Yöntem makalesi

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

DOI:

10.3791/3766

⸱

24 Mart 2012

 ,  ,  , 
1Plant Molecular and Cellular Biology Program, University of Florida , 2Department of Biology, University of Florida , 3Interdisciplinary Center for Biotechnology Research, University of Florida , 4Genetics Institute, University of Florida

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreleri stres koşullarına karşılaştığınızda Reaktif oksijen türlerinin seviyesi yükselir. Burada, 3'-3 'diaminobenzidin lekelenmesi örneğin yanı sıra redoks proteom profil cysTMT etiketleme ve kütle spektrometrisi göstermek Pseudomonas syringae Domates yaprakları tedavi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas syringae pv. Domates suşu DC3000 Arabidopsis thaliana, genetik olarak çözülebilir bir ev sahibi bitki üzerindeki 1,2 Solanum lycopersicum değil, aynı zamanda Brassica türleri üzerinde bakteriyel leke hastalığa neden olmaktadır, yanı sıra, sadece. DC3000 ile aşılanmış kotiledonlarında reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikimi 3 domates bakteriyel benek hastalığı sırasında modüle nekrotik hücre ölümü ROS bir rolü olduğunu gösterir. Hidrojen peroksit, ROS bir bileşeni, Pseudomonas 3 olan domates bitkilerinde inokulasyonunun sonra elde edilir. Hidrojen peroksit, bir histokimyasal 3'-3 'diaminobenzidin (DAB) 4 kullanılarak tespit edilebilir. DAB boyama yaprak lekesi 4 kahverengi bir üretmek için hidrojen peroksit ile reaksiyona girer. ROS 5 bazı proteinlerin redoks durumunu değiştirebilirsiniz hücresel redoks çevre, bir düzenleyici rolü vardır. Sistein duyarlı önemli bir amino asitredoks değişir. Hafif oksidasyon altında, sistein sülfhidril grupları ile tersine çevrilebilir oksidasyon fizyolojik süreçlerin 6,7 çeşitli regüle redoks sensörler ve sinyal dönüştürücüler olarak hizmet eder. Tandem kütle etiketi (TMT) reaktifler eşzamanlı tanımlanmasını mümkün kılacak ve tandem kütle spektrometresi 8,9 kullanarak farklı örneklerdeki proteinlerin kantitatif çoğaltılmış. Sistein-reaktif TMT (cysTMT) reaktifler seçici etiketleme ve relatif sistein içeren altı biyolojik örnekler kadar, peptidleri sağlar. Her izobarik cysTMT etiketi aynı nominal üst kütleye sahiptir ve bir sülfhidril-reaktif grup, a-MS nötr ayırıcı kolu ve MS / MS reporter 10 oluşmaktadır. Etiketleme sonra, örnekler proteaz sindirime tabi tutuldu. Sistein-etiketli anti-peptidler TMT antikoru içeren bir reçine ile zenginleştirilmiş edildi. MS / MS analizi sırasında, muhabir iyonları bir dizi (yani, 126-131 Da) relatif hakkında bilgi veren, düşük kütleli bölgede ortaya çıkmaktadır.Iş akışı, örnek karmaşıklığı azaltarak dinamik aralık geliştirme ve sistein değişiklikleri incelemek için etkilidir. Burada Pst DC3000 tedavi domates redoks proteomik analizi sunmak (Rio Grande) cysTMT teknolojisini kullanarak bırakır. Bu yüksek verim yöntemi diğer redoks-düzenleyici fizyolojik süreçleri inceleyerek uygulanacak potansiyeline sahiptir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Büyüyen fidan ve hazırlanması Bakteriler

