Yöntem makalesi

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

DOI:

10.3791/3628

⸱

11 Ocak 2012

 , 
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine , 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz topoizomeraz bir protein tarafından desteklenmektedir moleküler ölçekli cihaz montaj ve uygulama göstermektedir. Inşa uçları iki farklı fluorophores ekleyerek doku kesitlerinde DNA kırıkları başlıca iki tipi etiketler moleküler biyo-sensör.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğal olarak ortaya çıkan bio-moleküler makineler her canlı hücrenin çalışması ve çeşitli tasarımlar 1-6 gösterilecek. Ancak yönlü hareket, yani moleküler motorlar uyumlu cihazlar ve ölçekli aşağı mekanik parçalar (jantlar, aks, kolye vb) 7-9 yapay moleküler makineler merkezlerinin geliştirilmesi. Bu nanoworld ortamlarda 10, atalet ve momentum korunumu gibi, bu cihazlar için gerekli olan fiziksel özellikleri, kullanışlı olmasa bile, makro makineleri taklit eder . Nanoworld belirli koşulları, mekanik macromachines şemaları izleyin ve biyolojik moleküllerin evrimi geliştirilen mekanizmalar kullanmayın alternatif tasarımlar, yararlanabilirsiniz. Bunun yanı sıra, nano-tasarım amaçları için gerçek biyolojik moleküllerin adapte nanoteknoloji ürünleri oluşturabilecek potansiyel tehlikeleri azaltır. Burada, böyle bir biyo-uyumlu inşa montaj ve uygulamasını göstermekyapay bileşenleri ile doğal olarak ortaya çıkan moleküler makine birleştirir emi-yapay moleküler cihaz. Enzimoloji noktadan itibaren, bir yapı, bir tasarımcı floresan enzim-substrat kompleksi yararlı belirli bir işlevi gerçekleştirmek için bir araya koymak. Bu meclis, bir 12 içerdiğinden, tanımı gereği bir moleküler makine . Ancak, mühendislik bölümü ile entegrasyon - floresan çift saç tokası - DNA hasarını 12 etiketleme yeni bir görev için yeniden yönlendirir.

Bizim yapı 32-mer DNA ve enzim vaccinia topoizomeraz I (VACC TOPO) toplanır. Makine daha sonra iki floresan etiketli detektör birimleri (Şekil 1) imal kendi malzeme kullanır. Birimlerden biri (yeşil floresan) VACC TOPO kovalent 3'end ve başka bir birim (kırmızı floresan) bağlı bir terminal 3'OH ile ücretsiz saç tokası taşır. Birimleri, kısa ömürlü ve hızlı bir şekilde, orijinal bir yapı, sonradan recleaves içine geri yenilemek.DNA yokluğunda bu iki ünite sürekli döngüsel bir şekilde ayrı ve religate kırar. DNA hasarı, topoizomeraz taşıyan dedektör ünitesi seçici floresan etiketleme 5'OH (DNaz II tipi sonları): 11,12 künt uçlu DNA kırıkları verdiği doku kesitlerinde . T4 DNA ligaz 13,14 çözüm varsa oligonükleotid bölünme sonra oluşan ikinci, enzim ücretsiz saç tokası, 5'PO 4 künt uçlu sonu (DNaz I-tipi sonları) 11,12 Arter olacak. T4 DNA ligaz bir doku bölüm veya 5'PO 4 künt uçlu sonları ile DNA içeren bir çözüm için eklendiğinde, ligaz, yarı kararlı bir enzim-DNA kompleksleri oluşturarak, 5'PO 4 DNA biter tepki verir . Künt sona erdi toka, böylece 5'PO 4 künt uçlu DNA kırıkları etiketleme, DNA ligaz ve kovalent bağlantı toka serbest bu kompleksleri ile etkileşim olacaktır .

Bu gelişme th için yeni bir pratik yaklaşım örneğidire moleküler makineler tasarım ve sabit hücre ve dokularında apoptozis ve DNA hasarı tespit için yararlı bir sensör sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hazırlanması moleküler cihaz montajı daha fazla zaman alır, çünkü moleküler makine tabanlı tespiti için bölümler hazırlanmalıdır. Inşa paraformaldehid sabit, parafine gömülü doku blokları kesilmiş 5-6μm kalınlığında bölümleri ile iyi çalışır. ProbeOn Plus ücret ve precleaned slaytlar (Fisher Scientific) veya benzeri gibi iyi bölümlerde muhafaza slayt markalar kullanın. Biz deksametazon ile tedavi edilen apoptotik sıçan timus 13,14 DNaz I-ve DNaz II tipi molaları içeren DNA hasarı bilinen bir desen, bir doku kullanarak önerilir.

