Kitlesel paralel DNA dizileme teknolojilerine dayalı genom dizilimleri genellikle oldukça parçalıdır. Fiziksel kromozom haritalarının geliştirilmesi, genom dizilimlerini potansiyel olarak iyileştirebilir. Burada, fiziksel harita geliştirme verimliliğini önemli ölçüde artıran kromozom hazırlama, floresan in situ hibridizasyon ve görüntüleme yöntemlerine yönelik yenilikçi yaklaşımları sunmaktayız.
Yöntem makalesi
Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama
Bu makalede
Özet
Özet
10.000 omurgalı türü1 ve 5.000 böcek ve ilgili eklembacaklı türü2 için tüm genom dizilerini elde etmeye yönelik projelerin önümüzdeki 5 yıl içinde gerçekleşmesi beklenmektedir. Örneğin, 15 sıtma sivrisineği türünün genomlarının dizilemesi şu anda bir Illumina platformu kullanılarak gerçekleştirilmektedir3,4. Bu Anopheles türleri kümesi hem sıtma vektörlerini hem de vektör olmayanları içermektedir. Genom montajları erişilebilir olduğunda, araştırmacılar vektör yeteneğiyle ilgili evrimsel değişiklikleri anlamak için karşılaştırmalı analizler yapma konusunda eşsiz bir fırsata sahip olacaklardır. Ancak, yüksek kaliteli de novo genom montajları üretmek için yeni nesil dizileme okumalarını kullanmanın zor olduğu kanıtlanmıştır5. Ayrıca, Anopheles gambiae için mevcut genom montajları, Sanger yöntemiyle elde edilmiş olmalarına rağmen, boşluklu veya fragmante durumdadır4,6.
Araştırmacıların kromozom tabanlı genom montajları yerine çok sayıda sekanslama contig'i ile uğraşması durumunda, karşılaştırmalı genomik analizlerin başarısı sınırlı kalacaktır. Fragmanlaşmış, haritalanmamış sekanslar genomik analizler için şu nedenlerle sorun oluşturur: (i) tanımlanmamış boşluklar, genomik sekansların hatalı veya eksik anotasyonuna yol açar; (ii) haritalanmamış sekanslar, paralog genler ile farklı haplotiplerden gelen genler arasında karışıklığa neden olur; ve (iii) sekanslama contig'lerinin kromozom atamasının ve yöneliminin eksikliği, yeniden düzenleme filogenisinin yeniden yapılandırılmasına ve kromozom evriminin incelenmesine izin vermez. Yeni sekanslanmış genomlara sahip türler için yüksek çözünürlüklü fiziksel haritalar geliştirmek; genom anotasyonunu, evrimsel analizi ve doğal popülasyonlardan bireysel genomların yeniden sekanslanmasını kolaylaştıracak zamanında ve maliyet etkin bir yatırımdır7,8.
Burada, fiziksel haritaların hızlı bir şekilde geliştirilmesini kolaylaştıran kromozom hazırlama, floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve görüntüleme konularında yenilikçi yaklaşımlar sunuyoruz. An. gambiae örneğini kullanarak, fiziksel kromozom haritalarının geliştirilmesinin genom montajlarını ve dolayısıyla genomik analizlerin kalitesini potansiyel olarak artırabileceğini gösteriyoruz. İlk olarak, politen kromozom yayılımları hazırlamak için yüksek basınçlı bir yöntem kullanıyoruz. Aslında Drosophila için geliştirilen bu yöntem9, kullanıcının kromozomlar üzerinde standart ezme tekniğine10 kıyasla daha fazla detayı görselleştirmesine olanak tanır. İkinci olarak, yüksek kapasiteli fiziksel genom haritalama için tamamen otomatik bir ön uç FISH sistemi kullanılmıştır. Otomatik lam boyama sistemi, birden fazla analizi eş zamanlı olarak yürütür ve manuel uygulama süresini önemli ölçüde azaltır11. Üçüncü olarak, motorize bir lam tablası içeren otomatik bir floresan görüntüleme sistemi, FISH sonrası işaretlenmiş kromozomları otomatik olarak tarar ve fotoğraflar12. Bu sistem, özellikle aynı lam üzerindeki birden fazla kromozomal alanın tanımlanması ve görselleştirilmesi için kullanışlıdır. Ek olarak, tarama işlemi daha üniform bir FISH sonucu yakalar. Genel olarak, otomatik yüksek kapasiteli fiziksel haritalama protokolü, standart manuel bir protokolden daha verimlidir.
