Yöntem makalesi

DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

DOI:

10.3791/3819

⸱

2 Nisan 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cluster of Excellence CellNetworks, Department of Infectious Diseases, Virology, Heidelberg University, 2Department of Infectious Diseases, Virology, Heidelberg University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz, moleküler DNA aile karıştırma yoluyla sentetik Adeno ilişkili viral (AAV) gen tedavisi vektörleri mühendisi ve gelişmeye temel tekniği göstermek. Ayrıca, biz seçimi ve kültür veya farelerde hedef hücreler üzerinde gelişmiş özellikleri ile bireysel kimerik capsids analizi için genel kurallar ve temsili örnekler sunuyor.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörler nedeniyle yararlı özellikleri 1 benzersiz bir kombinasyonu terapötik insan gen transferi için en güçlü ve gelecek vaat eden bazı araçlar temsil eder. Bu altta yatan wild tip virüsler ve yüksek titresi, yüksek saflıkta ve klinik dereceli rekombinant vektörler 2 üretimi için son derece gelişmiş metodolojileri apathogenicity içerir. Diğer virüsler üzerinde AAV sisteminin bir diğer özel avantajı doğal olarak tüm kolayca ortak bir protokol 1,2 kullanarak vektör olarak tasarlanmış olabilir ama temel özellikleri bakımından farklıdır serotipleri ortaya çıkan bir zenginlik mevcudiyetidir. Ayrıca, kendi de dahil olmak üzere gruba bir dizi son zamanlarda da birden fazla giriş serotiplerin varlıkları, ya da izole bir tek özelliklerini geliştirmek birleştirmek sentetik vektörlerin oluşturulması için şablon olarak bu doğal virüsler kullanma stratejileri geliştirdiler. Ilgili teknolojileri bu hedeflere ulaşmak için are ya DNA aile karılma 3, kısmi benzerliklerin (tipik olarak en AAV serotip için>% 80) veya 4,5 peptid ekran, genellikle yedi amino asitlerin yani ekleme içine dayanarak yeniden montaj ile değişik AAV kapsid genlerin yani parçalanma istenen bir hücre türüne peptid ideal aracılık yeniden hedefleyen viral kapsid bir maruz döngü. Maksimum başarı için her iki yöntem protokolleri yaklaşık bir milyon farklı kapsid varyantların kütüphaneler verim kadar boyutlandırıldıktan sayede Yüksek verimli bir şekilde uygulanır. Her klon, daha sonra birçok ebeveyn virüs benzersiz bir kombinasyonu (DNA karılma yaklaşım) oluşan veya aynı viral omurga (peptid ekran yaklaşım) kendine has bir peptid içerir. Sonraki son adım en veya seçim sürecinin ideal tüm gereklerini yerine getirerek bireysel capsids için zenginleştirmek için hedef hücreler üzerindeki böyle bir kütüphane seçimi iteratif olduğunu. Tercihen tarak ikincisiBöyle anti-AAV antikorları ile reaksiyona tüm capsids örneği ortadan kaldırılması için negatif seçimi ile ilgi belirli bir hücre tipi, üzerinde büyüme gibi ines pozitif basınç,. Bu kombinasyon seçimi kalan sentetik capsids muhtemelen herhangi bir doğal AAV izole bulunan olmazdı şekilde verilen uygulama ihtiyaçlarını eşleşen şansını artırır. Burada, teorik ve iki teknolojinin deneysel daha zorlu olarak DNA aile karıştırma yöntemi odaklanın. Biz açıklamak ve göstermek karıştırılır AAV kütüphanelerinin oluşturulması ve seçim (Şekil 1) için gerekli tüm adımları ve sonra bir ihtiyacı moleküler AAV evrimi ile başarılı olmak için farkında olmak bu protokollerin tuzaklar ve eleştirel yönlerini tartışmak.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. AAV kapsid Genler Kodlama Plazmid Setleri Hazırlanması

