Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Özet

Son zamanlarda yüksek verimlilik sıralama teknolojisi büyük ölçüde Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) deney duyarlılığı artmış ve saflaştırılmış hücreleri veya disseke doku kullanarak uygulama açtı. İşte biz ChIP tekniği kullanılacak bir yöntem tasvir Drosophila doku.

Özet

Epigenetik hızla gelişen bir alan kalır kromatin devletin farklı gelişim aşamalarında farklı hücre tiplerinde farklı gen ifadesini nasıl katkıda çalışmaları. Epigenetik düzenleme yetişkinlikte embriyonik gelişimi ve homeostazı sırasında hücresel farklılaşma da dahil olmak üzere biyolojik süreçleri, geniş bir yelpazede katkıda bulunur. Epigenetik çalışmalar eleştirel bir strateji çeşitli histon modifikasyonları ve kromatin faktörleri gen ifadesinin düzenlenmesine nasıl incelemektir. Bu adres için, Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) ilgi hücrelerde DNA ile belirli faktörlerin dernek bir enstantane elde etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.

ChIP tekniği yaygın olarak tekrarlanabilir verileri oluşturmak için bolluk ve homojenlik elde edilebilir malzeme, başlangıç ​​olarak kültür hücreleri kullanır. Bununla birlikte, birçok uyarılar vardır: İlk olarak, Petri tabağına hücrelerinin büyümesini ortamı, böylece, in vivo olarak farklı olan olabiliryaşayan bir organizma hücrelerin endojen kromatin devlet yansıtmamaktadır. İkinci olarak, hücreler değil, her türlü kültürü ex vivo olabilir. Insan ChIP tayini için yeterince malzeme edinebilecekleri hücre dizileri sadece sınırlı sayıda vardır.

Burada Drosophila dokuları kullanarak ChIP deney yapmak için bir yöntem tarif. Başlangıç ​​malzemesi böylece doğru endojen kromatin devlet yansıtabilir, yaşayan bir hayvan dokusu diseke edilir. Dokusu çok farklı tipleri ile bu yöntemin uyum araştırmacılar biyolojik olarak daha bir çok in vivo ^{1, 2,} epigenetik düzenleme konusunda ilgili soruları sağlayacaktır. Yüksek verimlilik sıralama (ChIP-seq) ile bu yöntemi birleştirerek daha araştırmacı bir epigenomic manzara elde sağlayacaktır.

Protokol

(Tüm ChIP prosedürü yaklaşık iki gün sürer. Yüksek verimlilik sıralaması için ChIP kütüphaneler hazırlanması 2-3 gün sürer.)

1. Inceleyin ve ChIP Experiment (~ 1 milyon hücre) için doku hazırlanması

1. Soğuk PBS + 1x proteaz inhibitörleri (7x stok solüsyonu elde etmek için 1.5 ml 1x PBS içinde proteaz inhibitörü kokteyl 1 pelet erimesi) de (Drosophila testislerin örneğin 200 çift) ilgi doku teşrih + PMSF (son konsantrasyonu 100 mikrogram / ​​ml). Iki doku durulama ve inhibitörleri ile aynı PBS çözeltisinden 200 uL doku içinde yeniden süspanse.
2. Örnek düzeltmek için, 5.5 uL% 37 formaldehit (37 kullanmadan önce 1 dakika ° C su banyosunda sıcak formaldehit) ekleyin. 15 dakika, vorteks arasındaki her 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
3. 2 dakika yerleşmek için doku için buz üzerinde örnek yerleştirin. 450 uL PBS (proteaz inhibitörleri ve PMSF ile) 2x durulayın. Örnek şimdi deposu olabilir-20 ° C'de d ChIP için yeterli malzeme elde etmek diseksiyon birkaç kez tekrarlayın.