Protokol
1. Overyum Besleyici Hücrelerinden Yüksek Basınçlı Politen Kromozom Hazırlama
- Kan beslemesinden 25 saat sonra, yarı-gebe Anopheles dişilerini bir diseksiyon mikroskobu altında disseke edin ve yumurtalıkları metanol içeren taze modifiye Carnoy çözeltisinde (100% metanol: glasik asetik asit, 3:1) sabitleyin. Bu aşamada yumurtalıklar, foliküllerin oval bir şekle sahip olduğu ve foliküller içindeki hemositik hücrelerin bulunduğu şeffaf alanın yuvarlak bir şekil aldığı Christophers' III gelişim aşamasındadır13. Yaklaşık beş dişiden alınan yumurtalıkları, 1,5 ml'lik bir Eppendorf tüpü içindeki 500 μl modifiye Carnoy çözeltisine koyun ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. Uzun süreli saklama için yumurtalıkları -20 °C'ye aktarın.
- Slaytlar hazırlanmadan hemen önce, etanol (100% etanol: glasik asetik asit, 3:1) ve %50 propiyonik asit ile modifiye Carnoy çözeltisi hazırlayın. Bir çift yumurtalığı, tozsuz bir slayt üzerindeki bir damla modifiye Carnoy çözeltisine yerleştirin. Yumurtalıkları diseksiyon iğneleriyle yaklaşık 6 bölüme ayırın ve bir MZ6 Leica stereomikroskobu altında temiz slaytlardaki %50'lik propiyonik asit damlalarına yerleştirin. Her bölüm için ayrı bir slayt kullanın.
- Folikülleri iğneler kullanarak ayırın ve kalan dokuları diseksiyon mikroskobu altında filtre kağıdı veya kağıt havlu ile temizleyin. Foliküllere yeni bir damla %50'lik propiyonik asit ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika bekletin. %50'lik propiyonik asit damlasının üzerine bir kapatma lamı yerleştirin. Slaytı yaklaşık 1 dakika boyunca bekletin.
- Slaytı filtre kağıdı ve plastik ile sarın. Flex-Shaft aparatı ve yumuşak plastik uçlu, 3000-5000 RPM arasına ayarlanmış bir Dremel 200 döner alet kullanarak, ucu dairesel hareketlerle döndürüp kapatma lamına hafifçe bastırarak çekirdeklerin eşit şekilde yayılmasını sağlayarak folikülleri açın. Bu işlem yaklaşık 1 dakika sürmelidir. Yayılım kalitesini, 20x objektif kullanan bir Olympus CX41 Faz Mikroskobu ile kontrol edin.
- Kromozomları örten kapatma lamının yanına ek bir kapatma lamı yerleştirerek ve üzerlerini ikinci bir mikroskop lamı ile kapatarak bir sandviç hazırlayın. Bu işlem, lamın mengenede ezilme olasılığını azaltır. Sandviçi tutmak ve lamı mengeneye bağlı çizilmelerden korumak için lamları, cam lam kaplarında bulunan plastik levha ve filtre kağıdı ile sarın.
- Mekanik mengene aracılığıyla lamlara basınç uygulayın. 85-120 inch-lbs'lik bir basınç yeterlidir ve bir tork anahtarı kullanılarak elde edilir. Bu adım, kromozomların mümkün olduğunca düzleştirilmesi için gereklidir.
- İkinci mikroskop lamını ve ek kapatma lamını çıkarın. Kromozomları örten kapatma lamlı slaytı, kromozomları daha fazla düzleştirmek için bir slayt denatürasyon/hibritleme sisteminde 10-15 dakika boyunca 55 °C'ye ısıtın. Slaytı en az 15 saniye boyunca sıvı azot içine daldırın ve kabarcıklar durduğunda, kapatma lamını bir jiletle hızla çıkarın. Slaytları derhal 5 dakika boyunca soğuk %50'lik etanole yerleştirin. Slaytları sırasıyla %70, %90 ve %100'lük etanolde 5'er dakika boyuncadehidre edin. Slaytları havada kurutun.
