Yöntem makalesi

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama In situ Hibridizasyon

DOI:

10.3791/4007

⸱

28 Haziran 2012

 ,  , 
1Department of Entomology, Virginia Tech

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyük ölçüde paralel DNA dizileme teknolojilerine dayanan genom düzenekleri genellikle oldukça parçalıdır. Fiziksel kromozom haritalarının geliştirilmesi, genom montajlarını potansiyel olarak iyileştirebilir. Burada, kromozom hazırlama, floresan in situ hibridizasyon ve fiziksel harita geliştirme verimini önemli ölçüde artıran görüntülemeye yönelik yenilikçi yaklaşımlar gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

10.000 omurgalı türü1 ve 5.000 böcek ve ilgili eklembacaklı türü2 için tam genom dizileri elde etme projelerinin önümüzdeki 5 yıl içinde gerçekleşmesi bekleniyor. Örneğin, 15 sıtma sivrisinek türü için genomların dizilimi şu anda bir Illumina platformu3,4 kullanılarak yapılmaktadır. Bu Anofel tür kümesi, sıtmanın hem vektörlerini hem de vektör olmayanlarını içerir. Genom düzenekleri kullanılabilir hale geldiğinde, araştırmacılar vektör yeteneğiyle ilgili evrimsel değişiklikleri çıkarmak için karşılaştırmalı analiz yapmak için eşsiz bir fırsata sahip olacaklar. Bununla birlikte, yüksek kaliteli de novo genom derlemeleri oluşturmak için yeni nesil dizileme okumalarını kullanmanın zor olduğu kanıtlanmıştır5. Ayrıca, Anopheles gambiae için mevcut genom düzenekleri, Sanger yöntemi kullanılarak elde edilmesine rağmen, boşluklu veya parçalıdır4,6.

Karşılaştırmalı genomik analizlerin başarısı, araştırmacıların kromozom tabanlı genom düzenekleri yerine çok sayıda dizileme contigs ile ilgilenmeleri durumunda sınırlı olacaktır. Parçalanmış, eşlenmemiş diziler genomik analizler için sorun yaratır çünkü: (i) tanımlanamayan boşluklar genomik dizilerin yanlış veya eksik açıklanmasına neden olur; (ii) eşlenmemiş diziler, paralog genler ve farklı haplotiplerden gelen genler arasında karışıklığa yol açar; ve (iii) dizileme contigs'in kromozom ataması ve oryantasyonunun olmaması, yeniden yapılanmaya, filogeniye ve kromozom evriminin incelenmesine izin vermez. Yeni dizilenmiş genomlara sahip türler için yüksek çözünürlüklü fiziksel haritalar geliştirmek, genom açıklamalarını, evrimsel analizi ve doğal popülasyonlardan bireysel genomların yeniden dizilenmesini kolaylaştıracak zamanında ve uygun maliyetli bir yatırımdır7,8.

Burada, kromozom hazırlama, floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve fiziksel haritaların hızlı bir şekilde geliştirilmesini kolaylaştıran görüntülemeye yönelik yenilikçi yaklaşımlar sunuyoruz. Örnek olarak An. gambiae'yi kullanarak, fiziksel kromozom haritalarının geliştirilmesinin genom montajlarını ve dolayısıyla genomik analizlerin kalitesini potansiyel olarak iyileştirebileceğini gösteriyoruz. İlk olarak, politen kromozom yayılımlarını hazırlamak için yüksek basınçlı bir yöntem kullanıyoruz. Başlangıçta Drosophila9 için geliştirilen bu yöntem, kullanıcının kromozomlar hakkında normal ezme tekniğinden10 daha fazla ayrıntıyı görselleştirmesini sağlar. İkincisi, yüksek verimli fiziksel genom haritalaması için FISH için tam otomatik, ön uç bir sistem kullanılır. Otomatik lam boyama sistemi aynı anda birden fazla tahlil yapar ve uygulama süresini önemli ölçüde azaltır11. Üçüncüsü, motorlu bir slayt aşaması içeren otomatik bir floresan görüntüleme sistemi, FISH12'den sonra etiketlenmiş kromozomları otomatik olarak tarar ve fotoğraflar. Bu sistem özellikle aynı slaytta birden fazla kromozomal plakayı tanımlamak ve görselleştirmek için kullanışlıdır. Ek olarak, tarama işlemi daha homojen bir FISH sonucu yakalar. Genel olarak, otomatikleştirilmiş yüksek verimli fiziksel haritalama protokolü, standart bir manuel protokolden daha verimlidir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Yumurtalık Hemşire Hücrelerinden Yüksek Basınçlı Politen Kromozom Hazırlanması

