Yöntem makalesi

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

48.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/3781

⸱

15 Mart 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Bu makalede

Özet

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri, kanıtladık Salmonella typhimurium Ve Mycobacterium marinum. Bakteri ve çok-renkli floresans görüntüleme mikro-enjeksiyon zebrafish embriyo enfeksiyonu modellerinin uygulaması ile ilgili önemli tekniklerdir.

Özet

Zebra balığı (Danio rerio) embriyo giderek-konak ilişkilerinin 1 omurgalı doğuştan gelen bağışıklık sisteminin fonksiyonunu incelemek için bir model olarak kullanılmaktadır. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli hücre tipleri, makrofaj ve nötrofiller, önce adaptif immün yanıtları için gerekli olan lenfositlerin olgunlaşması için embriyogenezisin ilk günlerinde gelişir. Embriyoların sayıda elde kolaylığı, dış gelişme, embriyonik ve larva aşamalarını optik şeffaflık nedeniyle erişilebilirlik, genetik araçları, transgenik muhabiri hatları geniş mutant kaynakları ve koleksiyonları, geniş bir yelpazede tüm zebrabalıkları çok yönlülüğünü eklemek modeli. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) ve Mycobacterium marinum makrofaj hücre içinde bulunabilir ve sık Zebra balığı embriyolarının-konak ilişkilerinin incelemek için kullanılır. Bu iki enfeksiyonu süreçlerbakteriyel patojenler karşılaştırmak ilginç çünkü S. typhimurium enfeksiyonu M. ise, akut ve bir gün içinde ölümcüldür marinum enfeksiyonu kronik ve larva dönemi 2, 3 kadar görüntülenebilir. Embriyo (Şekil 1) bakterilerin mikro-enjeksiyon sitesi enfeksiyon hızla sistemik olacak veya başlangıçta lokalize kalır belirler. Hızlı bir sistemik enfeksiyon ile kurulabilir mikro-enjeksiyon doğrudan posterior kan adada kaudal ven yoluyla kan dolaşımı içine veya Cuvier, gövde damar kalbe bağlayan yolk kesesi üzerinde geniş bir sirkülasyon kanalı Kanal yoluyla bakteri. 1 dpf'e anda, bu aşamada embriyo phagocytically aktif makrofajlar var ama nötrofiller henüz kan adaya enjekte, olgun olmadığı zaman tercih edilir. Embriyolar da fonksiyonel (miyeloperoksidaz üretmeyen) nötrofil, geliştirdik 2-3 dpf'e, az enjeksiyon için Cuvier ve Kanal t olarak tercih edilmektedirdiye enjeksiyon yerinde. Lokal enfeksiyonlar doğru miyeloid hücrelerin yönettiği göç çalışmak için, bakteri kuyruk kas, otik vezikül veya arka beyin ventrikül 4-6 enjekte edilebilir. Buna ek olarak, notokord miyeloid hücrelere normal erişilmez gibi görünen bir yapı, lokal enfeksiyon 7 son derece duyarlı. Yüksek hacimli uygulamalar için kullanışlı bir alternatif gübreleme 8 sonraki ilk saat içinde embriyo sarısı içine bakteri enjekte edilmesidir. Floresan makrofaj veya nötrofil ile floresan bakteri ve transgenik zebrabalıkları çizgileri birleştirerek-konak ilişkilerinin çok-renkli görüntüleme için ideal şartlar oluşturur. Bu video makalede S. ile Zebra balığı embriyolarının damardan ve lokal enfeksiyon için ayrıntılı protokoller açıklayacağız typhimurium veya M. marinum bakteri ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücreleri ile etkileşim sonraki floresans görüntüleme için.

Protokol

1. Enjeksiyon İğnesi hazırlayın

  1. Mikropipet çektirme cihazı (Sutter Instruments Inc, uzun bir bahşiş için aşağıdaki ayarları / Kahverengi p-97 Flaming kullanarak borosilikat cam microcapillary enjeksiyon iğneleri (Harvard Apparatus, 300.038, 1 mm OD x 0,78 mm ID) hazırlayın: hava basıncı 400; ısı 610; çekme 40; hızı 50; süresi 30 ve daha kısa bir ipucu için aşağıdaki ayarları ile: hava basıncı 500; ısı 510; çekme 100; hızı 200; zaman 60).
  2. 5-10 um ucu açılış çapı elde etmek için ince cımbızla iğne ucunu kırın. Bu eğim daha keskin bir ipucu elde etmek için bir microgrinder (Narishige A.Ş., EG-400) ile açı 45 derece iğne ucu açılış tavsiye edilir. Bu epidermal tabakası delinmesiyle kolaylaştırmak ve böylece küt iğneler ile daha az doku harabiyetine daha çoğaltılabilir enjeksiyonlar ile sonuçlanacaktır. Uzun uçlu iğneler kaudal ven (adım 5) ve Cuvier ve Kanal (adım 6.1) enjeksiyonları ve kısa uçlu iğneler tercih edilmektedirDiğer enjeksiyon protokolleri (adımları 6,2-6,6) için tercih edilir.