2. Otomatik Lam Boyama Sistemi Kullanarak FISH
Prob işaretlemesi hariç, aşağıdaki adımların yürütülmesi için Xmatrx otomatik lam boyama sistemi ile program ayarlanmıştır. Detaylı nick-translation işaretleme protokolü, Fermentas'tan temin edilen DNA polimeraz ile birlikte sunulan dokümantasyonda açıklanmıştır.
- FISH işleminden önce, bir nick-translation protokolü kullanarak genomik BAC DNA'yı bir florokrom ile işaretleyerek floresan probları hazırlayın. 1 μg DNA, her birinden 0.05 mM işaretlenmemiş dATP, dCTP ve dGTP ve 0.015 mM dTTP, 1 μl Cy3- veya Cy5-dUTP, 0.05 mg/ml BSA, 5 μl 10x nick-translation tamponu, 20 ünite DNA polymerase I, 0.0012 ünite DNase I ve nükleaz içermeyen suyu toplam 25 μl olacak şekilde karıştırın. DNA polymerase I/DNase I oranı, 300 ila 500 bp boyut aralığında problar elde etmek için ampirik olarak seçilir. Karışımı 15 °C'de 1 saat inkübe edin.
- Slaytları ve reaktifleri Xmatrx otomatik slayt boyama sistemine yerleştirin ve aşağıdaki adımları çalıştırmak için programı başlatın. 20 dakika boyunca 800 μl 1x PBS uygulayın. Slaytları hava ile kurutun. 1x PBS içinde %4 formalinin 450 μl'sini 1 dakika boyunca uygulayarak formaldehit fiksasyonu gerçekleştirin; ardından iki kez 1 saniye ve bir kez 2 dakika boyunca %100 etanol ile yıkayın. Slaytları hava ile kurutun.
- Problar uygulandığında kabarcık oluşmasını önlemek için slaytları 45 °C'de 2 dakika ısıtın. 20 μl DNA probu uygulayın, hibridizasyon solüsyonunun buharlaşmasını önlemek için mineral yağı damlaları ekleyin ve üzerine bir kapatma lamı yerleştirin. Slaytları 90 °C'de 10 dakika ısıtarak kromozomları ve DNA problarını denatüre edin.
- Hibridizasyon için slaytları kapatma lamları takılı halde 42 °C'de 14 saat inkübe edin. Hibridizasyon solüsyonu 2x SSC, 100 mM sodyum fosfat, 1x Denhardt çözeltisi, 100 μg/ml sodyum azid ve formamid içinde %10 dekstran sülfattan oluşur.
- Stringens yıkamaları için slaytları 42 °C'de 2 dakika ısıtın, kapatma lamlarını çıkarın ve slaytları 2x SSC ile 1 saniye boyunca 4 kez yıkayın. Slaytları hava ile kurutun. 42 °C'de 10 dakika boyunca 2 kez 800 μl 0.4x SSC uygulayın. Slaytları 25 °C'de 10 dakika boyunca 2x SSC ile yıkayın.
- 1x PBS içinde 1 μM YOYO-1'in 50 μl'sini uygulayarak kromozom boyamasını gerçekleştirin. Boyama solüsyonunun buharlaşmasını önlemek için mineral yağı damlaları ekleyin, kapatma lamlarını yerleştirin ve 25 °C'de 10 dakika inkübe edin. Kapatma lamlarını çıkarın, slaytları 2x SSC ile 1 saniye boyunca 4 kez yıkayın. Slaytları hava ile kurutun. 15 μl ProLong Gold antifade reaktifi uygulayın. Kapatma lamlarını yerleştirin.
3. Otomatik Florasan Görüntüleme Sistemi ile Lam Okuma
Bu bölüm, ACCORD PLUS otomatik tarama sistemiyle standart olarak gelen Duet yazılımının kullanımını detaylandırmaktadır. Talimatlar, şu sırayla açma işlemleri yapıldıktan sonra başlar: halojen ampul için Olympus U-RFL-T güç kaynağı, Dell precision T3500 bilgisayar, bağlı bir Olympus U-CMAD3 kamera ile Olympus BX61 mikroskobu.
