Yöntem makalesi

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

18.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/3702

⸱

26 Mart 2012

 , 
1RNA Biology, New England Biolabs

Bu makalede

Özet

Bu yöntem, Gaussia lusiferaz (GLuc) geni içeren lineerize edilmiş bir plazmidden hem kaplı hem de kaplanmamış mRNA'nın yüksek verimli in vitro sentezini tanımlamaktadır. RNA saflaştırılır ve kaplanmamış RNA'nın bir kısmı Vaccinia virüsü kaplama enzimi kullanılarak enzimatik olarak kaplanır. Son adımda, mRNA HeLa hücrelerine transfekte edilir ve hücre kültürü süpernatantları lusiferaz aktivitesi için analiz edilir.

Özet

In vitro transkripsiyon, RNA polimeraz tarafından, ilgili promotör dizisini (T7, T3, SP6) ve transkribe edilecek geni içeren lineer bir DNA kalıbından RNA transkriptlerinin sentezlenmesidir (Şekil 1A). Tipik bir transkripsiyon reaksiyonu; kalıp DNA, RNA polimeraz, ribonükleotid trifosfatlar, RNaz inhibitörü ve Mg2+ iyonları içeren tampondan oluşur.

Çeşitli uygulamalar için sıklıkla yüksek miktarda ve yüksek kaliteli RNA gerekmektedir. Şunların kullanımı in vitro splicing gibi RNA yapı ve fonksiyon çalışmaları için transkripsiyon rapor edilmiştir1, memeli hücrelerde RNAi deneyleri2, "Eberwine yöntemi" ile antisense RNA amplifikasyonu3, mikroarray analizi4 ve RNA aşı çalışmaları için5Teknik, aynı zamanda radyoolabelenmiş ve boya ile işaretlenmiş probların üretimi için de kullanılabilir.6. Warren, ve ark. yakın zamanda bildirilen, ... ile transfeksiyon yoluyla insan hücrelerinin yeniden programlanması in vitro transkribe edilmiş kapaklı RNA7New England Biolabs'ın T7 High Yield RNA Synthesis Kiti, 20 μl'lik reaksiyon başına 180 μg'a kadar RNA sentezlemek üzere tasarlanmıştır. Bu kit kullanılarak 10kb uzunluğa kadar RNA'ların transkripsiyonu başarıyla gerçekleştirilmiştir. Transkribe edilecek genin yukarı akışında (upstream) T7 promotör dizisi bulunduğu sürece; lineerize edilmiş plazmid DNA'lar, PCR ürünleri ve sentetik DNA oligonükleotidleri transkripsiyon için kalıp olarak kullanılabilir.

RNA'ya bir 5' uç kep yapısının eklenmesi, ökaryotlarda önemli bir süreçtir. Bu işlem RNA stabilitesi8, etkin translasyon9, nükleer transport10 ve splicing11 için gereklidir. Süreç, RNA'nın 5' trifosfat ucuna bir 7-metilguanozin kepinin eklenmesini içerir. RNA capping işlemi, capping enzimleri kullanılarak post-transkripsiyonel olarak veya kep analogları kullanılarak ko-transkripsiyonel olarak gerçekleştirilebilir. Enzimatik yöntemde, mRNA Vaccinia virüsü capping enzimi kullanılarak keplenir12,13. Enzim, donör olarak GTP ve S-adenozil metiyonin kullanarak RNA'nın 5' ucuna bir 7-metilguanozin kepi ekler (kep 0 yapısı). Her iki yöntem de transfeksiyon veya ters genetik sistemler için viral genomik RNA üretimi15 ve eIF4E gibi kep bağlayan proteinlerin kristalografik çalışmaları16 gibi diğer uygulamalar için uygun, fonksiyonel olarak aktif keplenmiş RNA üretir14.