1. Kesit hazırlanması

  1. 15 dakika ksilen bir slayt raf ve mumunu gidermek bölümleri Place, ek bir 5 dakika boyunca taze bir ksilen banyo aktarın.
  2. Kademeli etanol konsantrasyonları geçerek rehidrate:% 96,% 80 Etanol-2x5min Etanol - 5min; su - 2x5 dk.
  3. Özet bölümü ile Proteinase K. Bölüm başına bir 50μg/mL çözüm 100μL kullanın. Nemlendirilmiş bir odasında oda sıcaklığında (23 ° C) inkübe 15 '. Zaman doku tipine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Sert dokular uzun sindirim gerektirebilir. 15-25 dk Times genellikle kullanılır. Yetersiz sindirim zayıf sinyal neden olabilir. Öte yandan sonuçlarına ilişkin sinyal ortadan kalkması ve bölüm kesintisi Overdigestion.
  4. 2x10 dakika süreyle distile su ile durulayın.
  5. Preblocking için% 2 BSA 100 mcL Bölüm başına uygulayın. 15 dakika oda sıcaklığında (23 ° C) inkübe edin. Bu süre zarfında moleküler makine monte edin.

2. Moleküler makineler montaj

Tüm reaktifler ortalama büyüklüğü doku bölümü (10x10mm) tek bir algılama için yeterli olan 25 mcL toplam hacmi, ölçeklenir. Gerektiği kadar hacmi kadar ölçeklendirilebilir.

  1. Bu sırada küçük bir plastik tüp birleştirin:
  1. Bidistile su;
  2. % 15 polietilen glikol-8000;
  3. Çözüm 66 mM Tris HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl 2, 0.1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP (yani normal T4 DNA ligaz tampon);
  4. Oligonükleotid 1 70 pmoles,
  5. 215 pmoles (1.76 - 7,1 mcg) VACC TOPO.
  6. 10 birimleri T4 DNA ligaz (500 U / ml)
  1. Pipetleme yavaşça karıştırın. Moleküler neredeyse anında bu çözüm kendi kendine bir araya inşa etmek ve oda sıcaklığında (23 ° C) hemen kullanılabilir. Sıcaklığının artmasıyla 37 ° C blokları etiketleme T4 DNA ligaz tabanlı bir bileşen.

3. Moleküler makineler kullanarak çift etiket 5'OH ve 5'PO4 DNA kırıkları doku kesitlerinde

  1. Preblocking çözüm aspire ve 70 pmoles Oligonükleotid 1, 53 içeren tam bir reaksiyon karışımı 25μL geçerli 215 pmoles (1.76 - 7,1 mcg) VACC66 mM-Tris HCl, pH 7.5, 5mM MgCl 2, 0.1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, ve% 15 polietilen glikol-8000 çözümü TOPO ve 10 adet T4 DNA ligaz (500 U / ml). Tek bir FITC etiket, 2 Oligonükleotid taşıyan aynı sıra oligonükleotid, tek bir DNA sonlarının türü tespiti için yerine kullanılabilir. Böyle bir durumda etiketleme reaksiyon ligaz atlayabilirsiniz. Ayrıca bu duruma bir çözüm 50mm Tris-HCL, pH 7.4,% 15 PEG-8000 T4 DNA ligaz tamponu yerine kullanılan olabilir.
  2. Plastik lamel ile nemlendirilmiş bir odasında oda sıcaklığında (23 ° C) 1 saat süreyle inkübe edin. Işıktan koruyun. Düşürülmesi sıcaklık 16 ° C ligaz tabanlı sinyal azaltır; 37 ° C sıcaklık artışı ligaz tabanlı sinyal tamamen ortadan kaldırır. Ligaz bir kısmi inhibisyonu bazen topoizomeraz preparatları ile tanıtıldı kirleticiler nedeniyle muhtemelen, reaksiyon karışımı oluşur. Bu nedenle, uzun bir inkübasyon (2-4 saat) gerekli olabilir, özellikle sligaz etiketli sonlarının ignificant numaraları mevcuttur. Ligaz sinyali ligaz ve topo sinyalleri hem de birçok durumda, bu aşamada uyulması rağmen VACC TOPO ve çift etiketli Oligonükleotid olmadan reaksiyon karışımı yeniden uygulama tarafından daha da geliştirilerek, ancak bir saç tokası şeklindeki oligonükleotid (Oligonükleotid 3) içeren (35 mg / ml) ve T4 DNA ligaz (250 U / ml). Artırmak için sinyal Adım 5 gitmek reaksiyon geliştirme olmadan görmek için, Adım 3'e geçin.
  3. Yavaşça Coplin kavanoza oda sıcaklığında su içeren bir slaytları dikey çeker lamelleri çıkarın. Aşırı su aspire.
  4. VACC TOPO ve Oligonükleotid 1 olmadan reaksiyon karışımı 25 mcL uygulanması, ancak Oligonükleotid 3 içeren ligaz sinyal geliştirin: 66 mM Tris HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl 2, 0.1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, ve% 15 polietilen glikol- 8000, 5 adet T4 DNA ligaz, 35 mg / ml Oligonükleotid 3 (künt sona erdi saç tokası). Etiketleme çözümü ca toplam hacmin büyük bölümleri barındıracak kadar ölçeklendirilebilir. Plastik lamel ile nemlendirilmiş bir odasında, oda sıcaklığında (23 ° C) 18 saat (gece) inkübe edin.
  5. Yavaşça Coplin kavanozu oda sıcaklığında su içeren dikey slaytlar çeker lamelleri çıkarın. Sonra bölüm 3x10 dakika distile su ile yıkayın.
  6. Sodyum bikarbonat tamponu ile durulayın. Alkali çözelti pH duyarlıdır ve pH 7'nin altındaki önemli ölçüde azalır FITC floresanı, geliştirir durulama.
  7. Antifading bir çözüm (DAPI ile Vectashield), lamel Cover bölüm ve floresan mikroskop kullanılarak sinyal analiz. 5'OH ile çift iplikli DNA kırıkları yeşil, 5'PO 4 tatili floresan-kırmızı (Şekil 2) floresan olacak.