2. S. hazırlayın typhimurium İnokulum

  1. S. dışarı Plaka LB agar plaklarına bir -80 ° C'de gliserol stoktan typhimurium (floresans ifade vektörler için seçmek uygun antibiyotik) ve 37 de bir gece inkübe ° C
  2. Bireysel floresan pozitif koloniler almak ve steril fosfat-tamponlu salin (PBS) içinde istenen konsantrasyonu (protokolleri 5 ve 6'ya bakınız) bunları tekrar süspansiyon, isteğe bağlı olarak 0,085% (v / v) içeren fenol kırmızısı (Sigma-Aldrich) görselleştirilmesi yardımcı olmak için enjeksiyon işlemi. Doğrudan enjeksiyon için yeni süspansiyon kullanmak veya gliserol stokları hazırlamak. Gliserol stokları hazırlamak üzere, bakteriler istenen konsantrasyonuna sahip yeni hazırlanmış bir enjeksiyon stoku aşağı doğru döner ve PBS içinde steril% 20 (v / v) gliserol (Sigma-Aldrich) içinde yarı başlangıç ​​hacminde pelet resuspending tarafından stok konsantre. -8 Az gliserol stok Mağaza0 ° C. Isteğe bağlı olarak% 0.17 fenol kırmızısı içeren steril PBS içinde enjeksiyon öncesinde gliserol stok 01:01 (v / v), seyreltilir.
  3. Vorteks bakteriyel süspansiyon iyi topaklanma önlemek için.
  4. Bir Microloader ucu (Eppendorf, 5.242.956,003) kullanarak microcapillary iğne içine inokulum yükleyin.
  5. S. 'nin nispeten büyük boyutu nedeniyle typhimurium bakteriler ve parlak Ds-KIRMIZI floresans pGMDs3 ifade vektör 3 (istek üzerine suşu) kullanarak, bireysel bakteri hücreleri kolayca enjeksiyon dozu ayarlamak için bir floresan stereomikroskopta sayılabilir. Bu amaçla, bir agar plak üzerinde PBS ile damla halinde 1 nL enjekte flüoresan bakteri saymak ve istenen dozu bakteriyel (tercihen 1-2 arası nL enjeksiyon hacmi tutmak) elde etmek için gerekli olan enjeksiyon hacmi hesaplayabilir. S. ile embriyolar enjekte Seçilen güzergah (protokoller 5 ve 6) ile typhimurium.

3. Hazırlamak M. marinum İnokulum

  1. M. tutun marinum Difco Middlebrook 7H10 agar üzerinde büyüyen gerginlik (BD ve şirket) (kullanılabilir suşları floresans ifade vektörleri için seçmek asit-albumin-dekstroz-katalaz% 10 oleik (OADC, BD ve şirket),% 0.5 gliserol, ve uygun antibiyotik ile takviye Talep 9) üzerine, yeni bir stok her zaman vardır.
  2. M. kolonisi seçin % 10 albumin-dekstroz-katalaz (ADC, BD ve şirket) ve% 0.05 Tween 80 (Sigma-Aldrich) ve uygun antibiyotik ile desteklenmiş Difco Middlebrook 7H9 broth (BD ve şirket) bunu marinum ve tekrar süspansiyon. 600 nm'de optik yoğunluk (OD) 0.2 olduğunu kontrol edin - 0.3 ve 28.5 azından durağan gece büyümesine izin ° C M. nesil zamanı marinum zorlanma göre değişen, yaklaşık 4-6 saattir.
  3. Enjeksiyon gününde yine 600 nm'de OD ölçün. 1 bir OD600 yaklaşık 10 8 M. tekabül marinum / mL(Bu kullanılan bakteri suşunun göre değişebilir ve bu yüzden özellikle soybaşı için bir büyüme eğrisi dayalı olmalıdır).
  4. Onlar steril PBS ile üç kez santrifüj ve yıkama logaritmik faz (OD600 1.00 aşan izin vermeyin) olduğunda bakteriler Harvest.
  5. PBS içinde bakteriyel süspansiyon tekrar OD600 ölçmek, aşağı doğru dönmeye ve homojenlik iyileştirir PBS içinde PBS içinde% 2 veya Polivinilpirolidon istenen konsantrasyonu (protokolleri 5 ve 6'ya bakınız) (PVP40) (w / v), bakteriler için yeniden süspanse bakteriyel süspansiyon. Fenol kırmızısı (Sigma-Aldrich) püskürtme işleminin görselleştirme yardımcı olmak için 0.085 'lik bir konsantrasyon% ilave edilebilir. Doğrudan enjeksiyon için yeni süspansiyon kullanmak veya gliserol stokları hazırlamak. Gliserol stokları bakteri istenen konsantrasyonuna sahip yeni hazırlanmış bir enjeksiyon stoku aşağı doğru dönmeye hazırlamak ve PBS içinde steril% 20 gliserol içinde yarı başlangıç ​​hacminde pelet resuspending tarafından stok konsantre. Glyc Mağaza-80 at erol stok ° C Isteğe bağlı olarak PVP40 ve / veya% 0.17 fenol kırmızısı 4% içeren steril PBS içinde gliserol stok 01:01 (v / v), seyreltilir.

4. Enjeksiyonlar için Zebra balığı embriyolar hazırlayın

  1. Zebra balığı üreyen kurun ve başka bir video 10 uncu maddesinde gösterildiği gibi embriyo toplamak. Yumurta su (. 60 mcg / mL Deniz tuzları; yaklaşık 60 embriyo / çanak) ile dolu bir Petri kabındaki embriyo tutun ve 28.5 'de inkübe ° C
  2. Gerekirse embriyosu melanization önlemek için yaklaşık 12 hpf olduğunda, yumurta su (PTU, Sigma-Aldrich)% 0.003 N-Phenylthiourea ekleyin.
  3. Yaklaşık 24 saat sonra döllenme (hpf), dechorionate ince cımbız (Güzel Bilim Araçlar A.Ş., Dumont # 5 Forseps ile embriyolar - Inox Biyoloji.
  4. Yumurta su ile ve plastik yüzeye yapışmasını engellemek için embriyo altında% 1 agaroz bir tabaka ile doldurulmuş bir Petri tabağına embriyosu tutmak.
  5. 200 mcg / mL olan embriyolar uyutmak 3 tamponlu-Aminobenzoik aside (Tricaine, Sigma-Aldrich) enjeksiyon öncesinde yaklaşık 10 dak.