Aşağıda açıklanan yöntemde, Gaussia lusiferaz (GLuc) ve Cypridina lusiferaz (CLuc) proteinlerinin kapslanmış ve kapslanmamış RNA transkriptlerini sentezlemek için NEB marka T7 High Yield RNA Synthesis Kit kullanılmıştır. Kapslanmamış GLuc RNA'sının bir kısmı, Vaccinia Capping System (NEB) kullanılarak kapslanmıştır. GLuc veya CLuc geni ile T7 promotörünü içeren lineerize edilmiş bir plazmid, kalıp DNA olarak kullanılmıştır. Transkribe edilen RNA, HeLa hücrelerine transfekte edilmiş ve hücre kültürü süpernatantları lusiferaz aktivitesi açısından analiz edilmiştir. Kapslanmış CLuc RNA'sı, GLuc ekspresyonunu normalize etmek için internal kontrol olarak kullanılmıştır.

Protokol

RNazlar yaygın olarak ciltte, saçta, tozda, laboratuvar yüzeylerinde, çözeltilerde vb. bulunur. RNaz kontaminasyonunu önlemek için kullanım öncesinde eldiven giyin ve bench yüzeyini, pipetleri vb. iyice temizleyin. Nükleaz içermeyen pipet uçlarının, tüplerin, cam malzemelerin ve reaktiflerin kullanılması şiddetle önerilir.

1. T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti kullanılarak In vitro Transkripsiyon

Transkripsiyon reaksiyonu için DNA kalıbı, Gaussia lusiferaz geni ve kodlama dizisinin yukarısında bir T7 promotörü içeren lineerleştirilmiş bir plazmiddir (Şekil 1B).

  1. T7 High Yield RNA Sentez kitindeki bileşenleri çözdürün ve buz üzerinde tutun.
  2. Kapaksız RNA için, reaksiyonu oda sıcaklığında şu sırayla hazırlayın:
BileşenHacim (μl)Final
Nükleaz içermeyen su*X 
10X Reaksiyon Tamponu21X
ATP (100 mM)210mM
CTP (100 mM)210 mM
UTP (100 mM)210mM
GTP (100 mM)210mM
Kalıp DNA *X1 μg
T7 RNA Polimeraz Karışımı2 
Toplam20 

*1 μg DNA ekleyin ve nükleaz içermeyen su ile toplam reaksiyon hacmini 20 μl'ye tamamlayın. Eklenecek su miktarı, kalıp DNA konsantrasyonuna göre değişiklik gösterecektir.

  1. Kepsli RNA için: Reaksiyonu oda sıcaklığında şu sırayla hazırlayın:
BileşenHacim (μl)Final
Nükleaz içermeyen su*X 
10X Reaksiyon Tamponu21X
ATP (100 mM)210mM
CTP (100 mM)210mM
UTP (100 mM)210mM
GTP (20 mM)22mM
3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G kap analoğu (ARCA)(40mM)48mM
Kalıp DNA*Lütfen çevrilmesini istediğiniz İngilizce kaynak metni sağlayın. Metni ilettiğinizde, belirttiğiniz akademik standartlara ve bilimsel terminoloji kurallarına uygun olarak Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.1 μg
T7 RNA Polimeraz Karışımı2 
Toplam20 

*1 μg DNA ekleyin ve toplam reaksiyon hacmini nükleaz içermeyen su ile 20 μl'ye tamamlayın. Eklenecek su miktarı, kalıp DNA'nın konsantrasyonuna bağlı olarak değişiklik gösterecektir.

  1. Vorteksleyerek iyice karıştırın ve reaksiyonları kuru hava inkübatöründe 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
  2. 1.3-1.4 basamaklarını kullanarak, CLuc genini içeren lineerize edilmiş bir plazmidden Cypridina lüsiferaz (CLuc) kaplı transkriptlerini sentezleyin. Bu mRNA, GLuc ekspresyonunun normalizasyonu için kaplı ve kapsız GLuc mRNA ile birlikte ko-transfekte edilecektir.

2. Kalıp DNA'nın Uzaklaştırılması

Saflaştırma işlemine geçmeden önce, DNA şablonunu uzaklaştırmak için transkripsiyon reaksiyonlarına DNase I uygulanır.