  1. Fideler bir büyüme oda (22 az 8 saatlik bir ışık periyodu ile 160 ľmol fotonlar m -2 s -1 MetroMix 500 toprak karışımı (BWI ​​Şirketler) içinde çimlenmiş olan 20 karanlık ° C ve 16 saatlik ° C 1 hafta boyunca. Bağıl nem oranı% 70 olarak saptanmıştır. kuru hale gelen toprak tutmak için gerektiği gibi fideler musluk suyu ile sulandı.
  2. Benzer büyüklükteki iki fidan sonra MetroMix 500 toprak içeren 4 "çap tencere nakledilen ve 1.1 aynı koşullarda ek olarak 3 hafta boyunca yetiştirilir.
  3. Pseudomonas syringae (Pst) Kings Yatak Orta (KBM) plakaların (litre başına: 20 g proteoz Peptonlu, 0,1975 g MgSO 4,% 1 Gliserol, 1,5 g K 2 HPO 4, 18 g Agar) üzerine ilk T-çizikli ve yetiştirilen 28 az iki gün ° C. Tek bir koloni 300μl sıvı Kings karıştırılarak, toplanan B Orta (20 g proteoz pepton, 0,1975 g MgSO 4 , 10 mL gliserol, 100x K 2 HPO 4 stokunun 10 ml (H 2 O 10 mL K 2 HPO 4 1,5 g), ve Kings B levha üzerine yayılmıştır. Bu 28 ° C'de gece boyunca kültürlenir
  4. Bakteriler inokulum 20 mL H 2 O. içine KBM plakadan kültüre bakteri kazıma ile hazırlanır 0,03 bir OD 600 (~ 10 6 cfu / ml), (10 mM MgCl2 + 400 uL Silwett-70) inokulasyon tamponu 1 L içinde hazırlanır. Aşılama tampon eksi bakterileri kontrol çözümü için hazırlanmıştır.

2. Pst ve H 2 O 2 ile Domates Aşılama Leke Histokimyasal

  1. Dört haftalık bitkiler 30 saniye için yukarıdaki aşılama çözüm içine batırarak ekildi. Şeffaf plastik poşet inokülasyondan hemen sonra bitkilerin üzerine konuldu.
  2. 3'-3 'diaminobenzidin (DAB) 11 (H2O içinde 1 mg / ml DAB, pH 3.8 (HCI)) üç d hazırlandı lekeays önce tam çözünürleştirme ulaşmak için kullanabilirsiniz. Çözelti, oda sıcaklığında karıştırarak sallandı edildi.
  3. Yirmi dört saat tedaviden sonra, tam genişletilmiş yaprak epidermal tarafı yukarı leke DAB yerleştirilir, kaldırılır, ve vakum 15 dakika infiltre edildi. Yaprakları daha sonra boyama için gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta konuldu.
  4. Yapraklar 10 dakika süreyle% 95 etanol içinde kaynatıldı ve sonra% 75 etanol içinde tutuldu.

3. Protein Ekstraksiyonu

  1. Hasattan sonra, domates yaprakları havanda kullanarak sıvı nitrojen ile ince toz topraklı edildi.
  2. Doku 0.5 g, 1.25 mL fenol Tris pH 8.8 tamponlu ekleyin ve ekstraksiyon tamponu 1.25 mL / 0.5 g (0.1 M Tris-HCI pH 8.8, 10 mM EDTA, 0.9 M sukroz) daha sonra bir de birkaç dakika için devam taşlama çeker ocak.
  3. Oakridge santrifüj tüpü (Termo Fisher Scientific Nalgene Company) ile özü aktarılır ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca ajite.
  4. 5000 xg'de santrifüjleyinve 15 ° C'de 10 dakika süreyle. Yeni ve temiz bir tüpe üst fenol fazı aktarın.
  5. Eşit hacimde Back-ayıklamak sulu faz fenol tampon ayıklanır; 30 dakika için bir çalkalayıcı kışkırtma. Santrifüj ve yeni bir Falcon tüpüne özü aktarmak.
  6. Yukarıdaki adım bir kez daha tekrarlayın ve yeni Oakridge tüpüne özü aktarmak.
  7. % 100 metanol (-20 ° C de muhafaza) içinde 0.1 M amonyum asetat 5 hacim ekleyerek fenol ekstre proteinleri çöktürmek. Gece boyunca -20 ° C'de Vortex ve kuluçkaya yatmaktadır.
  8. 20 dakika için 20,000 xg, 4 ° C'de santrifüje edilerek proteini pelet Collect.
  9. % 80 soğuk aseton ile, metanol ve 2 kez soğuk 0.1M amonyum asetat ile pelet 2 kez yıka. Pelet için 1.5 ml soğuk% 70 etanol ekleyin ve askıya. 20 dakika süre ile, bir 2 mL mikrosantrifüj tüpü (ABD Scientific) ve 14,000 rpm'de santrifüj, 4 ° C transfer. Etanol çıkarın.
  10. Bir SpeedVac konsantratör yılında pelet kısaca kurulayın ve bir protein extr boşanmakişlem tampon, örneğin ReadyPrep Protein Ekstraksiyon Kit Reaktif 3 (8 M üre,% 4 CHAPS, 40 mM Tris-bazlı, 2 M Thiourea) (Bio-Rad). Bir pelet oluşturmak üzere 30 dakika süreyle 14.000 rpm ve 20 ° C'de santrifüje. Süpernatant toplayın.
  11. Üreticinin kılavuzu (Geno Teknolojisi) göre CB-X protein metodu kullanılarak protein konsantrasyonu ölçün.