4. Temsilcisi Sonuçlar

figure-protocol-1
Şekil 1. Yarı yapay moleküler makine iki tür algılarIn situ DNA hasarı. VACC TOPO çift saç tokası 32-mer bağlanır floresan makine kendini-bir araya. Bu makine ile iki dedektör birimler halinde kendisi bölme işlemi başlar topoizomeraz-3 'tanıma dizisi sonunda kesilir. Bu sonuç FITC etiketli ünitesi sürekli olarak ayırır ve rodamin etiketli ünitesine geri religates döngüsel bir süreç. Bu saptanabilir DNA sonu karşılaştı kadar devam eder. Böyle bir alternatif alıcısı (5'OH künt uçlu DNA break) doku bölümünde olduğunda, FITC parçası Arter. Kalan rodamin parçası T4 DNA ligaz yardımıyla 5 'PO 4 DNA künt sonu tatili eklenecektir. Sonuç olarak, her iki tür DNA kırıkları aynı anda tespit edilir.

figure-protocol-2

Şekil 2. Moleküler makine çift etiketleri iki tür DNA kırıklarıdeksametazon ile tedavi edilen timus bir doku bölümünde. DNaz künt uçlu DNA kırıkları ve DNaz II tipi apoptozis geçiren timik kortikal alanlarda algılanır. Yeşil sitoplazmik floresans (5'OH DNA kırıkları), apoptotik timositleri nükleer malzeme sindirerek kortikal makrofajlar işaretler. Bu sinyal VACC TOPO tarafından üretilen ve çift iplikli 5'OH tatili 11,12 içeren DNA ile phagolysosomes için lokalize. Kırmızı floresans (5'PO 4 sonları) etiket çekirdekleri makrofajlar tarafından yuttu apoptotik timositleri. Timositleri Massive aynı anda 5'PO 4 çift iplikli molaları kuşak tarafından eşlik apoptozis tabi ligaz tabanlı etiketleme tarafından görüntülendi. Bu sonları halka şeklinde desenler oluşturan nükleer çevre bulunmaktadır. Tüm hücre çekirdekleri DAPI (mavi floresan) ile counterstaining tarafından görüntülenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu videoda, bir çift etiketleme DNA hasarı sensörü montajı ve nasıl kullanılacağını göstermektedir. Sensörü, biyo-moleküler motor, yapay bileşenleri ile bağlantılı bir virüs kodlanan protein VACC TOPO tarafından yönlendirilen bir moleküler makine. Sunulan geliştirme, toksik olmayan moleküler ölçekli cihazların 12,15 tasarımı, biyolojik yapıları, mimarileri ve hücre gerçek parçaları ve bileşenleri adapte savunucuları bir biyo-etkin bir yaklaşım örneğidir. 1: Bu yaklaşım, iki in vivo nanosensors alanın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme, Ulusal Sağlık Enstitüleri (VVD) ve National Institute of Nörolojik Bozukluklar ve İnme, Ulusal arra yoluyla Institutes of Health (VVD) ve R21 R21 NS064403 hibe hibe R01NS062842 tarafından desteklenen Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik EB006301 National Institute, National Institutes of Health (VVD).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

