Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

Özet

Nanodiscs fosfolipid çift tabakası küçük bir yama içine membran proteinleri dahil küçük diskoid parçacıklardır. Biz bir disk içine MalFGK2 taşıyıcı adım adım kuruluş gösteren görsel bir protokol sağlar.

Özet

Nanodisc bir diskoidal parçacık (~ 10-12 nm büyük) o tuzağa membran proteinlerinin fosfolipid çift tabakası küçük bir yama içine. Olduğunu Nanodisc özellikle ligand-reseptör etkileşimlerinin bağlamında, zar proteinleri çalışmak için özellikle çekici bir seçenek. Yöntem Sligar tarafından ve arkadaşları, apolipoprotein A1 türetilen bir tasarlanmış çok a-sarmal iskele protein amfipatik özelliklerine dayanmaktadır. Kutup bölgeleri sulu ortamda karşı karşıya iken iskele proteinin hidrofobik yüzleri iki tabakalı lipid ve yağ açil yan zincirleri ile etkileşim. Partikülleri, küçük homojen değildir ve suda çözünebilir olduğu için nanodiscs içinde zar proteinlerinin analizi lipozom göre önemli avantajlara sahiptir. Buna ek olarak, normal olarak çözünür proteinler için ayrılmış biyokimyasal ve biyofiziksel uygulanan yöntemler, ve zarın her iki tarafında olabilir. Bu görsel protokol, biz iyi bir karakter bir adım-adım sulandırma sunmakkarekterize bakteriyel ABC taşıyıcı, erkek-MalFGK ₂ kompleksi. Diskin oluşum deterjan ilerleyen çıkarılması sırasında meydana gelen hidrofobik etkileşimler bağlı olarak bir öz montaj işlemdir. Biz gerekli adımları açıklamak ve agrega ve büyük polidispers lipozom benzeri partiküllerin oluşumunu sınırlamak için doğru protein-to-lipid oranı seçmenin önemini vurgulamak. Basit kalitesi tür diskler düzgün sulandırılmış oylandı emin jel filtrasyon kromatografisi, yerli jel elektroforezi ve dinamik ışık saçılma spektroskopisi olarak denetler.

Protokol

Genel Sulandırma Süreci

Sulandırma işlemi deterjan çözülmüş fosfolipidlerin mevcudiyetinde saflaştırılmış MalFGK ₂ kompleks ile membran protein iskele (MSP) ve karıştırma başlatılır. Adım Bio-boncuk veya Amberlite (Şekil 1) olarak adlandırılan bir emici malzeme ile polistiren deterjan yavaş kaldırılması tarafından takip edilir. Otomatik montaj işlemi çünkü hidrofobik fosfolipidler, MalFGK ₂ karmaşık ve MSP amfipatik proteinin yüzeyi ile apolar etkileşim büyük olasılıkla oluşur. Nihai ürün MalFGK ₂ kompleks MSP sarma iki molekül yapılmış bir disk biçiminde bir parçacıktır. Partiküller ul....

Tartışma

Biz nanodiscs içine maltoz taşıyıcı sulandırılması için basit bir prosedür açıklanmaktadır. Taşıyıcı ATPaz aktif ve çözünen bağlayıcı ortağı erkek ile etkileşim (Şekil 3) yeniden olabilir. Nanodiscs içine taşıyıcı başarılı rekonstitüsyon ek biyofiziksel ve biyokimyasal analiz için yolu açın. Özellikle ilgi Of Malk ATPaz ve deterjan maltoz taşımacılık faaliyeti, lipozom ve nanodiscs sistematik analiz olacaktır. ABC taşıyıcıları taşıma döngüsü sırasında konformasyonlar değiştirebilirsiniz ancak bu konform.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amicon Ultra-4 50K santrifüj filtre	Millipore	UFC805008	Uygun kullanımı için üreticinin protokol izleyin
Bio-Boncuk SM-2 Adsorban	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipid	Avanti Polar Lipids	100500C	Kloroform içinde çözülmüş, bir organik çözücü uygun olarak işlemek
Ni Sepharose HP reçine	GE Healthcare	17-5268-01
Fosforlu standart çözelti	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Tablo I. Belirli reaktifler.
			Isim Kompozisyon Yorumlar DDM stok % 10 w / v DDM -20 ° C'de milliQ su ve mağaza süspanse MalFGK 2 stok 1-2 mg / ml ' 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl % 10 h / h gliserol % 0.03 w / v DDM -70 ° C'de saklayın sonra purification MSP stok 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl % 10 h / h gliserol -70 ° C'de saklayın <1 ml alikotları arıtma sonrası ve aşırı donma / çözülme döngüleri önlemek Fosfolipid stok 5 nM E. coli lipidler toplam % 0.5 w / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCI, pH 7.9 50 mM NaCl 1 hafta boyunca 4 ° C'de depolayın TS tampon 50 mM Tris-HCI, pH 7.9 50 mM NaCl 4 ° C'de saklayın TSG10 tampon 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl % 10 h / h gliserol 4 ° C'de saklayın TSG20 tampon 50 mM Tris-HCl, PH8 100 mM NaCl % 20 h / h gliserol 4 ° C'de saklayın TSGD tampon 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl % 10 h / h gliserol % 0.03 w / v DDM 4 ° C'de saklayın ve sadece kullanmadan önce DDM ekleyin Tablo II. Çözüm tarifleri.