- 10x Ön Tarama (Pre-Scan) kurulumu için, ACCORD PLUS otomatik tarama sistemindeki Duet yazılımını açın. "Online" düğmesine tıklayın. Yeni bir Case ID girin ve bir Slide ID atayın. "BF" etiketli noktaya tıklayın; bu, parlak alan (brightfield) seçeneğidir. Tarama seçimini "10x Prescan" olarak ayarlayın. "2500x circle", "10000x circle" veya "rectangle" seçeneğini kullanın. 10x Ön Tarama için "Set&run" düğmesine tıklayın.
- 10x Ön Tarama'yı çalıştırmak için "OK" düğmesine tıklayın. Taramayı uygun şekilde ayarlamak için istemleri takip edin. Taramayı başlatmak için "Finish" düğmesine tıklayın. Ana ekrana dönmek için "Main" sekmesine basın. "Offline" düğmesine tıklayın. Atanan Case ID ve Slide ID'yi bulun ve "Offline Scan" seçeneğine tıklayın. Sol üst köşedeki siyah kutuda bir oka tıklayarak "10x Prescan" seçeneğini belirleyin. Okları (< || Δ > yani "geri", "duraklat", "oynat", "ileri" düğmeleri) kullanarak taranmış görüntüler arasında ilerleyin.
- İlgi çekici bir görüntü bulduktan sonra, ekran üzerinde hedef bölgenin ortasına çift tıklayın ve "Snap" düğmesine basın. Bu işlem, görüntüyü daha sonra yakalanmak üzere hedefler. Tüm hedefler seçildikten sonra "Classify" düğmesine tıklayın. "10x Prescan" seçeneğini seçin. Görüntüleri sınıflandırmak için bir görüntüye sağ tıklayın. "Polytene" seçeneğini belirleyin.
- Duet yazılımında 40x Ön Tarama kurulumunu yapın. Ana menüye dönmek için "Main" düğmesine tıklayın. Tekrar "Online" seçeneğini seçin. Bir lam seçin. "BF" seçeneğini "FL" olarak değiştirin. Görev adını "Revisit-X40-RG" olarak değiştirin. Son ayarın hemen altındaki bölümü "Revisit-ALL" olarak değiştirin. "Set&Run" düğmesine tıklayın. "OK" düğmesine basın. Otomasyonu kurmak için istemleri tekrar takip edin. 10x ve 40x görüntülerini eşleştirmek için "Start matching views" düğmesine tıklayın. Taramayı başlatmak için "Finish" düğmesine tıklayın. İşlem tamamlandığında "Classify" düğmesine tıklayın ve görüntüleri inceleyin.
4. Temsili Sonuçlar
Şekil 1, yüksek basınçlı kromozom hazırlama şemasını grafiksel olarak betimlemektedir. Bu adım, bir Dremel aleti ve mekanik mengene kullanarak kromozomların ezilme ve düzleştirilme işleminin yanı sıra, faz-kontrast mikroskobu kullanılarak kromozomların görselleştirilmesini içerir. Şekil 2, otomatik bir lam boyama sistemi kullanılarak kromozom lam hazırlıkları üzerindeki hedef DNA'ya floresan işaretli bir probun hibridizasyonunu, FISH deneyinden sonra probların görselleştirilmesi ve haritalanması için otomatik bir tarama mikroskobunun kullanımını ve genomik iskelelerin kromozomlar üzerine yerleştirilip yönlendirilmesini göstermektedir.
An. gambiae dişilerinden yumurtalık hemşire hücresi politen kromozom preparatları, yüksek basınç tekniği kullanılarak hazırlanmıştır. Bu yöntem, kromozom yapısının çoğuna zarar vermez veya bunları değiştirmez (Şekil 3). Bükülmüş kromozomları düzleştirir ve böylece standart preparatlarda görülmeyen gizli ince bantları ortaya çıkarır (Şekil 4).