  1. Yarı gravid Anofel dişilerini kanla beslendikten 25 saat sonra diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve yumurtalıkları metanol (% 100 metanol: buzlu asetik asit, 3: 1) ile taze modifiye Carnoy çözeltisinde sabitleyin. Bu aşamada yumurtalıklar, foliküllerin oval bir şekle sahip olduğu ve foliküllerin içinde hemşire hücrelerinin bulunduğu şeffaf bir alanın yuvarlak bir şekle sahip olduğu Christophers'ın III gelişim aşamasındadır13. Yaklaşık beş dişiden alınan yumurtalıkları 1.5 ml'lik bir Eppendorf tüpünde 500 μl modifiye Carnoy çözeltisine koyun ve 24 saat oda sıcaklığında tutun. Uzun süreli depolama için yumurtalıkları -20 °C'ye aktarın.
  2. Slaytlar yapmadan hemen önce etanol (0 etanol: buzlu asetik asit, 3:1) ve P propiyonik asit ile modifiye Carnoy çözeltisini hazırlayın. Bir çift yumurtalıkları, bir damla modifiye Carnoy solüsyonunun içine tozsuz bir slayta yerleştirin. Yumurtalıkları diseksiyon iğneleri ile yaklaşık 6 bölüme ayırın ve bunları bir diseksiyon MZ6 Leica stereomikroskop altında temiz slaytlar üzerine% 50 propiyonik asit damlalarına yerleştirin. Her bölüm için ayrı bir slayt kullanın.
  3. İğneler kullanarak diseksiyon yapan folikülleri ayırın ve kalan dokuyu diseksiyon mikroskobu altında filtre kağıdı veya kağıt havlu ile silin. Foliküllere yeni bir damla% 50 propiyonik asit ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika bekletin. P propiyonik asit damlacığının üzerine bir lamel yerleştirin. Slaytı yaklaşık 1 dakika bekletin.
  4. Slaytı filtre kağıdı ve plastikle sarın. 3000-5000 RPM arasında ayarlanmış yumuşak plastik uçlu ve Flex-Shaft bağlantı parçalı bir Dremel 200 döner alet kullanarak, ucu daireler halinde döndürerek ve çekirdekleri eşit şekilde yaymak için lamel üzerine hafifçe bastırarak folikülleri ifade edin. Bu adım yaklaşık 1 dakika sürmelidir. 20x objektif kullanan bir Olympus CX41 Faz Mikroskobu ile yayılma kalitesini kontrol edin.
  5. Kromozomları kaplayan lamel yanına ek bir lamel koyarak bir sandviç hazırlayın ve üzerlerini ikinci bir mikroskop lamı ile örtün. Bu, mengenedeki sürgünün ezilme olasılığını azaltır. Slaytları, sandviçi tutmak ve mengene nedeniyle çizilmeye karşı korumak için cam slayt kapları ve filtre kağıdı içinde gelen plastik bir tabaka ile sarın.
  6. Mekanik mengene ile kızaklara baskı uygulayın. 85-120 inç-lbs'lik bir basınç yeterlidir ve bir tork anahtarı kullanılarak elde edilir. Bu adım, kromozomları mümkün olduğunca düzleştirmek için gereklidir.




























































