2. ChIP Assay için protein-DNA Konjugasyon ile Süpernatant hazırlayın

1. Bir 1.75 ml Eppendorf tüp adım 1.3 yeterince örnek birleştirin.
2. Doku örneği PBS çıkarın. 200 lizis tamponu uL (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM CaCl2,% 0.2 Triton X-100 veya NP-40, 5 mM butirat, ve 1x proteinaz inhibitörü kokteyl). Ekleme Lizis tamponu (0.5 mM PMSF final konsantrasyon) taze PMSF stok çözeltisi ekleyin. Dokular 10 dakika RT (Oda sıcaklığı) 'de inkübe herhangi bir toplama olmadan, tamamen ayırmak kadar mavi homojenizör (Fisher Kedi # 749521-1590) ile homojenize edilir.
3. Sonikasyon: güç 20 kullanım mikrotip sonikatör (Misonix HS-XL200). 50 sn için buz üzerinde 10 sn ve dinlenme sonikasyon. (Uzun sonication küçük parçalara verecektir optimal sonication zaman, ampirik olarak belirlenmelidir. Histon karşı antikorlar kullanılarak ChIP için 4-5 kez tekrarlayınE değişiklikler, normalde yaklaşık 200-300 bp kromatin ses dalgalarına maruz; transkripsiyon faktörü veya kromatin regülatörü (örneğin Polycomb proteinler) için, biz normalde 200-1000 bp kromatin ses dalgalarına maruz. Bununla birlikte, uygun parçası boyutu ampirik olarak test edilmelidir. Not: HER ZAMAN DAHA YUKARI ISITMA DAN ÖRNEK ÖNLEMEK İÇİN SONICATING SIRASINDA BUZ ÜZERİNDE TÜP TUTUN!
4. 1,8 mL RIPA tamponu (ekleyerek Örnek 10 seyreltilir tarif edildiği gibi mM Tris-HCl, pH 7,6, aynı konsantrasyonda proteaz inhibitörleri ve PMSF ile 1 mM EDTA,% 0.1 SDS,% 0.1 Na-deoksikolat,% 1 Triton X-100, Daha önce). 65 2 uL 5M NaCl ve inkübe ekleyerek giriş kontrol olarak 40 uL kaydet ° C kroslink tersine çevirmek için (O / N) gece.
5. Boncuk antikor eşlenik için, 1.5 ml Eppendorf tüpüne 40 uL Protein A boncuk ekleyin, daha sonra, 2 dakika süreyle 4 ° C'de 600 uL PBS ve kaya eklemek mıknatıs boncuk uygulamak ve supernatant çıkarın. 100 PBS uL ve ilgi antikoru ekleme (antikor miktarını empir tespit edilmelidirically). 4 saat için 1 saat ya da 4 ° C için oda sıcaklığında inkübe edilir.
6. Mıknatıs tarafından boncuklar süpernatantı ve adım 2.4 boncuk 1mL kromatin ekstresi ekleyin. 4 at ° çevirin CO / N
7. Mıknatısa ChIP örnek uygulayın ve supernatant çıkarın. 10 dakika her biri için şu da 4 ° C tampon ile yıkanır boncuklar:
   RIPA tamponu 1 mL 2x [1,89 mL 'RIPA tamponu' + ​​315 uL 7x proteaz inhibitörleri + 20 uL PMSF];
   RIPA tamponu 1 mL 2x + 0.3 M NaCl [1,89 mL RIPA tamponu + 220 uL 3 M NaCl];
   LiCI tamponu 1 mL (0.25 M LiCI,% 0.5 NP40,% 0.5 NaDOC) ile 2x;
   1x 1x TE 1 mL +% 0.2 Triton X-100;
   1x TE 1 mL ile 1x.
   
