boya için birçok reseptör birleştirme ile sonuçlanabilir. (B) reseptörleri doğrudan organik bir boya, Atto647N akuple Fab etiketlenmiş edildi. Bu durumda, bir Fab, dolayısıyla bir reseptörü, birden fazla boyası ile bağlanabilmektedir. (C) kare yer değiştirme (MSD) eğrisi kuantum nokta veya ATTO boyalar (sol ve sağ grafikler, sırasıyla) ile ya etiketli, her hücre için tüm izleri için hesaplanmıştır ortalama. Difüzyon katsayıları MSD (kırmızı noktalı çizgi) beş ilk puan üzerinden doğrusallaştırma tarafından hesaplanmıştır. Benzer difüzyon değerleri (merkez grafik) neden etiketleme Her düzen. Qdot: kuantum dots605 (n = 5 hücreleri), ATTO: Atto647N (n = 7 hücreleri), ns: anlamlı değildi (Student t-testi p> 0.05).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek parçacık izleme, hücre ve mikroskop yönleri yanında, analiz çalışmalarının önemli bir bölümünü temsil eder. , Tespit tahmin ve her kare üzerinde zirve reconnecting: Bu üç ana görevleri gerçekleştirmek için kullanılan algoritma giderir. Ama bu işin sonucu yönü son, ekstra adımlar (örneğin, hareket tarzları, etkileşimleri veya stokiyometri deşifre gibi) için aslında herhangi bir yeni özel soruşturma için adapte edilmesi gerekebilir algoritması kendisi, tertipleyerek bulunur.

Ancak, bir kez...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onların destek ve verimli tartışmalar için, ekibimizin üyeleri, teknik yardım için özellikle MC Blache yanı sıra M Irla ve B Imhof teşekkür ederiz. Deflasyon ve lohusalık ile ilgili rakamlar Doğa Yöntemleri izniyle çoğaltılamaz. Bu proje, CNRS, İNSERM ve Marseille Üniversitesi, ve Région Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Kanser, Agence Nationale de la Recherche (belirli hibe tarafından kurumsal hibelerle desteklenmektedir ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 blan 1214 01) ve Fondation pour la Recherche medicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR Ligue Nationale Contre le Kanser bir burs ile desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Şirket Katalog numarası Miktar
COS-7 hücre hattı ATCC CRL-1651 5.000 hücreler / kuyu
Ca 2 olmadan HBSS + GIBCO 14175 1 ml
% 0.05 Tripsin EDTA GIBCO 25300 1 ml
Lab-Tek 8-iyi Nunc 155441 1
QDot-605 streptavidin Invitrogen Q10101MP 20 mM
Tinile Fab (Fab sentezi için, referans 21)
MAb 108 den Fab ATCC HB-9764 200 mikrogram
NHS-Biotin Thermo Scientific 21435 18.5 mikrogram
Orta tamamlayın
DMEM GIBCO 41965 500 ml
Sığır fetüs serumu SIGMA F7524 50 ml
L-Glutamine GIBCO 25030 5 ml
HEPES GIBCO 15630 5 ml
Sodyum piruvat GIBCO 11360 5 ml
Görüntüleme orta
Ca 2 ile HBSS + GIBCO 14025 25 ml
HEPES GIBCO 15630 250 ul

1 "> Ekipman Şirket Referans Inverted mikroskop Nikon Eclipse TE2000U Floresan lambası Nikon Intensilight C-HGFIE 1.3 NA 100x objektif Nikon Fluor 1.30 planlayın 1.49 NA 100x objektif Nikon APO TIRF 1.49 Kamera Roper Bilimsel Cascade 512 B Termostatlı kutusu Yaşam Görüntüleme Hizmetleri Kutu

Ek: MTT ek analiz örneği script

fonksiyonu MTT_example (file_name)
MTT çıkış sonuçlarını nasıl kurtarılacağını gösteren%%% Temel örnekleri
%%% Her trac çizmek içine ve histogram oluşturmak için
Floresans yoğunluğu%%%

nargin <% 1 eğer hiç file_name sağlanmaktadır?
Dosyaları = dir ('* stk.');
Boşsa (dosya), disp ('simdiki veri yok'), dönüş, sonu ise
. file_name = dosya (1) adı;% varsayılan: İlk stk dosyası
disp (['varsayılan' file_name 'kullanarak'])
son

file_param = [file_name '_tab_param.dat'];% çıktı dosyası

%% Yük verileri
versiyonuna göre bir CD ('output23')% veya ('output22'), kullanılan
% Yasal Uyarı: sürüm 2.2, sadece 7 parametre üretir
% Ekstra bir parametre, gürültü, sürüm 2.3 'de eklendi

Tek bir tabloda, aynı anda tüm parametreleri okumak için%
% Tab_param = fread_all_param (file_param);
% Tab_i = tab_param (02:08: sonunda :); tab_j = ...

Ayrı tablolarda tüm parametreleri (frame_number hariç) okumak için%
% [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param);

tab_i = fread_data_spt (file_param, 3); eser sayısı ve kare sayısı, bilgilendirici olmayan, atılır, çünkü% dizini 3'tür!
tab_j = fread_data_spt (file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8);

Iz üzerinden%% Döngü
N_traces = boyut (tab_i, 1);
% Tablolar N_frames kolon tarafından N_traces hatları

N_traces: ITRC = 1 için
No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)> 0; sadece% dışı yanıp adımları
arsa (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index))
& Nbsp; xlabel ('i (piksel)'), ylabel ('j (piksel)')
başlık (['iz #' num2str (ITRC)])
disp ('sonraki izleme için herhangi bir tuşa grev Lütfen'), duraklatma
son

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum (tab_blk (:)> 0);% dışı yanıp adımlar yalnızca
2sqrt (N) kutuları kullanılarak geçmiş (tab_alpha (tab_blk> 0), 2 * sqrt (N_datapoints))%
xlabel ('yoğunluğu (au)'), ylabel ('olay')
title ('parçacıkların floresans şiddetinin histogram')

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
  2. Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).
  3. Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
  4. Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
  5. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
  6. Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  7. Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
  8. Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
  9. Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
  10. Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
  11. Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
  12. Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
  13. Saffman, P. G., Delbruck, M. Brownian motion in biological membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).
  14. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  15. Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
  16. Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
  17. Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
  18. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
  19. Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  20. Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
  21. Andrew, S. M. Enzymatic digestion of monoclonal antibodies. Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).
  22. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
  23. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
  24. Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915(2006).
  25. Saxton, M. J. Single-particle tracking: effects of corrals. Biophys. J. 69, 389-398 (1995).
  26. Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
  27. Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
  28. Jacobson, K., Dietrich, C. Looking at lipid rafts. Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).
  29. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
  30. Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
  31. Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
  32. Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
  33. Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
  34. Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
  35. Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
  36. Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
  37. Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
  38. He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
  39. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
  40. Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiple Target TracingSingle Particle TrackingEpidermal Growth Factor ReceptorQuantum Dot LabelingHigh Density ImagingTrajectory ReconstructionPeak DetectionDeflation AlgorithmTransient Confinement AnalysisMonte Carlo Simulations

Related Articles