Bu protokolde kullanılan problar, An. gambiae PEST suşu DNA'sından oluşturulan bir ND-TAM BAC kütüphanesinden elde edilen genomik BAC DNA klonlarıdır. Bu kütüphane için genomik DNA, her iki cinsin yeni çıkmış birinci instar larvalarından ekstrakte edilmiştir. Şekil 5, An. gambiae politen kromozomlarına hibridize edilen BAC klonları kullanılarak yapılan FISH sonuçlarını göstermektedir. Bu işlem, Xmatrx otomatik lam boyama sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. An. gambiae için bir sitogenetik fotoharita kullanılarak10, iki BAC klonu olan 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) ve BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), sırasıyla 2R kolunun 16C ve 16D alt bölümlerinde yerelleştirilmiştir. Ancak, An. gambiae PEST suşu AgamP3 dizilimine14 karşı yapılan BLAST araması, 102B24 ve 142O19 ile homolog dizilerin sırasıyla 2R kolunun 16B ve 17A alt bölümlerinde olduğunu belirlemiştir (Tablo 1). Bu nedenle, genomik koordinatlar ile sitogenetik alt bölümler arasındaki uyumluluk artık haritalama verilerimize göre ayarlanabilir. An. gambiae M formu ve S formu genom dizilimlerine karşı yapılan BLAST araması, iki BAC klonunun farklı kontiglerde ancak her form içinde aynı iskelelerde (scaffolds) bulunduğunu ortaya koymuştur (Tablo 1). Tanımlanan kontigler artık belirli kromozomal konumlarla ilişkilendirilebilir. Ayrıca, tanımlanan iskeletler artık 16CD sitolojik alt bölümleri içinde uygun şekilde yönlendirilebilir. İlginç bir şekilde, iskelelerdeki 102B24 ve 142O19 dizileri arasındaki mesafeler sırasıyla PEST suşu, M-formu ve S-formu genom dizilimlerinde 1,892,981 bp, 1,658,391 bp ve 1,688,426 bp'dir. PEST suşu, M ve S formlarının bir hibriti olduğu için, bu fark muhtemelen PEST genomunun hatalı dizilmesinden kaynaklanmaktadır.
| BAC (erişim numarası) | PEST-suşu AgamP3 Koordinatlar | M-formu contigler Koordinatlar | M-formu scaffoldlar Koordinatlar | S-formu contigler Koordinatlar | S-formu scaffoldlar Koordinatlar |
| 102B24 (BH372694) | 2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43,681,342- 43,681,874 | ABKP020247 53.1 32,513- 33,045 | EQ090167.1 1,858,377- 1,858,909 | ABKQ010123 32.1 4,299- 4,832 | EQ099711.1 215,891- 216,424 |
| 102B24 (BH372701) | 2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43,788,213- 43,788,969 | ABKP020247 51.1 24,816- 25,575 | EQ090167.1, 1,772,683- 1,773,442 | ABKQ010123 35.1 27,782- 28,540 | EQ099711.1, 305,514- 306,272 |
| 142O19 (BH368698) | 2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45,428,580- 45,429,264 | ABKP020247 01.1 2,499- 3,185 | EQ090167.1 315,806- 316,492 | ABKQ010123 76.1 49,242- 49,942 | EQ099711.1 1,791,625- 1,792,325 |
| 142O19 (BH368703) | 2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45,560,099- 45,574,323 | ABKP020220 17.1 30,971- 32,469 | EQ090167.1 200,518- 202,016 | ABKQ010123 79.1 27,760- 28,508 | EQ099711.1 1,903,569- 1,904,317 |
Tablo 1. BAC-uç dizilerinin An. gambiae genom montajlarına karşı BLAST sonuçları.
Şekil 1. Yüksek basınçlı kromozom hazırlığının şematik gösterimi. Sivrisinek yumurtalıkları uygun gelişim evresinde gösterilmiştir.
Şekil 2. Otomatik FISH, lam tarama ve genomik iskelelerin kromozom haritalamasını temsil eden bir şema.
Şekil 3. Yüksek basınç tekniği kullanılarak elde edilen An. gambiae'ye ait politen 3. kromozom yayılımı. 3L ve 3R, telomerlerindeki sol ve sağ kolları işaret eder. PH ve IH sırasıyla perisentrik ve interkalar heterokromatini belirtmektedir.
Şekil 4. Geleneksel (üst) ve yüksek basınçlı (alt) teknikler kullanılarak hazırlanan An. gambiae politen kromozomlarının karşılaştırılması. Görüntüler, 3R kolunun 29A-30E (A) ve 3L kolunun 43D-46D (B) alt bölümlerini kapsamaktadır.