8. Çapraz bağ tersine çevirmek, 100 uL TE tampon içinde yeniden süspanse boncuklar + 3 uL% 10 SDS + proteinaz K (20 mg / mL) içindeki 5 ul. 65 inkübe ° CO / N
9. Mıknatıs boncuk uygulayın ve yeni bir tüpe süpernatant aktarın. Süpernatant SİZİN DNA ÖRNEĞİ CONTAINS. 100 uL TE + 0.5 M ile boncuk yıkayınNaCl ve iki süpernatan birleştirmektedir.
10. Fenol-kloroform DNA örneği ayıklayın. Kloroform: 200 ul Fenol ekle IAA (25:24:1) karışımı ve girdap. RT 5 dakika 14k döndürme. Alternatif olarak, DNA Qiagen PCR saflaştırma kiti kullanılarak elde edilebilir.
11. Yeni bir tüp içine süpernatan / sulu katman transferi ve 20 ug / mL (Alternatif olarak 20 mg / süpernatan her 1 mL için mL 'de glikojen 1 ul'lik bir son konsantrasyon elde etmek lineer akrilamid eklemek de kullanılabilir. Glikojen için kullanılır Doğrusal akrilamid deneyleri sekanslama için kullanılır ise sonraki qPCR veya PCR analizi.) 3M NaOAc 20 uL ve 500 uL% 100 EtOH ekleyin. İyice karıştırın ve 80 inkübe ° C'de 10 dakika. 4 azından 20 dakika için maksimum hızda dönerler ° C.
12. Süpernatantı ve 300 uL% 70 EtOH ile yıkayın. 50 uL TE tamponunda hava kuru ve Pastör pipetiyle örnek. Örnek şimdi -20 ° C'de saklanabilir Örnek kantitatif PCR (qPCR) testi (Şekil 1) için kullanılabilir.

3. ChIP-ed DNA analiz

3a. QPCR kullanarak ChIP-ed DNA analiz

1. Seyreltilmemiş, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000: Bir standart eğri yapmak için aşağıdaki konsantrasyonda genomik DNA sulandırınız.
2. Her primer çifti için, adım 3a.1, giriş kontrol ve ChIP-ed DNA genomik DNA ile 96-plaka olarak iki nüsha halinde qPCR kurmak:
   10 uL 2x SYBR PCR karışımı (Fermentas, K0222);
   1 ileri uL 10 uM astar;
   1 uL 10 uM ters astar;
   x uL ChIP-ed DNA (giriş kontrolü, ya da genomik DNA);
   y uL nükleaz içermeyen H ₂ O 20 uL için tepki seviyesini ayarlamak için.
   
3. Mini plaka spinner (Labnet) ile 96-plaka aşağı Spin.
4. Aşağıdaki koşul kullanarak ABI 7300 gerçek zamanlı PCR sistemi (veya diğer gerçek zamanlı PCR sistemi) ile qPCR gerçekleştirin:
   Aşama 1: 50 ° 2 dakika, 1 döngüsü için C;
   Aşama 2: 95 10 dakika, 1 döngüsü için ° C;
   Aşama 3: 95 ° 15 s, 60 ° C'de 1 dakika süreyle C, 40 ° Cycles;
   4. Aşama (ayrılma aşaması): 95 ° 15 s, 60 C ° 1 dakika, 95 C ° 15 s C.
   
5. Disosiasyon eğrisi kontrol edin: termal ayrışma arsa az bir tepe PCR reaksiyonu tek bir amplikon göstermektedir. Birden fazla pik primer çifti ile spesifik olmayan ürün gösterir, qPCR veri kullanılmamalıdır.
6. 3a seyreltilmiş genomik DNA dizisi kullanılarak standart eğri dayanmaktadır Ct (döngüsü eşik) değerine göre DNA miktarı gideren bir formül hesaplanarak, her bir primer seti için PCR reaksiyon üstel amplifikasyon doğrusal faz belirler. 1.
7. ChIP-ed DNA ve giriş kontrol Ct değeri Ct değeri lineer aralığında ise, ChIP-ed DNA ve 2.4 giriş kontrol sulandırma faktörüne göre, ChIP-ed DNA karşı giriş zenginleştirme hesaplayabilirsiniz.

3b. Yüksek verimlilik sıralaması için ChIP-ed DNA'yı çoğaltmak.