4. CysTMTs ile Numune Hazırlama ve Peptid Etiketleme

  1. 2-5 mg / ml arasında derişimde protein numunesinin hazırlanması. Burada, her kitle etiketi için 20 ul-50 uL örneklerinin protein 100 mg kullanın. Bu deneme için tüm 6 etiketler kullanılmıştır.
  2. Serbest tiyol grubu engellemek için protein örnek alkilasyon tampon eşit hacimde (100 mM Tris-HCI, pH7.5, 200 mM iyodoasetamid) eklenir. Tampon taze olarak hazırlanması gerekir. Alkilasyon 1 saat boyunca 37 ° C'de gerçekleştirilir.
  3. Gece boyunca -20 ° C'da soğuk% 80 aseton 1 ml ilave edilerek proteini çöktürmek. 14.000 santrifüj Pelet proteinrpm, 4 ° C'de 20 dakika süreyle. Her vorteks% 80 aseton ile pelet 3 kez yıkayın. Süpernatantı ve buz üzerinde kuru iken yayınlamaya izin verir.
  4. 50 uL lizis tamponu (6 M üre, 50 mM Tris baz, 1 mM EDTA) içinde pelletini. 100 mM Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) 0,5 uL daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca kuluçkaya disülfid bağları azaltmak için eklenir.
  5. Etiketleri çözünürleştirmek için reaktif tüplerinin asetonitril 20 uL ekleyerek etiketler hazırlayın. Vortex ve dibine kadar dönerler.
  6. Bir Microcon 3KD santrifüj filtre cihazı (Millipore) kullanılarak ekstra TCEP yıkayın. Microcon 3KD sütuna 50 uL örnek ekleyin ve sütun 50 uL lizis tamponu. 10,000 xg, 4 ° C'de 15 dakika süre ile santrifüje Üç kez toplam için bu adımı yineleyin. Sütun çıkarın ve temiz bir tüpe ters çevirin. 1.000 xg ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin
  7. PH kontrol edin. Gerekirse, 1 M HCl ile 7,0-8,0 pH üzere ayarlanır.
  8. CysTM 5 uL eklemeHer numune (cysTMT reaktif kiti 500 mikrogram protein için 20 uL etiketleri sağlar. Bu yöntemi biz etiketi beşte birini kullanabilirsiniz bu nedenle, 100 mg protein kullanır.) T reaktifi. Oda sıcaklığında 2 saat için ilerlemeye reaksiyon izin verir.
  9. Numuneler, bir 1:1 oranında Laemmli numune tamponu (Bio-Rad) ile kombine edilmiştir.

