Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Tarafından tahıl çürüyen tohum bulaşmasını mantarların insan ve hayvan sağlığı için ciddi riskler söz değil, tahıl üretimini dünya çapında büyük ekonomik mücadelelerinden birisidir. Tahıl üretimi arasında, mısırın tahıl bütünlüğü ve mikotoksin tohum kontaminasyon patojen kaynaklı zararlar nedeniyle, belki de en çok etkilenen üründür. Mısırdan yetiştiricileri ve gıda ve yem işlemciler için iki en yaygın ve sorunlu mikotoksinler sırasıyla Aspergillus flavus ve Fusarium verticillioides tarafından üretilen aflatoksin ve fumonisin, vardır.
Moleküler bitki-patojen ilişkileri son yıllarda yapılan çalışmalara mantar enfeksiyonu ve mikotoksin kontaminasyonu 1,2,3,4,5,6 için bitki cevabı ile birlikte özel mekanizmalar anlamada umut göstermiştir. Birçok laboratuvar bitki-patojen ilişkileri incelemek için çekirdek testleri kullandığınızdan, farklı biyolojik parametreleri hesaplamak için bir standart yöntem için bir ihtiyaç, bu nedenle oradaFarklı laboratuvarlarda elde edilen sonuçlar çapraz yorumlanabilir. Tohumlar üzerinde kantitatif analiz için sağlam ve tekrarlanabilir araçlar için, mantar üremesi, biyokütle, ve mikotoksin kirliliği ölçmek için in-lab çekirdek testleri ve sonraki yöntemleri geliştirmişlerdir. Dört sterilize darı çekirdekleri bir fungal süspansiyon (10 6) ile cam şişe içinde aşılanmış ve önceden belirlenmiş bir süre boyunca inkübe edilir. Numune şişeleri daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), bir AflaTest florimetre yöntemi kullanılarak aflatoksin miktar ve HPLC ile fumonisin kantifikasyon tarafından hemositometre, ergosterol tabanlı biyokütle analizi ile Konidyumların sayımı için seçilir.
Protokol
1. Mısırda Çekirdek Biyoassay
- İki hafta önce, kültür 28. Patates Dekstroz Agar (PDA) üzerinde fungal patojenlere ° C
- Onlar biyoassay şişeleri alt hizasına, ve 50 ml falcon tüpleri yer yatıyordu nedenle tercihen yassı, benzer büyüklüğü ve şekli ile çekirdekler seçin. Seçilen çekirdeklerde benzer tohum yaşı ve metaboliti kompozisyonu sağlamak için aynı ortamda aynı anda yapılmış olmalı.
- 6% sodyum hipoklorit ile% 70 etanol, steril su ile 1 dakika ile 10 dakika ile 5 dakika için oda sıcaklığında tüpler çalkalayarak çekirdekler sterilize yüzey. Devam sallayarak ise steril su ile, her zaman 5 dakika, üç kez yıkayın. Otoklavlanmış havlu kuru P....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada anlatılan yöntemler kapsamlı test ve fungal kolonizasyon, sporogenesis ve mikotoksin üretimi için ölçülebilir sonuçlar nesil sağlam olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, bu yöntemler mycotoxigenic mantarların (örn. yer fıstığı, buğday, pamuk, fıstık vb) ile kontaminasyon duyarlı olan diğer bitki türlerinin tohumları için geçerli olmalıdır. Yetkili bitki-patojen etkileşimi analizleri için, tohumların yaşatılması şarttır. Tohum canlılığını korurken çekirdeğin embriyo tarafında küçük bir yara yeri enfeksiyonu kolaylaştı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Ben ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz onların teknik yardım Brandon Hassett ve Carlos Ortiz teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Dr Michael Kolomiets için NSF hibe İOK-0544428, IOS-0951272, ve IOS-0925561 tarafından desteklenen edildi ve Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü (NIFA), AFRI Bitki Yetiştirme ve Eğitim Bursu # 2.010-85.117 tarafından -20.539 DRS. Seth Murray, Thomas Isakeit ve Michael Kolomiets.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | # Kataloğa | |
| Patates Dekstroz Agar | Fisher Scientifc | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 | |
| Plastik inkübasyon konteyner | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Karıştırıcı | Vicam | 20200 | |
| 24 cm Yivli Filtre Kağıtları | Vicam | 31240 | |
| 1.5 mikron cam mikrofiber | Vicam | 31955 | |
| Afla Testi sütununda | Vicam | G1024 | |
| Afrla Testi Geliştirici | Vicam | 32010 | |
| Metanol | Vicam | 35016 | |
| Asetonitril | Fisher Scientifc | AC14952-0025 | |
| Etanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 | |
| C-18 katı faz ekstraksiyon kolon (Hazırlık Eylül SPE C18 Sütun) | Fisher Scientifc | 60108-304 | |
| O-fitalaldehit (OPA) | Sigma Chemical Co | 79.760-5g | |
| Asit borik | Fisher Scientifc | BP168-500 | |
| Sodyum borat | Fisher Scientifc | RDCS0330500 | |
| Merkaptoetanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 | |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pompa) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc | LC-20AT | |
| Zorbax ODS kolon (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl floresans dedektör | Shimadzu Scientific Instruments, Inc | RF-10AXL | |
| Sodyum fosfat | Fisher Scientifc | AC38987-0010 | |
| FB1 standartları | Sigma Chemical Co | F1147-1mg | |
| Kloroform | VWR | MK444410 | |
| 0,45 um Naylon zar (HPLC) ile 13 mm şırınga filtresi | Pall Hayat Bilgisi | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45.480-50G-F | |
| Sintilasyon şişeleri | VWR | 66021-602 | |
| Sodyum klorür | Vicam | G1124 |
Kaynaklar
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