  1. Transkripsiyon reaksiyonlarına 70 μl nükleaz içermeyen su, ardından 10 μl DNase I reaksiyon tamponu ekleyin.
  2. Reaksiyonlara 2 μl DNase I ekleyin.
  3. Kuru hava inkübatöründe 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.

3. Kaplı ve Kaplanmamış RNA'ların Kolon ile Saflaştırılması

  1. Üretici talimatlarına uygun olarak, MEGAclearKit kullanarak kapsız ve kaplı RNA'yı saflaştırın (herhangi bir spin kolon tabanlı RNA saflaştırma kiti kullanılabilir).
  2. NanoDrop Spektrofotometre kullanarak RNA miktarını belirleyin.
  3. Üretici talimatlarına göre, Agilent RNA 6000 Nano Kit ve Agilent 2100 Bioanalyzer kullanarak RNA örnek kalitesini değerlendirin.

4. Vaccinia Capping Sistemi kullanılarak RNA Kepteleme

  1. Saflaştırılmış kapaksız GLuc mRNA'sından 10 μg alın.

Standart bir capping reaksiyonu 10 μg'a kadar (100nt veya daha büyük) RNA'yı capleyebilir. Daha fazla miktarda RNA'nın caplenmesi gerekiyorsa, reaksiyon buna göre ölçeklendirilebilir.

  1. Nükleaz içermeyen su kullanarak hacmi 15 μl'ye tamamlayın.
  2. Sekonder yapıları gidermek için RNA'yı 65 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Ardından 5 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.
  3. Keplleme reaksiyonunu kurmak için, 15 μl denatüre edilmiş RNA'ya 2 μl 10X Keplleme Tamponu, 1 μl GTP (10 mM), 1 μl taze dilüye edilmiş S-adenozil metiyonin (2 mM) ve 1 μl (10 ünite) Vaccinia keplleme enzimi ekleyin.
  4. Sert olmayan bir vorteksleme ile iyice karıştırın ve reaksiyonu kuru hava inkübatöründe 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

5. Kaplı RNA'nın Kolon ile Saflaştırılması

  1. Kapaklanmış RNA'yı MEGAclear Kiti kullanarak saflaştırın (herhangi bir spin kolon tabanlı RNA saflaştırma kiti kullanılabilir).
  2. Üretici talimatlarına uygun olarak, Agilent RNA 6000 Nano Kiti ve Agilent 2100 Bioanalyzer kullanarak RNA örnek kalitesini değerlendirin.

6. TransIT mRNA Transfeksiyon Kiti kullanılarak HeLa Hücre Transfeksiyonu

  1. HeLa hücrelerini, %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş 150 μl Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High Glucose içeren 48 kuyucuklu bir plakete ekleyin (0.7-2.3 × 105 hücre/kuyucuk).
  2. Hücreler %60-90 konfluense ulaşana kadar 37 °C'de 16-24 saat inkübe edin.
  3. GLuc (kapaklı ve kapaksız) ve CLuc RNA'larını 100 ng/μl konsantrasyona seyreltin.

Her bir transfeksiyon 8 tekrarlı olarak gerçekleştirilir.