figure-protocol-1

figure-protocol-2

figure-protocol-3

figure-protocol-4

figure-protocol-5

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek basınçlı prosedürün en kritik adımı, Christophers'ın yumurtalık gelişiminin III. aşamasında izole edilen yumurtalık hemşire hücrelerinin uygun şekilde ezilmesidir13. Yanlış ezme, kromozomların yeterince yayılmamasına neden olabilir ve bu da FISH'ten sonra prob konumlarını belirlemeye çalışırken sorunlara neden olabilir. Kromozomlar aşırı ezilirse, bantlama desenlerinin kaybolduğu noktaya kadar kırılabilir veya uzayabilirler. Birden fazla lamın üretilmesi, Dremel aletini kullanarak slaytları ezmeye çalışırken bir tutarlılık sağlamalıdır, bu da genel lam üretim verimliliğini artıracaktır. Yüksek basınç tekniği ilk olarak D. melanogaster9'un yeni izole edilmiş tükürük bezleri için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, sivrisineklerin yumurtalıkları, kromozomal preparatlar için kullanılmadan önce modifiye Carnoy'un fiksatif solüsyonunda (hacimce 3 metanol: 1 buzlu asetik asit) rutin olarak korunur. Bu nedenle, sıtma sivrisineği An. gambiae'nin sabit yumurtalık hemşire hücresi politen kromozomları için uygun hale getirmek için mevcut yüksek basınç protokolünü değiştirdik. Yüksek basınç, tüm slaytın oldukça paralel bir çalışma yüzeyine sahip hassas bir mengene kullanılarak uygulandığından, kromozom kabağını hazırlamak, kurşun kalem silgisiyle geleneksel bir vurma tekniği kullanmaktan önemli ölçüde daha az zaman alır.

Diğer önemli adımlar, foliküllerin %50 propiyonik asit içinde yeterince ıslatılması ve slaytın ısıtılmasını içerir. Bu adımların her ikisi de kromozomları düzleştirmeye yardımcı olmak için gereklidir. İhmal edilirlerse, kromozomlar dehidrasyondan sonra parlak görünebilir ve bu da potansiyel olarak FISH'teki bir sinyalle karıştırılabilecek aşırı miktarda arka plana yol açar. Yüksek basınçlı ezme tekniği, mitotik kromozom preparatları yaparken aynı çözümleri kullanarak da iyi çalışır. Ek yayılma ve düzleşme, kromozomların çekirdeklerinden daha iyi ifade edilmesine yardımcı olur. Eşit basınç eklemek, ölçümlere ve boyamadan görülebilen bantların potansiyel olarak daha iyi çözünürlüğüne izin vermek için bunları uygun şekilde düzleştirmelidir. Mitotik kromozomların sivrisineklerden izole edilmesiyle ilgili ayrıntılar başka bir yerde verilmiştir15. Düzenli kabak preparatları, FISH 16 ve immün boyama17 dahil olmak üzere birçok amaç için yeterli olsa da, yüksek basınçlı yöntem yalnızca bir slayttan diğerine potansiyel varyansı azaltmakla kalmaz, aynı zamanda genel kromozom kalitesini de artırarak kromozomları haritalandırırken daha yüksek ayrıntıya yol açar. Bu prosedür aynı zamanda lazer yakalama mikrodiseksiyonu için politen kromozom membran slaytlarının hazırlanması için de kullanılabilir.

Yüksek basınç yönteminin sınırlamaları arasında slayt kırılması ve kromozomların aşırı gerilmesi yer alır. Mengene aracılığıyla kızağa çok fazla baskı uygulanmasından kaynaklanan kızak kırılması mümkündür, ancak makalede belirtilen basınçlar kullanılarak sınırlandırılır. Kromozomların aşırı gerilmesi için, Dremel aleti lam üzerine uzun bir süre uygulanırsa, kromozomların çok fazla gerilmesi ve çözünürlüğünü kaybetmesi olasılığı vardır. Bu durum, aleti kısa bir süre uygulayarak, mikroskop altında kontrol ederek ve kromozomlar yeterince yayılmamışsa Dremel aletiyle daha fazla zaman uygulayarak giderilebilir.