5.. Sigara tepki Tag Örnek Fraksiyonu Uzaklaştırılması

  1. Numuneler 5 dakika kaynatıldı ve bir ön-dökme 12% poliakrilamid jel (Bio-Rad) üzerine ayrıldı. Jel süzüldü H2O ile 5 dakikalık aralıklarla üç kez yıkanır ve 1 saat için Coomassie Mavisi (Bio-Rad) ile boyanmıştır. Jel H 2 O ile birlikte bir gece de lekeli oldu
  2. Oniki kesirler her jel şeridi toplanmıştır. Kesirler, protein grubu konsantrasyonları tayin edildi. Fraksiyonlar 1mm parçalar halinde kıyılmış ve 1.5 mL tüp içine toplanmıştır.
  3. Jel adet 2 H,% 50 asetonitril ve 0.1 M amonyum bikarbonat ile de-lekeli idi O. Mavi renk jel parçaları (~ 3-4 kez, 15 dakika her zaman) kaldırılıncaya kadar bu adımı tekrar edilmelidir.
  4. De-lekeli jel adet 15 süpernatan kaldırılır dak, ve bir SpeedVac kullanılarak kurutulur parçaları için,% 100 asetonitril (jel parçaları kapsar) kullanılarak kurutulmuştur.
  5. 25 mM amonyum bikarbonat aynı hacimde (as toplanmış etiketli örnek) oran: 1:10 tripsin (Promega) (protein tripsin) eritin. Örneğin, 500 ul'lik bir hacimde 600 ug protein Örnek 25 mM amonyum bikarbonat, 500 uL içinde çözülmüş 60 mg tripsin ihtiyacı vardır.
  6. Jel parçalara tripsin çözüm ekleyin ve rehidratasyonu için buz üzerinde ayarlayın. Adet kapalı değilse 50 mM amonyum bikarbonat tampon ekleyin. Rehidrasyon sonra, 12-16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
  7. İnkübe örneklerden sıvı protein ekstresi çıkarın.
  8. Reaksiyon durdur ve% 5 formik asit,% 50 asetonitril ile jel parçaları kaplayarak kalan herhangi bir protein özeti kaldırmak .. Oda te de 20 dakika boyunca sallayın jel parçamperature. 5.7 ayıklanan protein örnek tüpleri süpernatant aktarın. Iki kez çıkarma işlemi tekrarlayın. SpeedVac kullanarak ayıklanan peptidler kurulayın.

6. CysTMT Etiketli-peptidlerin Numune Zenginleştirme

  1. Bir 50% bulamaç için 0.5 mL tüplere anti-TMT reçine bir gradyan ekleyin. (Gradient fraksiyonlama jel bant konsantrasyonu belirlendi. Bir fraksiyon toplama karanlık bir grup oluşur, daha fazla reçine gereklidir. Az protein olduğu gibi zayıf bantları Kesirleri az reçine gerektirir.)
  2. Reçine daha sonra 1 x biri sütun hacmi ile üç kez yıkanır Tris tamponlu tuz (TBS) (25 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.2) (Termo Scientific Pierce Protein Research Products).
  3. Her numune için 200 ul 1xTBS ekleyin. Numuneler daha sonra, anti-TMT reçinesi (Termo Scientific Pierce Protein Research Products) ilave edildi ve 4 ° C de bir gece boyunca sallanan ardından 2 saat boyunca oda sıcaklığında çalkalanır
  4. Sütun (için örnek ekleRMO Bilimsel Pierce Protein Araştırma Ürünleri).
  5. 1x 200 ul TBS ile her sütunun üç kez yıkayın. Bu, daha sonra% 0.05 CHAPS (1x TBS içinde çözülmüş) ile üç kez yıkama ile takip eder.
  6. Sütun sonra TBS 1x 4 M üre ile üç kez yıkanır. H2O iki yüz mikrolitre sonra sütun üç kez yıkamak için kullanılır.
  7. Her bir numune, 200 uL% 50 elüsyon tamponuyla (% 50 asetonitril,% 0,4 TFA) ile üç kez yıkandı edilir.
  8. Numuneler daha sonra, bir yoğunlaştırıcı vakum içinde kurutulur.

