Biz 3D nano-biyofilm oluşan yüksek yoğunluklu mikroarray platformu geliştirdi C. albicans Denir Ca BChip. Ilaç duyarlılık profili bir test Ca BChip mantar çip ideal antifungal ilaçların gerçek yüksek verimli görüntüleme için uygundur düşündüren, geleneksel 96-plaka modeli ile karşılaştırılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)
Bu makalede
Özet
Özet
Candida albicans şu anda ABD hastanelerinde 1 dördüncü en sık görülen nozokomiyal kan dolaşımı enfeksiyonu temsil kandidiazis ana etyolojik ajan kalır. Bu fırsatçı enfeksiyonlar tehlikeye bireylerin sayısının artmasıyla için büyüyen bir tehdit ve kabul edilemez yüksek mortalite oranları taşırlar. Bu en sık kullanılan antifungal ajanlara karşı direncin ortaya çıkmasına da antifungal ilaçların sınırlı cephaneliği nedeniyle kısmen, ama. Ileri tedavi komplike kandidiyazis tezahürleri çoğunluğu biyofilmlerin oluşumu ile ilişkili olduğu bir gerçektir ve bu biyofilm içindeki hücrelerin klinik olarak en kullanılan antifungal ajanlar 2 direnç seviyelerinin artmasına göstermektedir. Burada C. oluşan bir yüksek yoğunluklu mikroarray geliştirilmesi tarif Biz Ca BChip 3 adında var albicans nano-biyofilmlerin. Kısaca, bir robot microarrayer t kullanılırC. o baskı maya hücreleri sağlam bir zemin üzerine albicans. Baskı sırasında, maya hücreleri gibi nL 50 kadar düşük ve uygun bir kaplama ile birlikte bir cam zemin üzerinde immobilize bir birimi kullanılarak, üç boyutlu bir matris içine alınır. İlk baskıdan sonra, slaytlar biyofilm geliştirilmesi için izin vermek için 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Bu dönemde noktalar olgun C ile ilişkili tipik yapısal ve fenotipik özellikleri göstermeyen tam gelişmiş "nano-biyofilm" içine büyümek albicans biyofilm (yani morfolojik karmaşıklığı, üç boyutlu mimari ve ilaç direnci) 4. Genel olarak, Ca BChip ~ 750 eşdeğeri ve mekansal farklı biyofilm oluşur; birden fazla fiş baskılı ve aynı anda işlenebilir olduğu ek avantaj. Hücre canlılığı FUN1 metabolik floresan yoğunluğu mikroarray tarayıcı kullanarak lekeyi ölçerek tahmin edilmektedir. Bu mantar çip ideal u için uygundurantifungal ilaç keşfi için gerçek yüksek verimlilik tarama se. Mevcut standartlar (yani biyofilm 5 96-mikrotiter plate modeli) ile karşılaştırıldığında, fungal biyofilm çip ana avantajları otomasyon, minyatür, miktarı ve reaktifler ve analizler zaman maliyet tasarrufu, hem de işçiliğinin ortadan kaldırılmasına olan yoğun adımları. Biz çip önemli antifungal ilaç keşfi sürecini hızlandırmak inanıyorum.
Protokol
1. Fonksiyonlu Slaytlar hazırlanması
- Çıkarılabilir bir slayt rafa mikroskop yerleştirin ve% 99 etanol (histolojik grade) içeren bir boyama kavanoza daldırarak iki kez yıkayın. Slaytlar sıkıştırılmış azot gazı bir jet kullanarak kağıt havlu (kağıt tozu üretmek için değil sağlanması), ve kuru kullanarak temizleyin.
NOT: ince kağıt tozu üretecek olarak slayt silmek için Kim-Mendil kullanmayın.
- Gece boyunca oda sıcaklığında konsantre sülfürik asit ve inkübe ile doldurulmuş bir boyama kavanoz slaytlar içeren kayar raf batırmak.
NOT: Konsantre asitl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz Candida albicans biyofilmlerin nanoliter ciltten oluşan hücre tabanlı yüksek yoğunluklu mikroarray, Ca BChip geliştirdik. Mikroarray olmayan yayılan, hemisferik 3D jel için gerekli hidrofobluğu sağlarken kollajen jel lekelerin sağlam eki için izin modifiye cam malzeme üzerine basılmıştır. A tek bir Ca BChip yaklaşık sekiz 96-kuyucuklu plaklar yerini alabilir ve birkaç yongaları aynı anda basılır ve işlenebilir. Çip, nano ölçekli kültürler kullanır kolay ve hızlı bir şekilde kullanılmasını .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Jose L. Lopez-Ribot ve antifungal ajanlar geliştiriyor MicrobeHTS Technologies, Inc, Anand K. Ramasubramanian kendi öz. MicrobeHTS Technologies, Inc bu çalışmalar için mali destek sağladı.
Teşekkürler
Bu çalışma, Güney Teksas Teknoloji Yönetimi (POCrr 2009,041), Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (UL 1RR025767) ile Tıp ve Bilim Entegrasyon Enstitüsü, gelen hibelerle ve Diş & Kraniyofasiyal Araştırmalar Ulusal Enstitüsü (kısmen finanse edildi 5R21DE017294).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polistiren-Co-maleyik anhidrid (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Cam mikroskopi slaytlar | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Fare kuyruk kolajeni tip I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotik Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Mikroarray Tarayıcı | Genepix Kişisel 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hibridizasyon Kaset | ArrayIt Şirketi | AHCXD | |
| FUN1 [2-klorro-4-(2,3-dihidro-3-metil-(benzo -1,3-tiyazol-2-il)-metilliden)-1-fenil quinoliniumiodide] | Invitrogen Corp | F-7030 | |
| Flukonazol | Sicor Pharmaceuticals, Inc | J02AC01 | |
| Amfoterisin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc | 50-020-PC | |
| Seramik İpucu 190 mikron orifis | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Yazılımı | GraphPad Software, Inc | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
Kaynaklar
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