  1. 8 adet eppendorf tüpü hazırlayın tüpler. Her tüpe ekleyin 1 μl kapaksız GLuc RNA, 1 μl kaplı CLuc RNA (normalizasyon için) ve 25 μl serumsuz DMEM'den. İyice karıştırın.
  2. 8 adet Eppendorf tüpü hazırlayın. Her bir tüpe şunları ekleyin: 1 μl kapaklı GLuc RNA (kapak analoğu), 1 μl kapaklı CLuc RNA (normalizasyon için) ve 25 μl serumsuz DMEM'den. İyice karıştırın.
  3. 8 adet Eppendorf tüpü hazırlayın. Her bir tüpe şunları ekleyin: 1 μl kaplı GLuc RNA (Vaccinia), 1 μl normalizasyon için kullanılan) capped CLuc RNA ve 25 μl serumsuz DMEM'den. İyice karıştırın.
  4. Ekle 0.2 μl İlk 8 tüplük sete mRNA Boost Reaktifi ekleyin ve karıştırın.
  5. Ekle 0.2 μl Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz akademik standartlara ve teknik gerekliliklere uygun olarak profesyonel Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.İlk 8 tüp setine IT mRNA Reajentini ekleyin ve karıştırın.
  6. Oda sıcaklığında 2-5 dakika inkübe edin. (5 dakikadan daha uzun süre inkübe etmeyin).
  7. Transfeksiyon karışımını, HeLa hücre kültürlerinin bulunduğu kuyucuklara damla damla ekleyin (bakınız Şekil 3 (plaka düzenek kurulumu için).
  8. 7 ile 10 arasındaki adımları 2 ile tekrarlayınnd ve 3Sinyal iletimi 8'li tüp setleri.
  9. ... sıcaklığında gece boyunca (16 saat) inkübe edin. 37 °C %5 CO içerisinde2.

7. Gaussia Lüsiferaz (GLuc) Analizi

BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit kullanarak, her kuyucuktaki süpernatantın GLuc aktivitesini şu şekilde analiz edin:

  1. 1,5 ml BioLux GLuc Assay Buffer'a 15 μl BioLux GLuc Substrate ekleyerek taze analiz çözeltisi hazırlayın (numune başına 50 μl analiz çözeltisi gereklidir). Numuneler ve lüminometre enjektörünün ön hazırlığı için yeterli miktarda hazırlayın (üretici talimatlarına bakın).
  2. Tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın (vorteks kullanmayın).

Lüminesans, Berthold Technologies'den Centro LB 960 mikroplaka lüminometresi kullanılarak ölçülür.

  1. Luminometreyi 50 μl enjeksiyon hacmine ve 2-10 saniye entegrasyona ayarlayın.
  2. Her kuyucuktan 10 μl hücre kültürü süpernatantını 96 kuyucuklu siyah bir plakaya ekleyin.
  3. Enjektörü analiz çözeltisi ile hazırlayın ve lüminesans ölçümüne geçin.
  4. Transfekte edilmemiş kuyucuklardan elde edilen değerler negatif kontrol olarak kullanılacaktır.

8. Cypridina Lusiferaz (CLuc) Deneyi

Her kuyucuktan alınan süpernatanttaki CLuc aktivitesini, BioLux Cypridina Luciferase Assay Kit kullanılarak şu şekilde analiz edin:

  1. Kit kılavuzunda verilen talimatlara göre taze rekonstitüe substrat (100x) hazırlayın.
  2. BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer'ı çözdürün ve iyice karıştırın (ışıktan koruyun).
  3. CLuc analiz solüsyonunu hazırlamak için, 1,5 ml BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer'a 15 μl rekonstitüe substrat (100x) ekleyin (numune başına 50 μl analiz solüsyonu gereklidir). Numuneler ve lüminometre enjektörünü hazırlamak için yeterli miktarda hazırlayın (üretici talimatlarına bakın).
  4. Tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın (vortekslemeden).
  5. Solüsyonu 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin (ışıktan koruyun).

Lüminesans, Berthold Technologies firmasından Centro LB 960 mikroplaka lüminometresi kullanılarak ölçülür.

  1. Luminometreyi 50 μl enjeksiyon, 1-2 saniye gecikme ve 2-10 saniye entegrasyon şeklinde ayarlayın.
  2. Her kuyucuktan 10 μl hücre kültürü süpernatantını 96 kuyucuklu siyah bir plakaya ekleyin.
  3. Enjektörü CLuc assay solüsyonu ile hazırlayın ve lüminesansı ölçün.
  4. Transfekte edilmemiş kuyucuklardan elde edilen değerler negatif kontrol olarak kullanılacaktır.