Geleneksel bir FISH protokolü, genellikle 5-20 dakika uzunluğunda olan ve deneyin tüm süresi boyunca bir araştırmacının neredeyse tüm dikkatini gerektiren bir dizi yıkama ve inkübasyon adımını içerir. Ayrıca, manuel olarak işlenebilecek slayt sayısı genellikle belirli bir deneyde birkaç slaytla sınırlıdır. Buna karşılık, otomatik bir slayt boyama sistemi tüm adımları (yıkama, inkübasyon, prob uygulaması, denatürasyon, hibridizasyon, lamel uygulaması ve çıkarma dahil) otomatik olarak gerçekleştirir. Bu, bir FISH deneyinde bir araştırmacı için 6-8 çalışma saatine kadar zaman kazandırır. Ayrıca, otomatik bir FISH sistemi verimi önemli ölçüde artırabilir. Örneğin, Xmatrx sistemi aynı anda tek hazırlık slaytlarında 40'a kadar testi ve ikili hazırlık slaytlarında 80'e kadar testi işleyebilir. Bu sistemin sınırlamaları arasında, büyük hacimli çözeltilerin hazırlanmasını gerektirdiğinden az sayıda FISH deneyi için verimli olmaması da yer almaktadır. Ayrıca sistemde programlanan FISH protokolü, yeni uygulamalar için değişiklik ve ayarlamalar gerektirebilir.

Slayt tarama sistemi, floresan mikroskobun otomatik bir versiyonudur. Otomatik sahne hareketi ve basit bir mikroskop kontrol paneli, araştırmacıya zaman kazandırır ve mikroskobun çalıştırılmasını son derece basit hale getirir. Örneğin, ACCORD PLUS tarama sistemindeki yazılım, birden fazla floresan kanalının kolayca yakalanmasına ve görüntü alımının kolay yönetilmesine olanak tanır. Bunun bir örneği, tek bir görüntü almak yerine z-yığını yakalamanın dahil edilmesidir; Yazılım, en az bir görüntünün odakta kalmasını sağlamak için yapılandırılabilir bir z-yığını görüntü yakalar. Bu sistem daha çok çoklu görüntü elde etmek için yapılmış olsa da (tek bir slaytta çok sayıda hücre), yine de slaytta kromozomları bulmayı, slaytta manuel olarak gezinmekten çok daha kolay hale getirir.