1. ChIP-ed DNA karışımı sonu-onarım (kullanınBuz üzerinde kurmak Epicentre DNA SON tamir kiti):
   Adım 2.12 (0,1-5 ug) 1-34 ul genomik DNA
   5 ul 10x Sona onarım tampon
   5 ul 2.5 mM dNTP karışımı
   5 ul 10 mM ATP
   x ul H ₂ O 49 ul için tepki seviyesini ayarlamak için
   1 ul End-Onarım enzim karışımı (T4 DNA Polimeraz + T4 Polinükleotid Kinaz)
   Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Qiagen MinElute Reaksiyon kullanarak reaksiyon arındırın
   Temizleme kiti. 30 ul Elüsyon Buffer (EB) in Zehir.
   
2. 3 'ucuna A-çıkıntılar ekleme:
   Adım 3b.1 gelen Elüsyonlanan DNA ürün 30 ul
   5 ul 10x NEB Tampon # 2
   10 ul 1 mM dATP
   2 ul dH ₂ O
   3 ul 5 U / ml Klenow Fragment (3 '→ 5' exo-)
   37 de 30 dakika inkübe ° C. MinElute ReactionCleanup kiti kullanılarak reaksiyon arındırın. 10 ul EB Zehir.
   
3. Solexa bağlayıcı ligasyonu:
   Adım 3b.2 gelen Elüsyonlanan DNA 10 ul
   10 ul GKD ₂ O
   2.5 μ l 10x T4 DNA ligaz tamponu
   Illumina 1 ul Adaptör oligo karışımı (stoktan 1/10-diluted)
   2,5 ul T4 DNA ligaz (400 ünite / ul)
   RT az 1 saat inkübe edin. MinElute ReactionCleanup kiti kullanılarak reaksiyon arındırın. 20 ul EB Zehir. Örnek şimdi -20 ° C'de saklanabilir
4. E-jel aparat kullanarak adım 3b.3 gelen Yıkanan DNA örneği çalıştırın. Jel 300-500 bp bant yalıtmak ve Qiagen Jel Ekstraksiyon kiti (bu adım adaptörü oligo ligasyonu ile ~ 125 bp kendine bağlanan linkerler ortadan kaldırır) kullanarak arındırmak. 12 ul EB Zehir.
   
5. Illumina kütüphane eşleştirilmiş uç kullanarak (PE) primerleri Amplify:
   Adım 3b.4 gelen Elüsyonlanan DNA 10.5 ul
   Master miks 12.5 ul (2X Phusion HF, Finnzymes)
   PE1 PCR primer 1 ile 1 ul
   PE2 PCR primer 2 arasında 1 ul
   PCR koşulları:
   98 ° C'de 30 sn
   (98 ° C'de 10 saniye, 65 ° C'de 30 saniye, 72 ° C'de 30 sn), tekrar 20 döngü
   5 dakika süreyle 72 ° C.
   
6. Adım 3b.5 Örnekler 2 standardı% agaroz jel kullanılarak uygun büyüklükte DNA (300-500 bp) seçildikten sonra ChIP-SEQ için de kullanılabilir. Örnek şimdi -20 ° C'de saklanabilir Bu kirliliği önlemek için tek bir jel her ChIP örnek izole etmek en iyisidir. Örnekler yüksek verimlilik sıralaması için sunulabilir.