9. Temsili Sonuçlar

T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti, 20 μl'lik reaksiyon başına 180 μg'a kadar başsız (uncapped) RNA ve 40 ila 50 μg başlanmış (capped) RNA üretebilir. Agilent 2100 Bioanalyzer ile analiz edildiğinde, kaliteli ve sağlam RNA, RNA transkriptini temsil eden tek ve keskin bir pik göstermelidir. Geniş bir pik veya birden fazla pik, RNA degradasyonuna işaret eder. Ayrıca RNA boyutunun doğrulanması da önemlidir. Beklenenden daha uzun RNA transkriptleri, kalıp plazmit DNA'sının eksik sindirilmesinden kaynaklanabilir. RNA degradasyonu ve düşük verim, genellikle kalıp DNA'dan reaksiyona karışan kontaminantların bir sonucudur. Şekil 2, yüksek kaliteli ve sağlam RNA'nın Bioanalyzer'da çalıştırılmasıyla elde edilen elektroferogram ve jel görüntüsüne bir örnektir.

Hem kaplı hem de kapsız GLuc RNA ile HeLa hücrelerinin transfeksiyonunu, ardından inkübasyon ve hücre kültürü süpernatantlarının lusiferaz aktivitesi için analiz edilmesi izler. 5' kap yapısı, RNA'yı eksonükleaz yıkımına karşı korumak8 ve mRNA'nın translasyon başlatmasını9 desteklemek için önemlidir. Bu nedenle, RNA kaplama işlemi transfeksiyon deneyleri için temel bir adımdır. Ko-transkripsiyonel (kap analoğu) yöntemi, yaklaşık %80'i kaplanmış 40 μg RNA sağlar. Vaccinia kaplama enzimini kullanan protokol, reaksiyon başına 10 μg RNA'yı (100 nt veya daha büyük) yaklaşık %100 verimlilikle kaplar.

Şekil 4, kepleşmiş ve kepleşmemiş RNA örnekleri ile transfekte edilen kültürler arasındaki lusiferaz ekspresyon farkını göstermektedir. Kepleşmiş RNA ile transfekte edilen hücre kültürlerinin, kepleşmemiş RNA ile transfekte edilenlere (ki bunlar lusiferaz aktivitesi göstermemektedir) kıyasla çok daha yüksek lusiferaz ekspresyonu gösterdiği açıkça görülmektedir. Ayrıca Şekil 4, hem kep analoğu kullanımının hem de Vaccinia kepleme enziminin kullanımının, proteine çevrilebilen fonksiyonel, kepleşmiş RNA transkriptlerini başarıyla ürettiğini doğrulamaktadır. t-testinden elde edilen iki kuyruklu p-değeri 0,2583'tür ve bu durum, iki kepleme yönteminden elde edilen lüminesans verileri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığını göstermektedir.

T7 transkripsiyon diyagramı; DNA kalıbı, RNA transkripti; nükleotid dizilimi süreci.

Şekil 1A. T7 RNA Polimeraz ile RNA Sentezi

pCMV-GLuc'un 5764 bp'lik plazmit haritası diyagramı; gen ekspresyonu, klonlama vektörleri, restriksiyon bölgeleri.
Şekil 1B. GLuc geni ve T7 promotörü içeren pCMV-GLuc vektörü.

RNA kromatografisi sonuçları; uç grupları korunmamışa karşı korunmuş RNA analizi; elektroforez şeması.
Şekil 2. Korunmuş ve uç grupları korunmamış RNA'ların Bioanalyzer elektroferogramları ve jel görüntüsü. X-ekseni RNA boyutunu nükleotid (nt) cinsinden göstermekte, Y-ekseni ise floresan birimlerini (FU) temsil etmektedir. A) Saflaştırma sonrası GLuc mRNA (korunmamış) elektroferogramı. B) GLuc mRNA (Vaccinia capping enzimi ile korunmuş) elektroferogramı. C) GLuc mRNA (kap analoğu kullanılarak ko-transkripsiyonel olarak korunmuş) elektroferogramı. D) Bioanalyzer tarafından oluşturulan jel benzeri görüntü. 'L' şeridi RNA merdiveni, Şerit 1 korunmamış GLuc mRNA, Şerit 2 kap analoğu kullanılarak korunmuş GLuc mRNA ve Şerit 3 Vaccinia capping enzimi kullanılarak korunmuş GLuc RNA'dır.