5.. Bir gün eski embriyolar içine Bakterilerin İntravenöz Enjeksiyon

  1. Göz, düz bir kuyruk pigmentasyon başlayan ve kalbin gözü sadece ventral olarak konumlandırılmış olan, tutarlı kan dolaşımını kontrol ederek 28 hpf 11 yaşında embriyolar Evre.
  2. Embriyoların uyuştur, 4.5 adıma bakın.
  3. Bir Microloader ucunu kullanarak bakteriyel inokulum ile iğne yerleştirin.
  4. Bir stand bağlı bir mikromanipülatör (Sutter Enstrüman, MM-33) (Dünya hassas Instruments, M10L manyetik stand) üzerine yüklenen iğne takın ve stereo mikroskop (Leica M50, achromat 1x objektif 0,15 NA, geçen ışık tabanı altında konumlandırmak TL ST). 0.2 s için enjeksiyon zamanı ve tazminat basınç 15 hPa (Eppendorf, FemtoJet) ayarlayın. İğne için doğru enjeksiyon hacmi elde etmek için 700 ve 900 inç arasında püskürtme basıncı ayarlamakullanılmıştır. Bir mikroskop lamı veya oküler bir ölçek çubuğu yardımıyla istenilen çap maç için damla boyutu ayarlayın. Büyüklüğünün belirlenmesi için açılan bir mikroskop lamı üzerinde mineral yağ enjekte edilebilir veya boyutu iğnenin ucunda asılı damla bırakır hava enjekte tarafından tahmin edilebilir. 1 nL bir damla yarıçapı 0.062 mm (r 3 V = 4/3 π) 'dir.
  5. Önceki (enjeksiyon plakası yüzeyine göre 45 ° açıyla yani yaklaşık) enjekte etmek doğru pozisyona yüklenen iğne ile mikromanipülatör ayarlayın ve sadece enjekte etmek için ileri ve geri hareket ettirin.
  6. Anestezi embriyolar yüzey gerilimi enjeksiyonlar sırasında yerinde embriyoların tutun sağlayan kaldırılır düz bir% 1 agaroz enjekte plaka ve aşırı yumurta su üzerine pipetlenir. Embriyoların hizaya bir saç döngü aracı (Şekil 2) kullanın. Orient inserti için tercih edilen konuma embriyo yerleştirmek için enjeksiyonlar sırasında elle enjeksiyon plakasıng kuyruklarını iğne ucu dönük olan iğne, yani.
  7. Doğrudan ürogenital açıklık (Şekil 1A), iğne ucu ile delmek Periderm için kaudal ven kapanışın üstünde iğne ucu yerleştirin ve bakterilerin istenen dozu enjekte; biz ca kullanın. S. 250 cfu Ds-KIRMIZI ifade vektör pGMDs3 ve ca içeren typhimurium vahşi tip (wt) suşu SL1027. M. 120 cfu marinum suşu Mma20. Enjekte bakteriyel süspansiyon kalp doğru kaudal damarı yoluyla kan akışı takip edecektir. Enjeksiyon doğrudan darbe 2'den sonra damar sistemi genişleyen bir hacmi kontrol ederek doğru gerçekleştirildiğinde izleyin. Doz-yanıt deneyler için, 2-3 ardışık enjeksiyonlar iğne ayıklanması olmaksızın gerçekleştirilebilir.
  8. Sıkça deney sırasında enjeksiyon hacmi aynı kalır emin olun. Deneme süresince enjeksiyon tutarlılığı için bir kontrol sağlamak için, dro enjektedoğrudan yaklaşık her 30 inci embriyo enjeksiyon sonrası bakteriyel büyüme ortamında steril PBS damla bakterilerin s. Bu bırakma Plaka ve enjeksiyon hacmi koloni oluşturan birim (kob) belirlemek için inkübasyondan sonra bakteri kolonileri saymayın.
  9. Bireysel floresan S. gözlemlemek için floresans stereomikroskopta (protokol 7) kullanın typhimurium hücreleri doğrudan enjeksiyon sonrası kan dolaşımında ve düzgün enjekte edilmez embriyo atın. Bireysel floresan M. marinum bakteriler doğrudan enjeksiyon sonrasında stereo floresan mikroskop ile görülemez, ancak enfekte hücrelerin floresan agrega 2 gün sonrası enfeksiyon (dpi) tarafından görülebilir ve zamanla daha büyük büyümek gerekir.