Hem otomatik slayt boyama sistemi hem de tarama sistemi, sitogenetik klinikleri tarafından insan hücrelerindeki kromozomal anormalliklerin FISH teşhisi için rutin olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, temel bir araştırma uygulaması için bu otomatik sistemleri kullanan bir protokol geliştirdik. Otomatik yüksek verimli fiziksel haritalama protokolü, ilgilenilen herhangi bir tür için fiziksel kromozom haritalarının hızlı bir şekilde geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Bu raporda fiziksel haritalama için politen kromozomları kullanmış olsak da, bu sistemlerle mitotik kromozomlar da kullanılabilir. Organizmaların çoğu okunabilir politen kromozomları geliştirmediği için protokolün mitotik kromozomlara göre ayarlanması faydalı olacaktır. Bununla birlikte, politen kromozomları, mevcut olduğunda, fonksiyonel genom alanlarının kromozom yapısı ile en yüksek çözünürlükteki yazışmaları hakkında faydalı bilgiler sağlayabilir. Bant kalıpları ve bantlar arası modeller gibi politen kromozomlarının organizasyon ilkeleri, son zamanlarda normal politen olmayan (interfaz) kromozomlarınkine benzetilmiştir18. Bu nedenle, yüksek basınçlı kromozom preparatları üzerinde gerçekleştirilen ayrıntılı fiziksel haritalama, DNA dizilerini bantlar, bantlar arası, puflar, sentromerler, telomerler ve heterokromatin gibi spesifik kromozomal yapılara bağlama potansiyeline sahiptir; böylece kromozom bazlı genom düzenekleri oluşturur.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri 1R21AI094289'dan Igor V. Sharakhov'a verilen hibe ile desteklenmiştir. Xmatrx Otomatik Slayt Boyama Sistemi ve ACCORD PLUS Otomatik Tarama Sistemi, Ekipman Güven Fonu programı, Fralin Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Entomoloji Bölümü ve Virginia Tech Biyokimya Bölümü yardımıyla satın alındı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
22x22 mm mikroskop lamelFisher12-544-10
18x18 mm mikroskop lamelFisher12-553-402
Asetik asitFisherA491-212
MetanolFisherA412-4
Propiyonik asit Sigma-Aldrich402907
Dremel 200 Flex-Shaft döner alet ekRand3" Çok Amaçlı Mini Tezgah Üstü Öğütücü (hız sınırlayıcılı)
Özel olarak tasarlanmış 200 μ l Dremel aleti Pipetman için plastik uçlar (boncuklu plastik kenarlar)F171300Pipet uçlarının yağ ucunu kesin ve ısıtın
Kalay kaplı hızlı mengeneAvenger Gold ToolmakerMTC-200-1Hassas zemin kare ve 0.00025 içinde paralel
Tork anahtarıCraftsman44593
ThermoBrite Slide Denatürasyon/Hibridizasyon SistemiAbbott Molecular30-144110
25 mm bariyer kızaklarıAbbott MolecularXT108-SL
25 mm lamellerAbbott MolecularXT122-90X
Xmatrx Otomatik Slayt Boyama SistemiAbbott Molecular08L46-001
MZ6 Leica stereomikroskopLeicaVA-OM-E194-354Farklı bir stereomikroskop kullanılabilir
Olympus CX41 Faz MikroskobuOlympusCX41RF-5Farklı bir faz mikroskobu kullanılabilir
ACCORD PLUS Otomatik Tarama SistemiBioView (ABD)BV-5000-ACCP
10x PBSInvitrogenP5493
%10 NBF (nötr tamponlu formalin)Sigma-AldrichHT501128
%99 formamidFisher ScientificBP227500
Dekstran sülfat sodyum tuzuSigmaD8906
20x SSC tamponuInvitrogenAM9765
Sodyum fosfatSigma-AldrichS3264
50x Denhardt çözeltisiSigma-AldrichD2532
Sodyum azidSigma-AldrichS2002
InvitrogenY3601içinde 1 mM YOYO-1 iyodür (491/509) çözeltisi
ProLong Altın antifade reaktifi InvitrogenP36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTPFermentasR0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTPGE Sağlık PA53022, PA55022
BSASigmaA3294
DNA polimeraz IFermentasEP0041
DNaz I FermentasEN0521
DMSO Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species. J. Hered. 100, 659-674 (2009).
  2. Robinson, G. E., et al. Creating a Buzz About Insect Genomes. Science. 331, 1386-1386 (2011).
  3. Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from: http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/ (2012).
  4. Besansky, N. Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites. White Paper. , 1-15 (2008).
  5. Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. Limitations of next-generation genome sequence assembly. Nature. 8, 61-65 (2011).
  6. Sharakhova, M. V., et al. Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly. Genome Biol. 8, R5(2007).
  7. Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. Every genome sequence needs a good map. Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).
  8. Bhutkar, A., et al. Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes. Genetics. 179, 1657-1680 (2008).
  9. Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nature. 4, 483-485 (2007).
  10. George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).
  11. FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from: http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html (2012).
  12. The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from: http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332 (2012).
  13. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction. , Chapman & Hall. (1992).
  14. BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from: http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/ (2012).
  15. Sharakhova, M. V., et al. Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).
  16. Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis. J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).
  17. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling. J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).
  18. Vatolina, T. Y., et al. Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 6, (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kromozom Haz rlamaFloresan In Situ HibridizasyonOtomatize G r nt lemeY ksek Bas n Y ntemiPoliten KromozomlarAnopheles gambiaeNick TranslasyonuOtomatize Lam BoyamaFloresan G r nt leme SistemiFiziksel Genom Haritalama

İlgili makaleler