Şekil 5. An. gambiae politen kromozomlarında BAC klonlarının FISH analizi. A) 102B24'ün (kırmızı sinyal) 2R kolu ile hibridizasyonu. B) 2R kolunun gerilmiş 16C ve 16D alt bölümlerine sırasıyla 102B24 (kırmızı sinyal) ve 142O19'un (mavi sinyal) çift renkli FISH analizi. Oklar, Cy3 (kırmızı) ve Cy5 (mavi) ile işaretlenmiş BAC klonlarının hibridizasyon sinyallerini göstermektedir. C-sentromerik bölge. a/+ heterozigot 2La inversiyonunu göstermektedir. Kromozomlar YOYO-1 floroforu ile karşı boyanmıştır.
Tartışma
Yüksek basınç prosedürünün en kritik adımı, yumurtalık gelişiminin Christophers' III evresinde13 izole edilen yumurtalık besleyici hücrelerinin uygun şekilde ezilmesidir. Hatalı ezme işlemi, kromozomların yetersiz yayılmasına yol açabilir; bu durum, FISH sonrası prob konumlarını belirlemeye çalışırken sorunlara neden olabilir. Kromozomlar aşırı ezilirse, kırılabilirler veya bantlaşma modellerinin kaybolacağı noktaya kadar uzayabilirler. Birden fazla lam hazırlanması, Dremel aleti kullanılarak lamların ezilmesi işleminde bir tutarlılık sağlayacak ve bu da genel lam üretim verimliliğini artıracaktır. Yüksek basınç tekniği ilk olarak taze izole edilmiş D. melanogaster tükürük bezleri için geliştirilmiştir9. Ancak, sivrisinek yumurtalıkları, kromozomal preparatlar için kullanılmadan önce rutin olarak modifiye Carnoy fiksatif çözeltisinde (hacimce 3 metanol: 1 glacial asetik asit) saklanır. Bu nedenle, mevcut yüksek basınç protokolünü, sıtma sivrisineği An. gambiae'nin fikse edilmiş yumurtalık besleyici hücre politen kromozomlarına uygun hale getirmek için modifiye ettik. Yüksek basınç, tüm lam boyunca yüksek düzeyde paralel bir çalışma yüzeyine sahip hassas bir mengene kullanılarak uygulandığından, kromozom ezme preparatını hazırlamak, kurşun kalem silgisiyle yapılan geleneksel vurma tekniğine göre önemli ölçüde daha az zaman alır.
Diğer önemli adımlar arasında foliküllerin %50 propionik asitte yeterince bekletilmesi ve lamın ısıtılması yer alır. Her iki adım da kromozomların düzleşmesine yardımcı olmak için gereklidir. Bu adımlar ihmal edilirse, kromozomlarledehidrasyon sonrası parlak görünebilir ve bu durum, FISH'te sinyalle karıştırılabilecek aşırı miktarda arka plan oluşmasına yol açabilir. Yüksek basınçlı ezme tekniği, mitotik kromozom preparatları hazırlanırken aynı çözeltiler kullanıldığında da iyi sonuç verir. Ek yayma ve düzleştirme işlemi, kromozomların çekirdeklerinden daha iyi ayrılmasını sağlar. Eşit basınç uygulamak, ölçümlere ve boyama ile görünür hale gelen bantların potansiyel olarak daha iyi çözünürlüğüne izin verecek şekilde onları düzleştirecektir. Sivrisineklerden mitotik kromozomların izole edilmesine ilişkin ayrıntılar başka bir yerde verilmiştir15. Standart ezme preparatları, FISH 16 ve immün boyama17 dahil birçok amaç için yeterli olsa da, yüksek basınçlı yöntem sadece lamlar arasındaki potansiyel varyasyonu düşürmekle kalmaz, aynı zamanda genel kromozom kalitesini artırarak kromozom haritalama sırasında daha yüksek detay sağlar. Bu prosedür, lazer yakalama mikrodissection için politen kromozom membran lamlarının hazırlanmasında da kullanılabilir.
Yüksek basınç yönteminin kısıtlamaları arasında lam kırılması ve kromozomların aşırı gerilmesi yer alır. Mengene aracılığıyla lam üzerine çok fazla stres uygulanması nedeniyle lam kırılması olasılığı vardır, ancak makalede belirtilen basınçlar kullanılarak bu durum sınırlandırılabilir. Kromozomların aşırı gerilmesi konusunda ise, Dremel aleti lama uzun süre uygulanırsa, kromozomların çok fazla gerilme ve çözünürlük kaybına uğrama olasılığı vardır. Bu durum, aletin kısa bir süre uygulanması, mikroskop altında kontrol edilmesi ve kromozomlar yetersiz düzeyde yayılmışsa Dremel aletinin daha uzun süre uygulanmasıyla giderilebilir.