3c. Solexa boru hattı analizi

1. 25-bp sıralama okur Illumina Genome Analyzer (GA) boru hattından elde edilmiştir.
2. Tüm okuma referans dizi ile iki uyumsuzlukları kadar izin Eland (Nükleotid veri Verimli Yerel Hizalama) yazılımını kullanarak Drosophila genomu (dm3) hizalanmış edildi.
3. Eşsiz eşlenen okuma aşağı analiz için muhafaza edildi. Birden fazla özdeş okuma için, üç adede kadar kopya PCR gelen önyargıları olasılığını azaltmak için muhafaza edildi.
4. GA Boru Hattı'nın çıkış tarayıcı genişletilebilir veri (BED) dosyalarını dönüştürüldü.
5. Üretmek içingörüntülenmesi için UCSC tarayıcısına yüklemek için wig dosyaları, bu pencere boyutu olarak 4 bp ve DNA fragmanı boyut olarak 160 bp'lik bir önceki yayın ³ tarif edilmiştir python kese kullanılır.
6. Sessiz ve dile getirdikleri genlerine Drosophila genlerin sınıflandırmak için, RPKM adında bir dijital sayı (kilobaz başına / exonic bölge birleşti / milyonda eşlenmiş okur okur) kullanılır. RPKM = 0 ile Genler RPKM ≥ 1, düşük orta ve yüksek düzeyleri ile genler olmak üzere üç gruba ayrılabilir ifade gruplar ayrıldı ile sessiz grubu ve genler olarak sınıflandırılmış ve her bir grup yaklaşık aynı sayıda edildi genler.
7. Histon modifikasyonu düzeyi ve gen ekspresyonu karşılaştırmak için, bir önceki yayının ³ tarif edilmiş bir python komut dosyası kullanılır.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Bam kullanarak ChIP-qPCR sonuçları örnekleri (mermer torba) mutant Şekil ⁴ testisler 1 'de gösterilmiştir. Bam testislerde proliferatif spermatogonia gelen spermatositler ^{5, 6} ayırt geçişte bir başarısızlık var. Bu doku tipi bakımından zengindir ve indiferansiye germ hücreleri için bir kaynak olarak bam testisler kullanın. Böyle erkek özgü transkripsiyon faktörü 87 (mst87F), don juan (dj), ve bulanık soğan (FZO) sperm farklılaşması için gerekli Farklılaştırma genler, bam testis ifade değildir. Bu genler çok baskıcı H3K27me3 histon modifikasyonu ⁷ (Şekil 1A) ile zenginleştirilmiş, ancak aktif H3K4me3 histon modifikasyonu ⁸ (Şekil 1B), biz 'monovalan' ⁷ adlı bir kromatin imza yoksun edilir. H3K27me3 ya da H3K4me3 zenginleştirilmesi, bir yapısal olarak ifade siklin A (CycA) gen ^{4 ila} normalizasyon tarafından belirlenir.

bam mutant testisler (Şekil 2) Şekil 1'de gösterildiği qPCR sonuçlar doğrulanmıştır. üç test terminal farklılaşma genler için mst87F, dj ve FZO ile antikor aynı set (yani baskıcı H3K27me3 ve aktif H3K4me3) kullanarak içerik "> ChIP-seq analizi , bunların genomik bölgeleri yüksek H3K27me3 ancak H3K4me3 (Şekil 2A-2C) zenginleştirilmiş. Bunun aksine, yapısal olarak ifade CycA geni önemli H3K4me3 ancak transkripsiyon başlama sitesi (TAD) (Şekil 2B) yakınında az H3K27me3 bağlayıcı sahiptir.

Ayrıca, gen hariç dört sınıfın trafik ayırım şeritleri yakın H3K27me3 ve H3K4me3 ve ChIP profilleri, her histon modifikasyonu işlevi ile uyumludur. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, trafik ayırım şeritleri arasında H3K27me3 mansap zenginleşmesi ile ters gen ifadesi seviyesi ile ilişkilidir. Sessiz genler ise en yüksek H3K27me3 varyüksek genlerin hiçbir H3K27me3 bağlayıcı var. Bu veriler, gen ekspresyonu H3K27me3 baskıcı rolü ile tutarlıdır. Bunun aksine, trafik ayırım şeritleri etrafında H3K4me3 zenginleştirilmesi gen ifadesi üzerindeki H3K4me3 aktif rolü ile tutarlıdır gen ifadesi seviyesi (Şekil 3B) ile ters korelasyon gösterdi.

Ya da baskıcı H3K27me3 histon modifikasyon (A) veya (B) bam hücre-zenginleştirilmiş andiferansiye mutant testisler aktif H3K4me3 histon modifikasyonu karşı antikor kullanılarak ChIP-ed DNA Şekil 1. QPCR analizi. (A) bam ise testisler, farklılaşma genler (Mst87F, dj, FZO) H3K27me3 baskıcı histon modifikasyonu ile zenginleştirilmiştir. (B) Farklılaştırma genler H3K4me3 aktif işareti ile tükenmiş. Hedef gen (Mst87F, dj ya FZO) at ChIP DNA düzeyi (ChIP DNA / girdi) ilk lev normalize edildi Kontrol CycA geninde ChIP DNA el. Hata çubukları üç bağımsız biyolojik, standart sapma çoğaltır göstermektedir.