7. Kütle Spektrometresi Analizi

  1. % 0.1 formik asit ile% 3 asetonitril 12 uL içinde tekrar süspansiyon örnekleri ve bir Eksigent NanoLC-1B, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, kolon (AB Sciex, USA) üzerine direkt olarak enjekte 5 ul.
  2. Peptitler bir Proteopep II C18 kolonu 75 mikron kimliği ayrılacak bir 4-60% eğim (A kullanarak x 20 cm (Yeni Amaç, ABD):% 3 asetonitril,% 0.1 formik asit, B:% 97 asetonitril,% 0.1 formik asit)3 azından uL / ​​60 dakika zarfında dak.
  3. Bir Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL kütle spektrometresi tek aşamalı MS oluşan x 3 deney 3 MS tarafından takip yüksek enerji C-trap dissosiyasyon (HCD) parçalanması ile MS / MS spektrumları 3 edinimi ardından bir üst 2 ile peptitler algılamak için kullanılan Protein tespiti için çarpışma kaynaklı dissosiyasyon (CID) ile / MS. Bu modda parametreleri: İzolasyon genişliği: 3,0 m / z; Çarpışma enerji:% 50 (iki aşamalı olarak% 10). Sadece iki kat-ı üç kat ücret ve peptidler parçalanması için seçildi. Dinamik dışlama parametreler belirlendi: = 1 saymak tekrarlayın; Tekrar Süre = 60; Bırakma listesi size = 500; Dışlama süresi = 28. Aşağıdaki gibi hedef değer vardır: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. İyon transferi kez MS / MS (HCD) için FTMS ve 300 için 500 ile belirlenmiştir. İki microscans HCD spektrumları için gerekli edildi.

8. Veritabanı Arama ve Miktar

  1. Kazanılmış CID ve HCD veriler vardıoranını ölçmek için bir Reporter Ion Quantizer (fragman iyonların 20 ppm kütle toleransı) uygulanan bir dallı iş akışı aracılığıyla Thermo Scientific Proteom Discoverer yazılımı 1.2 (Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri) kullanarak nalyzed. Ayrı bir bölüm Spectrum Seçici, Spektrum Normalizer ve Spektrum Orfoz düğümleri arasında MS 2. spektrumları işlenmiş.
  2. Veriler daha sonra SEQUEST arama motoru karşı arandı. A 20 ppm kitle hoşgörü kullanılmıştır. Statik değişiklikler cysTMT reaktifi olarak (304,18 Da) ve dinamik değişiklikler fosforilasyon ve metionin oksidasyon (15.99 Da) dahil edildi. Solanum lycopersicum için özel bir veritabanı RNA veri (Harvard Üniversitesi'nde yaklaşık 350.000 girdileri ile) 13 her iki durumda da kullanılan kullanarak bestelendi.

9. Temsilcisi Sonuçlar

Bir kontrol domates bitkisi yaprak ve Pseudomonas inoküle yaprak temsilcisi görüntüŞekil 1'de gösterilmiştir. Uygulanan kontrol ve Pseudomonas tedavi yaprakları arasında bir farklılık gözlenmiştir. Yapraklar çıkarılır ve de-boyama işlemi yaprak dokusunda ROS belirtileri (Şekil 2) göstermek için histokimyasal sağlar. DAB, kullanılarak boyandı sonra Şekil 2A boyanma bir kontrol yaprak temsilcisidir. Şekil 2B temsilcisi H 2 O 2 üretimi için Pseudomonas ve boyanma ile tedavi edilen bir yaprak. Bir redoks farklı şekilde düzenlenmiş protein Proteome Discover verilerin çıkış için bir örnek Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bu protein bilinen bir redoks düzenlenmiş protein ferrodoksin-1 14 ve Pseudomonas syringae pv domates 15 karşı savunmada rol oynadığı gösterilmiştir. Kontrol ve aşılanmış örnekleri arasında pik yoğunluk ferredox önemli değişiklikler gösterdi Göreceli ölçüm, elde etmek için kullanılırin-1 redoks regülasyonu (p <0.05). Yüksek yoğunluklu zirveleri bu proteinin patojen tedaviye yanıt olarak okside olduğunu göstermiştir. Şekil 4, bir kontrol ve aşılanmış örnek arasındaki bir proteinin benzer redoks düzenlemesi olan bir proteini Proteome Discover veri çıkışı bir örnektir. Benzer yoğunluk Peaks tedavisinde bir değişiklik ile düzenlenmeyen disülfit bağlarını varlığını düşündürmektedir. Yöntem bilim adamları redoks duyarlı sistein ve disülfitler 10 algılamak nasıl devrim olacaktır.