Gen ekspresyon deneyi için plaka düzeni diyagramı; örnek türleri: kapaksız/kapaklı GLuc ve CLuc.
Şekil 3. HeLa hücre transfeksiyonu için plaka kurulum örneği. Her kuyucuk, %60-90 konfluensle ekilmiş HeLa hücrelerinden oluşmaktadır. Uygun GLuc RNA (kapaksız, kapak analoğu ile kapaklanmış veya Vaccinia kapaklama enzimi ile kapaklanmış), normalizasyon için kapaklı CLuc RNA, mRNA Boost Reagent ve TransIT mRNA Reagent içeren transfeksiyon karışımı her kuyucuğa eklenir. Her transfeksiyon, 8 tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir (şekildeki aynı renkli kuyucuklar).

Normalize edilmiş lüminesans sütun grafiği; GLuc RNA kapaklı ve kapaksız; RNA analiz sonuçları.
Şekil 4.HeLa hücrelerinde GLuc ekspresyonu. Saflaştırılmış kapaklı ve kapaksız GLuc mRNA HeLa hücrelerine transfekte edilmiş ve 37 °C'de gece boyunca (16 sa) inkübe edilmiştir. Her kuyucuktan alınan hücre kültürü süpernatantları GLuc ve CLuc aktivitesi açısından analiz edilmiş ve lüminesans değerleri kaydedilmiştir. GLuc lüminesans değerleri, kapaklı CLuc RNA'sının lüminesans değerlerine göre normalize edilmiştir.

GLuc lüminesans oranı formülü, lüminesans ölçümü, normalize edilmiş değerler için denklem, RLU.

* Normalizasyon öncesinde, transfekte edilmemiş hücrelerden gelen lüminesans, GLuc ve CLuc değerlerinden çıkarılmıştır.

Ticari Markalar

BioLux, New England Biolabs, Inc.'in tescilli markasıdır.

TransIT, Mirus Bio LLC'nin tescilli ticari markasıdır.

MEGAclear, Ambion'un bir ticari markasıdır.

Tartışma

In vitro transkripsiyon, çeşitli uygulamalar için yüksek verimli RNA elde etmek amacıyla kullanılan kullanışlı bir yöntemdir. T7 High Yield RNA Synthesis Kit kullanımının temel avantajı, formülasyonunun yüksek RNA verimi elde etmek üzere optimize edilmiş olmasıdır. Ayrıca, kit içerisinde sağlanan reaktifler kontamine nükleazlar içermez; bu da yüksek kaliteli ve sağlam RNA transkriptlerinin sentezlenmesini sağlar. Kit, mRNA, boya işaretli RNA, yüksek spesifik aktiviteli radyolojik işaretli problar ve kaplı RNA sentezlemek için kullanılabilecek şekilde yüksek stabilite ve esneklik için tasarlanmıştır. Kit kılavuzu, bu uygulamaların her biri için gerekli olan spesifik protokollerin ve ek materyallerin bir listesini içerir. Ayrıca, transkripsiyon için kalıp olarak PCR ürünlerinin ve sentetik DNA oligonükleotitlerinin kullanımına ilişkin teknik bilgiler de sunmaktadır. Transkripsiyon kitinin yalnızca T7 promoter içeren DNA kalıplarını kullanabildiği unutulmamalıdır.