Şekil 2. UCSC genom tarayıcı H3K27me3 anlık ve (A) Mst87F (B) DJ ve (C) FZO, (D) CycA genler. (D) 'in H3K27me3 zenginleştirilmiş bölgenin bütün çember genomik bölgeler arasında H3K4me3 zenginleşme kromatin durumunu gösterir bam da asılıyor ifade edilir örtüşen bir gen CG7264, testis (RPKM = 1) ama son derece vahşi tip testis ifade (RPKM = 130) ^{8 (7} ChIP-seq veri). Şekil 1'de ChIP sonuç kantitatif PCR analizinde kullanılan sondalar her bir parsel altında etiketlenmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

tp_upload/3745/3745fig3.jpg "/>
Şekil 3. ChIP-seq profilleri testislerde ⁷ bam yılında H3K27me3 ve H3K4me3 kullanarak. Dört gen grupları (7,509 genler) RNA-seq sonuçları ⁸ dayanarak gen ekspresyon düzeylerine göre sınıflandırıldı. Genlerin temsilcisi sınıflar transkripsiyon başlangıç ​​siteleri (trafik ayırım şeritleri) ile 3kb memba için 3kb aşağı gelen dizileri kullanarak, belirli bir histon modifikasyonu zenginleştirilmesi için çizilmiştir. Bu (A) H3K27me3 (K27) ve her bir grupta (B) H3K4me3 (K4) ChIP-seq analizleri. Zenginleştirilmesi bir profil üreten büyük rakamı görmek için buraya tıklayın .

Tartışma

Bu protokol tartışılan ChIP analizlerin çok yönlülüğü, biyolojik ilgili sistemde kromatin devletin bir çalışma olanağı sağlar, farklı dokular üzerindeki kullanılabilir. Kültüre sistemlerinden hücreleri kullanılarak ChIP deneyler hücrelerinin büyük miktarda kolayca elde edilebilir çünkü gerçekleştirmek için uygundur. Bununla birlikte, kültürlenmiş hücrelerde mutlaka bir çoklu-hücresel ortamda hücreleri göstermemektedir. Canlı hayvan disseke doku kullanarak bu tekniği geliştirerek, pek çok soru hitap edebilecek kültür hüc...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Komple Mini proteaz inhibitörü kokteyl	Roche	11836153001
Formaldehit (% 37)	Supelco	47083-U
PMSF	Sigma	78830
Kontes pelet havaneli	Fischer Bilimsel	K749521-1590
PCR izolasyon kiti	Qiagen	28104
Doğrusal poliakrilamid	Sigma	56.575-1mL
Glikojen	Qiagen	158930
SYBR yeşil / ROX qPCR Master Mix	Fermentas	K0223
Mini plaka spinner	Labnet	Z723533
Real Time PCR sistemi	Applied Biosystems	4351101
Küçük Hacim Ultrasonik İşlemci	Misonix	HS-XL2000	Model kesildi
Dynabeads, Protein A	Invitrogen	100-01D
Mıknatıs Dynamag	Invitrogen	123-21D
Fenol: kloroform: IAA	Invitrogen	15593-049
Epicentre DNA SON Tamir Takımı	Epicentre Biyoteknoloji	ER0720
MinElute Reaction Temizleme Kiti	Qiagen	28204
Klenow parçacığı (3 '→ 5' ekso-)	New England Biolabs	M0212S
T4 DNA ligaz	Promega Şirketi	M1794
Adaptör oligonükleotidler	Illumina	PE-400-1001
Eşleştirilmiş-End Primer 1.0 ve 2.0	Illumina	1001783 1001 784
E-Jel Electorphoresis sistemi	Invitrogen	G6512ST
2X Phusion HF Mastermix	Finnzymes	F-531