figure-protocol-1
Şekil 1. Inoküle domates temsili bir görüntü kontrol çözeltisi (A) ve Pseudomonas (B) ile ayrılır.

figure-protocol-2
Şekil 2. Aşılanmış domates DAB boyama temsilcisi görüntü kontrolü çözümü (A) ve Pseudomonas (B) bırakır. Yapraklar 3'-3 'diaminobenzidin kullanılarak boyanmıştır. Klorofil% 95 etanol içinde kaynatılarak yapraklar çıkarıldı. Koyu boyama H 2 O 2 varlığını gösterir. Sadece bakteri kültürü koyu boyanma gösterdi inokule bırakır.

figure-protocol-3
Şekil 3. Ferrodoksin-1 Proteome Discover veri çıkışı, farklı şekilde düzenlenmiş redoks proteini 14 bir örneği. Her bir tepe Yukarıda tepe yoğunluğu mutlak nicelendirilmek üzere kullanılır. Kontrol ve aşılanmış örnekleri arasında pik yoğunluk kullanılırGöreceli ölçüm gerçekleştirmek için.

figure-protocol-4
Şekil 4. Bir kontrol ve inoküle örnek arasındaki benzer tepe yoğunluğu olan bir proteinin Proteom Discover veri çıkışı bir örnek. Benzer yoğunluk Peaks tedavisinde bir değişiklik ile düzenlenmeyen disülfit bağlarını varlığını düşündürmektedir.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol DAB boyama yapılması hakkında bilgilerin yanı sıra cysTMT etiketli redoks sistein miktar sağlar. Bu prosedürler ROS üretiminin yanı sıra Solanum lycopersicum Pseudomonas syringae ile inokule edilir protein yönetmelik üzerindeki etkisini incelerken yararlıdır. Bu protokol sunulan yöntemler yaprak dokusu hasarı en az neden olan bir şekilde bütün yaprak örneklerinde ROS incelemek için bir yol sağlar. Etiketleme prosedürü bir sistein etiketleme yöntemi kullanarak potansiyel redoks düzenlenir proteinler incelemek için bir yol sağlar. Stres yanıtı erken bir aşamada incelerken bu faydalıdır.

Böyle izotop kodlanmış afinite etiket (ICAT) ve cysTMT gibi yöntemlerle biyolojik örneklerde redoks potansiyeli regüle proteinleri inceleyerek kullanılabilir. ICAT etiketleme ve iki örnek 12 karşılaştırılmasına olanak sağlar. Her iki yöntem de serbest sisteinlerin ve etiketlemek quantific protein için kullanılabilirleration 10,12. Bununla birlikte, cysTMT yöntem, bir deney varyasyonu azalma yanı sıra 10 multiplekslemesi sağlar. Kullanılabilir etiketlerin sayısı araştırmacıların deney tasarımı çoğaltır veya birden fazla numune eklemenize olanak verir. Daha örnekleri sahip tespit proteinleri ile daha fazla sayıda potansiyel sağlar. CysTMT tekniğin büyük bir dezavantajı çünkü cysTMT etiketli-peptidler (6,5-6,6) için selektif zenginleştirme basamakları proteinin tanımlanması genel kalitesini düşürüyor olmasıdır. Protein tanımlanması için peptidlerin numarası protein dizisi içinde sistein kalıntıların sayıda büyük ölçüde değişir. Bu sorun, kütle spektrometresi proteinin tanımlanması için zenginleştirme önce triptik örnek parçası göndererek aşılabilir.

Deney tasarımı gibi cysTMT yöntemi kullanan bir etiketleme mekanizmasının yapısı nedeniyle, belli bir adım kritik önem taşır. Protein preci gerçekleştirirkenpitation ve pelet yıkamalar (3.9) protein yıkımı azaltmak için buz üzerinde soğutulmuş örnekleri tutmak için önemlidir. Örnekleri ters etiketlenmesi tabi olabilir, çünkü cysTMT etiketleme sırasında, indirgeyici tepkin madde (4,6) çıkarılması önemlidir. Reaktif azaltılması örnek kalırsa ters etiketleme mümkündür. Örnekleri işaretlendikten sonra azaltılmış ise, cysTMT etiketi kaldırılabilir. Etiket örnekleri eklenir sonra, pH seviyesini optimum etiketleme verim için (4.7) kontrol edilmelidir. Buna ek olarak, veri analizi araştırmacı protokolü kullanılarak içinde nihai hedefi gerekenden bağlıdır. Ayrıca her yazılım farklı algoritmalar var olarak kullanılan yazılım bağlıdır.