6. Enfeksiyon Alternatif Yolları

  1. Cuvier enjeksiyon Kanal: kaudal ven enjeksiyonları gibi düz bir% 1'lik agaroz enjekte plaka (5.6) üzerine anestezi embriyolar (2-3 dpf) kadar hattı. Orient enjekteyani çapraz altında iğneyi batırmak için tercih edilen konuma embriyo yerleştirmek için enjeksiyonlar sırasında elle iyon plakası, Cuvier ve Kanal (Şekil 1B) embriyonun dorsal tarafına iğne ucu yaklaşır ve böylece 45 ° açı . Kanal yolk kesesi üzerinde genişletilmesi başlar ve 100-200 bakteri (1-3 nL) enjekte konuma sadece dorsal Cuvier ve Kanal başlangıç ​​noktası içine iğne yerleştirin. Kanal içerisindeki hacmi doğrudan darbe sonrası ve yolk kesesi patlamış değil genişletir eğer enjeksiyon doğrudur. Kaudal ven enjeksiyonu (5.7) için, birkaç ardışık enjeksiyon iğnesi ayıklanması olmadan yapılabilir.
  2. Ardbeyin ventrikül enjeksiyonu: embriyolar iğne ucu yolundaki dorsal yüzü konumlandırılmış böyle düz bir% 1 agaroz enjekte plaka üzerinde anestezi embriyolar kadar hattı (32 hpf). Neuroe dokunmadan anterior pozisyondan ardbeyin ventrikül içine iğne takınpithelium (Şekil 1C) ve 20-100 bakteri (0.5-1 nL) enjekte edilir. Başka bir video makalede 13'te görüldüğü gibi prosedürü uygulamak için, (örneğin, Teksas-Kırmızı Dextran gibi) bir floresan boya kullanın.
  3. Kuyruk kas enjeksiyonu: konum anestezi embriyolar (1-2 dpf) kaudal damar enjeksiyonu gibi (5.6). Enjeksiyon plakası yüzeyine göre yaklaşık 65 ° lik bir açı ile yüklenen iğne ile mikromanipülatör ayarlayın. Notokordun veya kan damarlarına zarar vermeden ürogenital açıklık (Şekil 1D) Yukarıdaki kas içine 50 kob - 20 içeren bir bakteriyel süspansiyon (0.5-1 nL) enjekte edilir.
  4. Otik vezikül enjeksiyonu: kaudal ven enjeksiyonlar gibi pozisyon anestezi embriyolar (2-3 dpf) (5.6). Enjeksiyon plakası yüzeyine göre yaklaşık 65 ° lik bir açı ile yüklenen iğne ile mikromanipülatör ayarlayın. Düşük basın ile kulak vezikül (Şekil 1E) içine yaklaşık 20 bakteri (0,5 nL) enjektelokal doku yırtılması önlemek için ure.
  5. Notokordun enjeksiyonu: embriyoların kendi kuyruğunu iğne ucu uzak işaret ile konumlandırılmış olduğu gibi düz bir% 1 agaroz enjekte plaka üzerinde anestezi embriyolar kadar hattı (1-2 dpf). Notokordun (Şekil 1F) içine kuyruk kas dokusundan iğne yerleştirin ve yaklaşık 20-50 bakteri (maksimum 0.5 nL) enjekte edilir. Notokordun rüptürü önlemek için çok fazla hacim enjekte dikkat edin.
  6. Yolk enjeksiyon: bir kanal kalıp 12 veya online ile yapılan dikdörtgen veya V-şekilli kanalları% 1 agaroz enjekte plakası üzerinde 16 ila 1000 hücrede aşamada embriyoları içeren pozisyonu yumurta http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Pierce sarısı (Şekil 1G) merkezi haline koryon yoluyla iğne ve (1-2 nL) 20-40 bakteri enjekte. Bakteriyel süspansiyon için taşıyıcı PVP40% 2 çözelti kullanım (adım 3,5 bakınız)embriyo haline erken bakteri yayılmasını önlemek için önemlidir.

7. Enfeksiyon Stereo Görüntüleme

  1. Tricaine (4.5) içeren yumurta su ile kaplı bir% 1 agaroz katmanlı Petri kabındaki enfekte embriyoları uyutmak.
  2. Bir saç döngü aracı (Şekil 2) ile bir floresan stereo mikroskop altında görüntüleme için doğru pozisyonda embriyolar hizalayın. Yüzme kesesi şişirilir oldu önce (1-5 dpf), embriyoların lateral görüntü görüntüleme sağlayan kendi yanda düz yatacaklar.
  3. Yan görünümüdür farklı bir konuma gerekli ise,% 1.5 metil selüloz içinde embriyo monte edilir. Bir saç döngü aracı (Şekil 2) ile istenen konuma getirin embriyo işleyin.
  4. Görüntüleme sonra yumurta suya embriyoların dönün.

8. Enfeksiyon Konfokal Görüntüleme

  1. Bir bardak alt Düşük Erime Noktası agaroz (Lonza Inc, yumurta su içinde% 1.5 (w / v)) bir damla yerleştirinBir ters konfokal mikroskop kullanılması durumunda WillCo-çanak (WillCo Wells, GWSt-5040), veya tek bir kavite depresyon slayt (Agar Bilimsel, L4090) üzerine dik bir konfokal mikroskop kullanılması durumunda.
  2. Yumurta su sınırlı miktarda agaroz damla içine anestezi embriyo yerleştirin ve bir saç döngü aracı (Şekil 2) ile pozisyona embriyo manipüle. Inverted mikroskop kullanılarak zaman ilgi embriyonun bölge görüntüleme çanak cam dibine düz olması önemlidir. Dik bir mikroskop suya batırma ve uzun mesafeli kuru amaçları ile kombinasyon halinde kullanılabilir ve embriyo ilgi bölgesi mümkün olduğu kadar yakın bir hedefi olduğu gibi yerleştirilmelidir.
  3. Agaroz Tricaine (4.5) içeren yumurta suda agaroz damla somutlaştırmak ve daldırın edelim. Dik bir mikroskop kullanılması durumunda, depresyon boşluğu (hava kabarcığı oluşturacak şekilde izin vermez) üstüne bir cam kapak kayma yerleştirin.
  4. Sıralı gribi eldeorescence ve iletim görüntüler.
  5. Dikkatlice ince cımbız ile embriyodan agaroz kaldırmak ve daha sonraki denemeler için gerekli ise yumurta suya geri embriyo yerleştirin.