Bu makalede açıklanan yöntem, Vaccinia capping enzimi kullanılarak yapılan transkripsiyon sonrası RNA capping işleminin yanı sıra, RNA cap yapısı analoğu kullanılarak yapılan ko-transkripsiyonel capping işlemini göstermektedir. Her iki yöntemin de transfeksiyon sonrası fonksiyonel olarak aktif olan capped RNA sentezlediğini göstermiş bulunmaktayız. 5' cap yapısı, RNA stabilitesini ve translasyon verimliliğini artırır, bu nedenle mikroenjeksiyon11 ve transfeksiyon7 deneyleri için önemlidir. Ko-transkripsiyonel capping yöntemi, yaklaşık %80 oranında capped olan 40-50 μg RNA üretir. m7G'nin 3'-hidroksil grubu bloklanmış olan 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA cap analoğunun (ARCA) kullanımının, cap yapısının doğru oryantasyonda eklenmesini sağladığını17 belirtmek önemlidir. Daha büyük miktarlardaki RNA'ları caplemek için, her iki capping yöntemi için de standart reaksiyonların ölçeği artırılabilir. Ancak, ko-transkripsiyonel capping'in nispeten pahalı bir bileşen olan cap analoğunu kullanması nedeniyle, Vaccinia Capping Sistemi maliyet açısından daha uygulanabilir bir seçenektir. Vaccinia Capping Sistemi, capping verimliliği neredeyse %100 olduğu için aynı zamanda daha iyi bir yöntemdir.

Yukarıda açıklanan RNA capping yöntemleri, 5' ucunda cap 0 yapısına sahip RNA sentezler. Cap 1 yapısı, RNA'nın 5' ucundaki ilk nükleotidin riboz şekerinin 2'-O konumunda ek bir metilasyonu içerir. Cap 1 yapısının RNA translasyon verimliliğini artırdığı bildirilmiştir18 ve 2'-O-Metiltransferaz kullanılarak dahil edilebilir20, 21.

Bu makalede açıklanan yöntem, istenilen herhangi bir mRNA'nın transkripsiyonu, kapsama (capping) ve transfeksiyona tabi tutulması için kullanılabilir. Bu protokolde, sundukları birçok avantaj nedeniyle özellikle GLuc ve CLuc lüsiferazları kullanılmıştır. Bu proteinler doğrudan hücre ortamına salgılandıkları için hücre lizizi ihtiyacını ortadan kaldırırlar. Ayrıca, yüksek biyolüminesans sinyal yoğunluğu üretirler ve aktivite analizleri oldukça hassas olup kolayca gerçekleştirilebilir. Hücrelerdeki GLuc ekspresyonunun, RNA'nın kendi işlevselliği dışındaki çeşitli faktörlerden etkilenebileceğini belirtmek önemlidir. Pipetleme hataları, kuyuk başına değişen hücre sayıları ve transfeksiyon verimliliği gibi durumlar buna örnektir. Bu faktörleri dengelemek için veri normalizasyonu kullanılır. Protokolümüzde, GLuc RNA'sı ile birlikte bir iç kontrol olarak CLuc RNA'sını ko-transfekte ediyoruz. GLuc lüminesan değerleri, CLuc kontrol değerlerine bölündüğünde, transfeksiyondaki hatalar ve değişkenlikler için normalize edilmiş olur19.

Açıklamalar

Tüm yazarlar New England Biolabs, Inc. çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
T7 Yüksek Verimli RNA Sentez KitiNew England BiolabsE2040S
3’-0-Me-m-7G(5’)ppp(5’RNA Kep Yapısı Analogu New England BiolabsS1411S
DNase I (RNaz içermeyen)New England BiolabsM0303S
Vaccinia Kepliyleme SistemiNew England BiolabsM2080S
MEGAclear KitiAmbionAM1908
NanoDrop SpektrofotometreThermo Fisher Scientific, Inc.
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent Technologies5067-1511
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AA
TransIT mRNA Transfeksiyon Kiti Mirus Bio LLCMIR2250
HyClone* Klasik Sıvı Besiyeri: Dulbecco’Modifiye Eagle ortamı’Medium, Yüksek Glukozlu BesiyeriThermo Fisher Scientific, Inc.SH30285.01
HyClone Temel Olmayan Amino AsitlerThermo Fisher Scientific, Inc.SH30238.01
Centro LB 960 Berthold Technologies
BioLux Gaussia Lusiferaz Analiz KitiNew England BiolabsE3300S
BioLux Cypridina Lusiferaz Analiz KitiNew England BiolabsE3309S
RNaz İnhibitörü, Murine New England BiolabsM0314
RNaz İnhibitörü, İnsan PlasentasıNew England BiolabsM0307
pCMV-GLuc Kontrol PlazmidiNew England BiolabsN8081