Geleneksel bir FISH protokolü, genellikle 5-20 dakika süren ve deneyin tamamı boyunca araştırmacının neredeyse tam dikkatini gerektiren bir dizi yıkama ve inkübasyon adımı içerir. Dahası, manuel olarak işlenebilen slayt sayısı genellikle belirli bir deneyde birkaç slayt ile sınırlıdır. Buna karşılık, otomatik bir slayt boyama sistemi tüm adımları (yıkama, inkübasyon, prob uygulaması, denatürasyon, hibridizasyon, lamel uygulaması ve çıkarılması dahil) otomatik olarak gerçekleştirir. Bu, bir FISH deneyinde araştırmacı için 6-8 çalışma saatine kadar zaman kazandırır. Ayrıca, otomatik bir FISH sistemi verimliliği önemli ölçüde artırabilir. Örneğin, Xmatrx sistemi, tek hazırlık slaytlarında 40'a kadar ve çift hazırlık slaytlarında 80'e kadar analizi eş zamanlı olarak işleme kapasitesine sahiptir. Bu sistemin kısıtlamaları arasında, büyük hacimli çözeltiler hazırlamayı gerektirdiği için az sayıdaki FISH deneyi için verimli olmaması yer alır. Ek olarak, sisteme programlanan FISH protokolü, yeni uygulamalar için modifikasyonlar ve ayarlamalar gerektirebilir.
Bir lam tarama sistemi, floresan mikroskobun otomatikleştirilmiş bir versiyonudur. Otomatik sahne hareketi ve basit bir mikroskop kontrol paneli, araştırmacının zamanını boşa çıkarır ve mikroskobun kullanımını son derece kolaylaştırır. Örneğin, ACCORD PLUS tarama sistemindeki yazılım, birden fazla floresan kanalının kolayca yakalanmasına ve görüntü ediniminin kolayca yönetilmesine olanak tanır. Bunun bir örneği, tek bir görüntü almak yerine z-stack yakalamanın dahil edilmesidir; yazılım, en az bir görüntünün odakta kaldığından emin olmak için yapılandırılabilir bir z-stack görüntü dizisi yakalar. Bu sistem daha çok çoklu görüntü edinimi (tek bir lam üzerindeki çok sayıda hücre) için tasarlanmış olsa da, lam üzerindeki kromozomları bulmayı, lamda manuel olarak gezinmeye göre çok daha kolay hale getirir.
Hem otomatik lam boyama sistemi hem de tarama sistemi, sitogenetik klinikleri tarafından insan hücrelerindeki kromozomal anomalilerin FISH tanıları için rutin olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, söz konusu otomatik sistemleri temel bir araştırma uygulaması için kullanan bir protokol geliştirdik. Otomatik yüksek kapasiteli fiziksel haritalama protokolü, ilgi duyulan herhangi bir tür için fiziksel kromozom haritalarının hızla geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Bu raporla beraber, fiziksel haritalama için politen kromozomlar kullanılmış olsa da, bu sistemlerle mitotik kromozomlar da kullanılabilir. Organizmaların çoğunluğu okunabilir politen kromozomlar geliştirmediği için, protokolün mitotik kromozomlara uyarlanması faydalı olacaktır. Bununla birlikte, mevcut olduklarında politen kromozomlar, fonksiyonel genom bölgelerinin kromozom yapısıyla olan karşılıklılığı hakkında en yüksek çözünürlükte faydalı bilgiler sağlayabilir. Politen kromozomların bant ve ara bant kalıpları gibi organizasyonel ilkeleri, yakın zamanda normal nonpoliten (interfaz) kromozomlarınkine benzetilmiştir18. Bu nedenle, yüksek basınçlı kromozom preparatları üzerinde gerçekleştirilen ayrıntılı fiziksel haritalama; DNA dizilerini bantlar, ara bantlar, puff'lar, sentromerler, telomerler ve heterokromatin gibi spesifik kromozomal yapılarla ilişkilendirme potansiyeline sahiptir; böylece kromozom tabanlı genom dizilimleri oluşturulabilmektedir.