Bu deney, domates reaktif türün oksidatif üretimi için geliştirilmiş bir elisitör olarak patojen kullanan, ancak, başka bir redoks düzenlenmiş yanıtları buna göre ölçülebilir. Bu deney tasarımı diğer bitki ve hayvan sistemlerinde uygulanabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar DC3000 zorlanma, domates tohumu, ve tavsiye sağlamak için Dr Greg Martin (Cornell Üniversitesi) ve onun grubuna teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Zhonglin yöntem geliştirme konusunda yardım almak için Biyoteknoloji Araştırma için UF Disiplinlerarası Merkezi DAB protokolü ve Proteomik Bölümü yardım için Mou teşekkür etmek istiyorum. Protein ekstraksiyonu için protokol Hurkman ve Tanaka 16 güncellenmiştir. 6 cysTMT etiketleme, adım 4 protokol orijinal Pierce Thermo Fisher Scientific ürün kılavuzuna 17 dayanmaktadır uyarlanmıştır. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (S Chen MCB 0.818.051) tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası
MetroMix 500 BWI Şirketler TX-500
3,3 '-diaminobenzidin Sigma-Aldrich D8001
ReadyPrep Sıralı Ekstraksiyon kiti Reaktif 3 Bio-Rad 163-2104
CB-X protein tayini Geno Teknoloji 786-12x
cysTMT reaktifler Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri 90071
Laemmli Örnek Tampon Bio-Rad 161-0737
Biyo-Güvenli Comassie (G-250 leke) Bio-Rad 161-0786
Microcon 3KD sütun Millipore 42403
İmmobilize Anti-TMT reçine Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri 90076
Santrifüj sütun Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri 89896
Proteopep II C18 kolon Yeni Hedef PFC7515-PP2-10
NanoLC-1D HPLC AB Sciex 90389
LTQ Orbitrap XL Thermo Scientific 0020137580
SpeedVac Labconco 7812013
Proteom Discoverer 1.2 yazılımı Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri
Tripsin Promega V5111
Oakridge Santrifüj Tüpü Thermo Scientific Nalgene Şirketi 3139-0050
Microcentrifuge tüp (2 ml) ABD Bilimsel 1620-2700
% 12 Mini-Protean TGX Prefabrik Jel Bio-Rad 456-1043
Form Başı
Formu> Bio-Güvenli Coomassie StainBottom 		Bio-Rad 161-0786
TMT zenginleştirme kiti Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri 90077

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Almeida, N. F. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).
  2. Preiter, K. Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000. J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).
  3. Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction. Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).
  4. Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).
  5. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  6. Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis. J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).
  7. Apel, K., Hirt, H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).
  8. Dayon, L. Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).
  9. Thompson, A. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).
  10. A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation. Rosenblatt, M. The 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry, , Thermo Fisher Scientific. TP169(2010).
  11. Clark, J. Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide. Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
  12. Sethuraman, M. Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures. J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).
  13. DFCI - Tomato Gene Index. , Harvard University: Computational Biology and Functional Genomics Laboratory. Boston, MA. Available from: http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=tomato (2010).
  14. Asso, M. EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki. Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).
  15. Huang, H. e Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants. Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).
  16. Hurkman, W., Tanaka, C. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis. Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).
  17. Cysteine-Reactive Tandem Mass Tag®(cysTMT®) Reagents. , Thermo Scientific Pierce Biotechnolgy. Rockford, IL. Available from: http://www.piercenet.com/instructions/2162220.pdf (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sistein Modifikasyon AnaliziTandem K tle EtiketiSistein Reaktif TMTProteaz SindirimiAnti TMT Re ine Zenginle tirmesiHPLC Ay r mMS MS AnaliziRaporlay c yon Kantitasyonu

İlgili makaleler