  1. Sonraki DNA karıştırma için çeşitli AAV kapsid (kap) genlerin yeterli miktarda rutin hazırlanmasını kolaylaştırmak için, başlangıçta ortak bir plazmid omurga içine bu genlerin subclone. Bu, iç içe geçmiş ve PCR için primer klonlanması için bağlanma yerleri (Şekil 2) daha sonra kullanım için> 20 nükleotid özdeş taarruzcu sekanslar dahil etmek önemlidir.
  2. (AAV5 için örnek primerler Tablo bakınız) uygun primerler kullanılarak PCR genellikle tercih kap gen yanındaki AAV2 rep geni içeren yaygın kullanılabilir AAV plasmidlerden istenilen kap ge....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, DNA aile karıştırma yoluyla ve hücrelerin ya da hayvanlarda evrim için gerekli deneysel adımlar ve AAV kapsid mühendisliği için yönergeleri hazırladık var. Özünde, bu protokoller biz ilk 3, 2008 yılında AAV alanı içinde bildirilen prosedürler standart versiyonları vardır. Başkaları tarafından çalışmaları takip bir telaş birçok değişiklik, örneğin, 10-13 bildirdin iken, bugünkü versiyonları yukarı ölçeklendirme ve herhangi ihtiyaçlarına uyum mükellef olurken tekrarlanabilir sonuçlar.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar ifşa için bir neden olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar minnetle Heidelberg Üniversitesi Mükemmeliyet CellNetworks arasında Küme tarafından yanı sıra Chica ve Heinz Schaller (CHS) vakıf tarafından olağanüstü kendi laboratuvar desteği, ekip üyeleri ve iş kabul ediyorsunuz. DNA aile karıştırma, üç yıl önce bizim ilk yayınlandığından beri çok aktif bir alan haline gelmiştir ve bu nedenle çalışma nedeniyle mekan kısıtlamaları için buraya iktibas edilemedi ilgili yayınların tüm yazarlara özür etti yoluyla Biz moleküler AAV evrim teşekkür ederiz.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası
DNase I Invitrogen 18068-015
Polietilenimin (PEI) Sigma-Aldrich 408727
Kısıtlama enzimleri NEB Çeşitli
T4 DNA ligaz NEB M0202T
Jel ekstraksiyon kiti Qiagen 28704
Phusion II polimeraz Kiti Finnzymes (NEB) F-540S
Hotstar Hifi polimeraz Kiti Qiagen 202602
DMSO Finnzymes (NEB) F-540S (kit parçası)
EDTA (25 mM) Invitrogen 18068-015 (kit parçası)
Tris Roth 4855.2
Ampisilin sodyum tuzu Roth K029.2
dNTP (10 mM, 100 ul) Invitrogen 18427013
Iodixanol (OptiPrep) Eksen-kalkan 1114739
PHENOLRED Merck 107241
Plazmid mega hazırlık seti Qiagen 12181
Ultrasantrifüjdeki Beckman-Coulter Optima L90K
Hızlı-Seal santrifüj tüplerine Beckman-Coulter 342414
Elektroporasyon ünitesi Bio-Rad GenePulserXcell
Termal cycler Eppendorf Vapo Koru
Isıtma bloğu BIOER MB-102
Floresans mikroskobu Olympus IX81
FACS analizörü Beckman-Coulter Cytomics FC500 MLP
MegaX DH10B T1R hücreleri Invitrogen C640003
Benzonase Merck 101695
Adenovirüs-5 ATCC VR-5
plazmid pBluescript KS II (+) Stratagene 212207
cap5F (koyu sarı, cap5 özel dizilerde Pac I site):
GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC 		IDTDNA Özel astar
cap5R (yeşil, kalın cap5 özel dizilerde Asc I site):
GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC 		IDTDNA Özel astar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
  2. Grimm, D.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sentetik AAV Vekt rleriKapsid M hendisli iViral K t phane retimiPlazmit K t phanesiPCR AmplifikasyonuViral Kapsid Se ilimiRaporlay c Gen EkspresyonuWestern Blot

İlgili makaleler