Açıklamalar
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Igor V. Sharakhov'a verilen National Institutes of Health 1R21AI094289 numaralı hibe tarafından desteklenmiştir. Xmatrx Otomatik Lam Boyama Sistemi ve ACCORD PLUS Otomatik Tarama Sistemi; Virginia Tech, Fralin Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Entomoloji Bölümü ve Biyokimya Bölümü'nün Ekipman Güven Fonu (Equipment Trust Fund) programının yardımıyla satın alınmıştır.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 22x22 mm mikroskop lam örtü camları | Fisher | 12-544-10 | |
| 18x18 mm mikroskop lam örtü camları | Fisher | 12-553-402 | |
| Asetik asit | Fisher | A491-212 | |
| Metanol | Fisher | A412-4 | |
| Propiyonik asit | Sigma-Aldrich | 402907 | |
| Flex-Shaft aparatı ile birlikte Dremel 200 döner alet | Rastgele | 3" Çok amaçlı Mini Tezgah Taşlama Makinesi (hız sınırlayıcılı) | |
| Özel olarak tasarlanmış 200 μDremel aleti için plastik uçlar (boncuklu plastik kenarlar) | Pipetman | F171300 | Pipet uçlarının yağlı ucunu kesin ve ısıtın |
| Kalay kaplı hızlı mengene | Avenger Gold Toolmaker | MTC-200-1 | 0,00025 toleransla hassas taşlanmış gönye ve paralel blok |
| Tork anahtarı | Zanaatkar | 44593 | |
| ThermoBrite Lam Denatürasyon/Hibridizasyon Sistemi | Abbott Molecular | 30-144110 | |
| 25 mm bariyerli lamlar | Abbott Molecular | XT108-SL | |
| 25 mm lameller | Abbott Molecular | XT122-90X | |
| Xmatrx Otomatik Lam Boyama Sistemi | Abbott Molecular | 08L46-001 | |
| MZ6 Leica stereomikroskop | Leica | VA-OM-E194-354 | Farklı bir stereomikroskop kullanılabilir |
| Olympus CX41 Faz Kontrast Mikroskobu | Olympus | CX41RF-5 | Farklı bir faz kontrast mikroskobu kullanılabilir |
| ACCORD PLUS Otomatik Tarama Sistemi | BioView (ABD) | BV-5000-ACCP | |
| 10x PBS | Invitrogen | P5493 | |
| %10 NBF (nötral tamponlu formaldehit) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| %99 formamid | Fisher Scientific | BP227500 | |
| Dekstran sülfat sodyum tuzu | Sigma | D8906 | |
| 20x SSC tamponu | Invitrogen | AM9765 | |
| Sodyum fosfat | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| 50x Denhardt çözeltisi | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| Sodyum azid | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| DMSO içinde 1 mM YOYO-1 iyodür (491/509) çözeltisi | Invitrogen | Y3601 | |
| ProLong Gold solma önleyici reaktif | Invitrogen | P36930 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Fermentas | R0141, R0151, R0161, R0171 | |
| Cy3-dUTP, Cy5-dUTP | GE Healthcare | PA53022, PA55022 | |
| BSA | Sigma | A3294 | |
| DNA polimeraz I | Fermentas | EP0041 | |
| DNaz I | Fermentas | EN0521 |
Kaynaklar
- Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species. J. Hered. 100, 659-674 (2009).
- Robinson, G. E., et al. Creating a Buzz About Insect Genomes. Science. 331, 1386-1386 (2011).
- Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from: http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/ (2012).
- Besansky, N. Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites. White Paper. , 1-15 (2008).
- Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. Limitations of next-generation genome sequence assembly. Nature. 8, 61-65 (2011).
- Sharakhova, M. V., et al. Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly. Genome Biol. 8, R5(2007).
- Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. Every genome sequence needs a good map. Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).
- Bhutkar, A., et al. Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes. Genetics. 179, 1657-1680 (2008).
- Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nature. 4, 483-485 (2007).
- George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).
- FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from: http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html (2012).
- The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from: http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332 (2012).
- Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction. , Chapman & Hall. (1992).
- BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from: http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/ (2012).
- Sharakhova, M. V., et al. Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).
- Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis. J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).
- Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling. J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).
- Vatolina, T. Y., et al. Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 6, (2011).
Yeniden basım ve izinler