  1. Ksilen
  2. 80 ve% 96 Etanol.
  3. Distile su (BSA), sığır serum albümin% 2'lik solüsyon.
  4. Oligonükleotid 1: bir çift-saç tokası, çift floresein ve tetramethylrhodamine ile etiketlenir:

GCG AT 5'-AAG GGA SKK GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R TT-3 'F - FITC-dT; R - Tetramethylrhodamine-dT. BODIPY TR rodamin veya TAMRA gibi diğer kırmızı-kaymıştır fluorophores R olarak yerine tetramethylrhodamine kullanılabilir.

Alternatif Oligonükleotid 2 kullanabilirsiniz. Floresein ile etiketlenmiş bir çift saç tokası single (tek bir DNA kırıkları tipi (DNaz II-tipi) tespiti için tek fluorofor taşıyan prob önemli ölçüde daha az pahalı ve rahat bir zaman tek bir DNA break tipi etiketli: 5'-AAG GGA, SKK GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 '; F - FITC- dT

  1. Oligonükleotid 3. Tetramethylrhodamine-dT - R; 5'-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3: T4 DNA ligaz ile yerinde ligasyon sinyal artırılması için künt uçlu rodamin etiketli saç tokası
  2. Vaccinia DNA topoizomeraz l (VACC TOPO) - 3000 U / ml (Canlı Teknolojileri). İlk deneylerde reaksiyon karışımı her 25 mcL başına VACC TOPO 215 pmoles (7.1 mg) kullanılır. Ancak, hassasiyet kaybı olmadan topoizomeraz konsantrasyonunu önemli ölçüde azaltılabilir. Daha sonra benzer sonuçlar VACC TOPO (bölüm başına reaksiyon karışımı 25 mcL 1.76 mcg) Bölüm başına dört kat daha az miktarda kullanılır. 880 ng (25 mcL reaksiyon karışımı) enzimin miktarını azaltarak, daha zayıf bir sinyal ve 8.8 ng VACC TOPO saptanabilir sinyal üretti.
  3. T4 DNA ligaz 5 U / ml (Roche). Bu son derece konsantre ligaz hazırlık deneysel koşullarda en iyi sinyal verir.
  4. T4 DNA ligaz için 10 x reaksiyon tamponu: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7.5 (20 ° C) (Roche). ATP reaksiyon tamponu içinde çözülme-donma tekrarlayan döngüler halinde kolayca yok edilir. Kısım küçük 15-20 mcL bölümlerini ve mağaza tampon - 20 ° C bir kez kullanın.
  5. Bidistile su PEG-8000 (Sigma)% 30 (w / v) solüsyonu. % 15 PEG-8000 reaksiyon karışımı hacmi dışlama bileşenlerinin etkili konsantrasyonları artan algılama uyarır.
  6. Distile su proteinaz K (Roche) 20 mg / ml stok solüsyonu. Mağaza - 20 ° C PBS stok hazırlanan reaksiyon kullanımı 50mg/mL çözüm. Kullanmayın.
  7. DAPI (vektör Laboratuvarlar) ile Vectashield.
  8. Sodyum bikarbonat tampon: 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8.2.
  9. 22x22mm veya 22x40mm cam ya da plastik lamelleri. Plastik lamelleri bir reaksiyon sırasında tercih edilirbölümünden kaldırmak için daha kolay yeniden.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).
  2. Schuldt, A. Dynamic Pol expeditions. Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).
  3. Urry, D. W. Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).
  4. Schneider, T. D. Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines. J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).
  5. McClare, C. W. Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms. J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).
  6. Spirin, A. S. Ribosome as a molecular machine. FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).
  7. Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex. Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).
  8. Drexler, K. E. Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , Wiley. New York. (1992).
  9. Freitas, R. A. Nanomedicine: basic capabilities. , Landes Bioscience. Austin. (1999).
  10. Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).
  11. Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16, 4599-4614 (2011).
  12. Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection. Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).
  13. Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis. J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).
  14. Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells. Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).
  15. Jones, R. A. L. Soft Machines: Nanotechnology and life. , Oxford University Press. USA. (2007).
  16. Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Molek ler Makine MontajDNA Hasar n n TespitiVaccinia TopoizomerazFloresan Sa Tokas BirimleriDoku Kesiti Haz rlamaProteinaz K SindirimiT4 DNA LigazK t U lu K r klarApoptozun TespitiNanoteknoloji Sens r

İlgili makaleler