9. Temsilcisi Sonuçlar

Makrofajlar tarafından hızlı fagositoz 1 dpf'e sonuçlarına embriyo kan ada haline Salmonella typhimurium veya Mycobacterium marinum bakteri Enjeksiyon. MPEG1 gen son zamanlarda köklü makrofaj işaretleyici csf1r (FMS) ile colocalizing ve bu mpx (MPO) ve lyz 4, 14, nötrofil işaretleri ile örtüşmeyen, embriyonik makrofajların sadık bir belirteci olarak tespit edilmiştir. Bakteriyel fagositoz canlı görüntüleme için biz MPEG1 organizatörü makrofajlar 14 floresan protein ekspresyonu yönlendiren transgenik hatları kullanılır. Bu transgenik çizgiler ya MPEG1 organizatörü f vargfp gen doğrudan kullanılan veya MPEG1 organizatörü Kaede gen erimiş gal4 tanıma dizisi (UAS, yukarı dizisi aktive) ile ikinci bir transgen aktive maya gal4 transkripsiyon faktörü ifade sürücüler iki bileşen sistemi kullanır. Kan ada enjeksiyon (protokol 5; Şekil 1A) zaman, doğru uygulanan, bakteri hemen kan dolaşımı akmaya ve embriyo yayılmış olacaktır. Nispeten büyük ve parlak floresan Ds-RED etiketli S. yaygınlaştırılması typhimurium bakteri birçok bakteri floresan makrofajlar (Şekil 3B-C) tarafından fagosite olduğunu 2 hpi gösterilerinde bir stereo floresan mikroskop (Şekil 3A), ve konfokal görüntüleme ile doğrudan görüntülenebilir. Vahşi tip S. 25'ine kadar cfu enjeksiyonu typhimurium bakteriler, bir öldürücü enfeksiyonlara yol ederken, bir avirulent s bakteri benzer bir dozdagibi Ra gibi tren, embriyonik bağışıklık sistemi 3 ile silinebilir. 250 kob bir enjeksiyon dozu S. için transkripsiyonel yanıtları belirlemek için kullanılmıştır Zebra balığı embriyo ve typhimurium enfeksiyon güçlü bir pro-inflamatuar gen ekspresyonu yanıtı 15 indüksiyon gösterdi. M. Bunun aksine, intravenöz enjeksiyon marinum bakteri güçlü bir pro-inflamatuar yanıtı ortaya, ama infekte makrofajların tüberküloz 2 bulgusu granülomlar ilk aşamalarında, olarak kabul edilmektedir sıkı agregatlar oluştururlar kalıcı bir enfeksiyona yol açan değil. Dpi mCherry etiketli M. hücre içi büyüme gösteren 5 at gl22 hattı 14: Tg böyle bir granülom benzeri agrega (EGFP MPEG1) arasında Konfokal görüntüleme marinum bakteri yeşil floresan makrofajlar içinde (Şekil 3D-E).

OtEnfeksiyon onun yollarının çeşitli amaçlar için de yararlıdır. Bakteriler makrofaj yoksun bir bölmesi olan 32 hpf (Şekil 1C), at arka beyin ventrikül içine enjekte edilebilir. 20-100 mCherry etiketli M. Enjeksiyon Bu bölmeye marinum bakteri bakteriler (Şekil 4A) fagosite makrofajlar tarafından hızlı bir infiltrasyonu yol açar. Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin yönettiği göç incelemek için başka bir yöntem kuyruk kası (Şekil 1D) içine bakteri enjekte edilmesidir. Ancak, kuyruk kas enjeksiyonları da kendisi tarafından lökositlerin bazı cazibe ortaya çıkarır ki doku hasarına neden olur. Dikkatle kulak vezikül (Şekil 1E) içine küçük bir hacim (0.5-1 nL) enjekte Böyle bir yaralama yanıt önlenebilir. I114 hattı 16, S. yaklaşık 20 kob iğnesi gibi Tg (EGFP mpx) kullanarak Burada gösterilen otik vezikül içine typhimurium 3 hpi de nötrofillerin cazibe yol açar ( Şekil 4D), bu yanıtı PBS kontrolü enjeksiyonları (Şekil 4E) görülmez iken. Lökosit infiltrasyonu dirençli görünmektedir notokord, M. büyüme için müsamahakâr bölmesidir diğer dokularda 7 enjekte edildiğinde kuvvetli zayıflatması marinum mutantlar; (Şekil 4F). M. Son olarak, erken enjeksiyon embriyoların sarısı içine marinum sistemik bir enfeksiyon ulaşmak için alternatif bir yöntem sağlar. Biz genellikle 16 hücre aşamada (Şekil 1G) çevresinde bu enjeksiyonları gerçekleştirmez, ancak yumurta sarısı içerisine bakteriyel enjeksiyonları da (en fazla 1000 hücrede sahne) Daha sonraki aşamalarda yapılabilir, veya önceki (1 ila 8 hücreli aşama) eş-enjeksiyonlar morpholinos 8 ile. 20-40 kob, M. dozunun ardından sarısı enjeksiyonu marinum bakteriler konvansiyonel üzerine görülenlere benzer embriyonik doku ve form granülom benzeri agrega içine birkaç güne yayılmışintravenöz enjeksiyon yöntemi 8; (Şekil 4G). Sarısı enjeksiyon yöntemi S. için uygun değildir typhimurium enfeksiyon, çünkü sarısı içinde hızlı bir büyüme erken öldürücülüğü neden olur. M. için sarısı enfeksiyon yöntemi bir enjeksiyon robot 8 kullanarak otomatikleştirilebilir yana marinum enfeksiyon, yüksek hacimli uygulamalar için faydalı olacaktır.