Kaynaklar

  1. Lazarev, D., Manley, J. L. Concurrent splicing and transcription are not sufficient to enhance splicing efficiency. RNA. 13, 1546-1557 (2007).
  2. Donze, O., Picard, D. RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7. RNA Polymerase. Nucl. Acids Res. 30, 10-46 (2002).
  3. Van Gelder, R. N. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
  4. Schneider, J. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5, 29-29 (2004).
  5. Conry, R. M. Characterization of a messenger RNA polynucleotide vaccine vector. Cancer Research. 55, 1397-1400 (1995).
  6. Huang, F., Wang, G., Coleman, T., Li, N. Synthesis of adenosine derivatives as transcription initiators and preparation of 5′ fluorescein- and biotin-labeled RNA through one-step transcription. RNA. 9, 1562-1570 (2003).
  7. Warren, L. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  8. Furuichi, Y., LaFiandra, A., Shatkin, A. J. 5'-Terminal structure and mRNA stability. Nature. 266, 235-239 (1977).
  9. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. 2, 277-298 (2011).
  10. Lewis, J. D., Izaurflde, E. The Role of the Cap Structure in RNA Processing and Nuclear Export. Eur. J. Biochem. 247, 461-469 (1997).
  11. Inoue, K., Ohno, M., Sakamoto, H., Shimura, Y. Effect of the cap structure on pre-mRNA splicing in Xenopus oocyte nuclei. Genes Dev. 3, 1472-1479 (1989).
  12. Martin, S. A., Paoletti, E., Moss, B. Purification of mRNA guanylyltransferase and mRNA (guanine 7-)methyltransferase from vaccinia virus. J. Biol. Chem. 250, 9322-9329 (1975).
  13. Martin, S. A., Moss, B. Modification of RNA by mRNA guanylytransferase and mRNA (guanine-7-)methyl-transferase from vaccinia virions. J. Biol. Chem. 250, 9330-9335 (1975).
  14. Shuman, S., Moss, B. Purification and use of vaccinia virus mRNA capping enzyme. Meth. Enzymol. 181, 170-180 (1990).
  15. Thiel, V., Herold, J., Scelle, B., Siddell, S. G. Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus. J. Gen. Virol. 82, 1273-1281 (2001).
  16. Marcotrigiano, J., Gingras, A. -C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cocrystal Structure of the Messenger RNA 5′ Cap-Binding Protein (eIF4E) Bound to 7-methyl-GDP. Cell. 89, 951-961 (1997).
  17. Stepinski, J. Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl (3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy) GpppG. RNA. 7, 1486-1495 (2001).
  18. Kuge, H., Brownlee, G. G., Gershon, P. D., Richter, J. D. Cap ribose methylation of c-mos mRNA stimulates translation and oocyte maturation in Xenopus laevis. Nucl. Acids Res. 26, 3208-3214 (1998).
  19. Schagat, T., Paguio, A., Kopish, K. Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations for Increasing Consistency and Statistical Significance. Cell Notes. 17, 9-12 (2007).
  20. Barbosa, E., Moss, B. mRNA (nucleoside-2'-) - methyltransferase from Vaccinia Virus. J. Biol. Chem. 253, 7698-7702 (1978).
  21. Lockless, S. W. Recognition of capped RNA substrates by VP39, the vaccinia virus-encoded mRNA cap-specific 2'-O-methyltransferase. Biochemistry. 37, 8564-8574 (1998).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

RNA KeplendirmeT7 Yüksek Verimli RNA Sentez KitiVaccinia Keplendirme EnzimiKep Analogu YöntemiLüsiferaz Aktivite AnaliziRNA SaflaştırmaNanoDrop Kantifikasyonu
HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.