figure-protocol-1
Şekil 1.. Hızlı bir sistemik enfeksiyon kurulması için Zebra balığı embriyolarının sistemik veya lokal enfeksiyon kurmak için kullanılan enjeksiyon yöntemlerine genel bakış. (AB) intravenöz enjeksiyon 1 dpf (A) posterior kan ada veya Cuvier ve Kanal içerisine kaudal damar içine yapılır 2-3 dpf (B). (CE) makrofaj ve nötrofil kemotaksisini çalışmak için Yerel enjeksiyonlar 1 dpf (C) arka beyin ventrikül içine yapılır, 1-2 FAP (D) ya da 2-3 FAP (E) de otik vesikül azından kuyruk kası. (F) fagositler görünüşte ulaşılmaz bir enfeksiyon oluşturmak için Enjeksiyonlar 1-2 dpf'e az Notokordun içine yapılmaktadır. (G) enjeksiyonları gibi M. yavaş büyüyen bakteriler ile erken bir sistemik enfeksiyon oluşturmak için marinum 16-1000 hücre aşamada sarısı halinde gerçekleştirilebilir. Tüm resimler Leica DFC420 kamera (Leica 10.446.307 0.8x) bağlı bir Leica M165C, PLANAPO 1.0x ile alınmıştır.

figure-protocol-2
Şekil 2. Saç döngüsü aracı. Insan saçından bir parça bir Pasteur pipeti deliğine bir döngü olarak eklenmiş ve süper yapıştırıcı veya Tipp-Ex yerine sabitlenir. Bu nazik kırılgan zebrabalıkları embriyolar işlemek için uygun bir araç sağlar.

figure-protocol-3
Şekil 3. Intravenöz enjeksiyonkırmızı floresan Salmonella typhimurium ve Mycobacterium marinum. Ds-KIRMIZI-etiketli S. typhimurium SL1027 bakteriler (AC) ve mCherry-etiketli M. gl22 (DE) Zebra balığı embriyolarının 28 at: s1999t (AC) veya Tg (EGFP MPEG1): Tg (Kaede UAS-E1b); gl24: marinum Mma20 bakteriler (DE) Tg kan ada (gal4-VP16 MPEG1) enjekte edildi hpf. S. yaygınlaştırılması gösteren (A) Stereo-floresans ve parlak alan bindirme görüntüsünün 2 hpi (Leica DFC420C kamera ile Leica MZ16FA mikroskop) de kan dolaşımı typhimurium. Kırmızı S. gösteren (İ.Ö.) Konfokal z-yığını projeksiyonları typhimurium bakteri 2 hpi (Leica TCS SPE, HCX APO objektif 40x 0.8 NA) de yeşil makrofajlar tarafından fagosite edilir. Hala ekstrasellüler bakteriler de görülebilir. M. içeren granülom benzeri agrega gösteren (D) Konfokal z-yığını projeksiyon 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40x az marinum Mma20-enfekte olan ve olmayan makrofajlar0.8 NA). Kırmızı, yeşil ve bakteriler makrofajlar. Hücre içi M. sahip bir birey makrofaj ve (E) Konfokal z-yığın çıkıntı (yeşil) marinum bakteriler (kırmızı). Beyaz dikdörtgen D tasvir alanda daha yüksek bir büyütme hedefi (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1.2 NA) ile görüntülendi. Scalebars: 20 mikron.

figure-protocol-4
Şekil 4. Zebra balığı embriyolarının enfeksiyonu için alternatif yollar. (A) mCherry-etiketli M. marinum Mma20 bakteri 32 hpf azından arka beyin ventrikül içine enjekte edildi. Floresans ve 5 hpi (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0.7 NA) de makrofajlar tarafından fagosite mCherry etiketli bakteriler gösteren iletim bindirme görüntüsüne. (B) S. typhimurium 1 dpf'e az kuyruk kas içine enjekte edildi. Enjeksiyon (beyaz daire) için miyeloid hücrelerin mekan f tarafından 3 hpi kısmında gösterilir(C) uninjected embriyolarda ise bu morfolojik sitede hiç miyeloid hücrelerin normal vardır situ hibridizasyon 4, luorescent. Embriyolar bu aşamada olgun nötrofillerin içermemesine rağmen, miyeloid hücrelerin iki nüfus ayırt edilebilir, nötrofil belirteci mpx (yeşil) (Leica TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10.0x ifade makrofaj işaretleyici mfap4 (kırmızı) ve bir ifade bir 0.3 NA). Bakteri Floresans in situ hibridizasyon yordamı sonra kaybolur. (D) Ds-KIRMIZI-etiketli S. 2 dpf'e at i114 zebrabalıkları: typhimurium bakteri Tg otik vezikül (EGFP mpx) enjekte edildi. EGFP etiketli nötrofil hücreler 3 hpi de enfekte kulak vezikül (noktalı elips) çekici, (E) Tg otik vezikül içine PBS kontrol enjeksiyonu ise (mpx edilir: EGFP Stereo-floresans ve parlak bir alan kaplaması görüntüleri mpx gösteriyor ) i114 Zebra balığı enfekte kulak ve nötrofillere cazibe görünmüyorsicle (noktalı elips) (Leica DFC420C kamera ile Leica MZ16FA). (F) M. mCherry-etiketli zayıflatılmış E11 eccCb1 :: tn mutant soy 17 marinum bakteri 1 FAP azından Notokordun içine enjekte edildi. Notokordun içinde Silahların Yayılmasını Önleme 5 dpi (DC500 kamera ile Leica MZ16FA mikroskop) de görüntülendi. (G) M. mCherry-etiketli kan ve lenf damarları endotel hücrelerinde gfp ifade hattı: marinum E11 bakteri Tg (EGFP fli1a) 16-hücreli aşama Zebra balığı embriyolarının sarısı enjekte edildi. Kuyruk bölgede enfekte hücrelerin granülom benzeri agrega oluşumu 5 dpi çözünürlükte görülmektedir (Leica DFC420C kamera ile Leica MZ16FA mikroskop; resim 8).

Tartışma

Bu yazıda tarif enfeksiyonu yöntemler genellikle bilgisayar doğuştan gelen bağışıklık genlerinin ya da bakteriyel virülans genler 1 işlevini incelemek için kullanılır. Intravenöz mikro-enjeksiyon yöntemleri (protokolleri 5 ve 6.1) bu tür çalışmalar için en sık kullanılan. Posterior kan adada kaudal ven 1-günlük embriyoların intravenöz enjeksiyon için en uygun yerdir. Kaudal ven sonraki aşamalarında nüfuz için daha zor hale geldikçe, biz 2-3 dpf'e az embriyo için intravenöz enjeksiyon bölgesi olarak Cuvier ve Kanal tercih. Her durumda kob sayımı için kaplama enjeksiyon inokulum tarafından kontrol edilmelidir bakteri tutarlı numaraları ile embriyo enjekte etmek önemlidir. Aşağıdaki hususların enjeksiyonlar tekrarlanabilir ulaşmak için dikkate alınmalıdır. İlk olarak, yüksek kaliteli cam microcapillary enjeksiyon iğneleri olması şarttır. Iğne ucu kadar büyükse, enjeksiyon meydana kanama için yeterince büyük bir deliği oluşturur veenjekte edilen bakterilerin kan dolaşımını dışarı akacaktır. İkinci olarak, bakteri kan dolaşımı içine doğrudan enjekte edilmesi gerekir. Iğne ucu yolk sac uzatma enjeksiyon sıvısı yayılır damar içine veya eğer değilse, embriyo deneyden atılmalıdır. Üçüncü olarak, M. enjekte etmek için bir taşıyıcı olarak PVP40 kullanılarak marinum cam iğne batıyor gelen bakteri önlemede yardımcı olacaktır. PVP40 enjeksiyon süresi boyunca daha tekrarlanabilir inokulum sonuçlanan, süspansiyon homojen olmasını sağlar. PVP40 da S. için kullanılabilir büyük boyut ve bakterilerin parlak floresan deneyler sırasında enjeksiyon inokulum üzerinde görsel kontrolü sağlar çünkü typhimurium enjeksiyonları, ama burada daha az önemlidir. Enjeksiyonlar uygulama için biz fenol kırmızı boya (% 1 v / v) veya 1 mikron farklı renkler (Invitrogen) mevcut floresan kürelerin kullanılması tavsiye edilir. Teknik hakim edildikten sonra, bu yaklaşık olarak 30 minut alıres agaroz plakalar üzerinde embriyo hizalayarak ve bakteriyel enjeksiyon ses ayarlamak için gereken zaman dahil, 50-100 embriyo enjekte etmek.

Kan ada (protokol 5) veya Cuvier (protokol 6.1) kanal içine intravenöz enjeksiyon en sık kullanılan edilirken, bu video makalede açıklanan enfeksiyon alternatif güzergahlar (protokolleri 6.2, 6.3 makrofaj ve nötrofil kemotaksisini çalışmak için yararlı olan ve 6.4), zayıflatılmış bakteri suşları (protokol 6.5) büyüme incelemek ve yüksek hacimli uygulamalar (protokol 6.6) 4-8 zebrabalıkları enfeksiyon modelinde uyarlamak. Açıklandığı mikro-enjeksiyon yöntemleri de virüsler 18, 19, mantar sporları 14, 20 veya protozoon paraziti (Maria Forlenza, kişisel iletişim) enjeksiyonu için uygulanabilir. Bu video makalesinde tarif enjeksiyon prosedürler yararlı bir ek zebr bakterilerin subkutan enjeksiyon için kısa bir süre önce anlatılan prosedürüafish embriyoların 21. Bu prosedür, yüzeyler üzerinde etkili bir doku engulf bakteri olduğu tespit edilmiştir, ancak nötrofiller, bakterilerin fagositozunu incelemek için uygulanmış, makrofajlar aksine, kan içinde ya da sıvı dolu bir kavite içine enjeksiyon gövdesi üzerine bakteriler fagosite neredeyse olamamıştır. Subkutan enjeksiyonlar embriyolar için bu video makalede açıklanan kuyruk kas enjeksiyon için benzer yerleştirilmiş, ancak iğne bir hücre gruplarının üzerinde bakteri enjekte derinin hemen altında eklenir.

Bu mikro-enjeksiyon esas enfeksiyon yapay bir yol olduğunu dikkate almak önemlidir. Ancak, erken embriyo bakteriyel patojenler dış maruz karşı oldukça dirençlidir. Aslında, embriyolar bakteriyel süspansiyon içinde kalmış olan batırma testleri, bizim elimizde 22 tekrarlanabilir değildir. Bazı embriyolar daldırma üzerine bulaşabilir ederken, ölüm oranları ve ekspres büyük bir değişim gözlemledikBu tür testler bireysel embriyoları arasında inflamatuvar belirteç genlerin iyon. Bu makalede açıklanan mikro-enjeksiyon yöntemleri tekrarlanabilir enfeksiyonları ulaşmak ve host doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile bakteriyel etkileşimleri çalışmak için özellikle faydalıdır. Bireysel embriyolarında bakteriyel enfeksiyon ölçmek için etkin bir yaklaşım ısmarlama, özel piksel ölçümü yazılımı 17, 23 ile enfekte embriyoların floresan görüntüleri analiz etmektir. Bu yaklaşım enfekte embriyoların sonra kaplama kob sayımı sonuçları ile iyi bir korelasyon olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde, embriyo başına lökosit sayısında göreceli değişiklikler transgenik lökosit fluorofor muhabiri hatlarında dijital görüntü analizi ile ölçülebilir edilmiştir; bu yaklaşım enfeksiyon 24 konak leukopoietic yanıt miktarının için geçerli olacaktır.

Konak doğuştan gelen bağışıklık genlerin işlevine tarif enfeksiyonu modelleri birleştirerek in vivo olarak etkili bir şekilde araştırılmıştır edilebilirmorfolino devirme ile. Morpholinos belirli bir hedef RNA ve bu Journal 10, 25 in diğer video makaleler gösterildiği gibi, 1-hücre aşaması zebrafish embriyosu içine enjekte edildiğinde gen ürünleri ifadesi azaltmak sentetik antisens oligonükleotidler şunlardır. Morfolino Knockdown çalışmalarda, karşılaştırılmak üzere tüm embriyo gruplar bakteriyel enjeksiyonları öncesinde doğru sahnelenir büyük önem taşımaktadır. Embriyo zaman içinde giderek yetkin hale gelişmekte olan bir bağışıklık sistemine sahip, çünkü bu özellikle önemlidir.

Zebra balığı embriyolarının en önemli doğal immün alt, makrofaj ve nötrofiller, ayırt etmek için şu anda birçok transgenik muhabiri hatları vardır. Mpx ve lyz arttırıcılar nötrofil raportör çizgileri 16, 26, 27 üretmek için kullanılmış olan ve csf1r (FMS) ve mpeg1 arttırıcılar makrofaj gazetecilere 14, 28 üretmek için kullanıldı. Iken csf1r (FMS) ayrıca xanthophores ifade edilir, MPEG1 ifade makrofajlarda münhasıran. Bu video madde de gösterildiği üzere, yeni geliştirilen mpeg1 raportör hatları makrofajların görüntüleme bakteriyel fagositozunu için son derece yararlıdır.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar balık bakımı için Şekil 4, Ulrike Nehrdich ve Davy de Witt görüntüleri ve yararlı tartışmalar için diğer laboratuvar üyeleri için, Chao Cui teşekkür Kat de Kort, Esther Stoop ve Ralph Carvalho istiyorum. Bu çalışma Ekonomik İlişkiler Hollanda Bakanlığı Smart Mix Programı ve Eğitim, Kültür ve Bilim, Avrupa Komisyonu 7. Çerçeve projesi ZF-SAĞLIK (SAĞLIK-F4-2010-242048), Avrupa Marie-Curie Bakanlığı tarafından desteklenmektedir İlk Eğitim Ağı FishForPharma (PITN-GA-2011-289209) ve Avustralya NHMRC (637.394) tarafından. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü Victoria ve Avustralya Hükümeti Eyalet Hükümeti hibe ile desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Satıcı Katalog numarası
Fenol Red Sigma P0290
Gliserin Sigma-Aldrich 228210
Difco Middlebrook 7H10 agar Becton, Dickenson ve Şirket 262710
BBL Middlebrook OADC Zenginleştirme Becton, Dickenson ve Şirket 211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth Becton, Dickenson ve Şirket 271310
BBL Middlebrook ADC Zenginleştirme Becton, Dickenson ve Şirket 211887
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Polivinilpirrolidon (PVP40) Calbiochem, Merck KGaA 529504
N </ Em>-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Metil selüloz Sigma-Aldrich M0387
SeaPlaque Agaroz (düşük erime noktası agaroz) Lonza A.Ş. 50100
FluoSpheres (1.0 mikron, kırmızı floresan (580/605)) Invitrogen F8821
FluoSpheres (1.0 mikron, (505/515) sarı-yeşil flüoresan) Invitrogen F8823

Kaynaklar

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  3. vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  4. Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
  5. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
  7. Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
  8. Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
  9. van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
  13. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
  14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
  15. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
  16. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  17. Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
  18. Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
  19. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
  20. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
  22. van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
  23. Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
  24. Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
  25. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
  26. Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
  28. Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Bakteriyel EnfeksiyonMikroenjeksiyon TekniğiFloresan BakterilerKonfokal MikroskopiDoğal BağışıklıkKonak-Patojen EtkileşimiSalmonella TyphimuriumMycobacterium MarinumHücre İçi Lokalizasyon
Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.