Bu protokolü biz üretim, saflaştırma ve lentiviral vektörlerin titrasyonu açıklar. Biz primer kültürlerinde nöronlar ve astrositlerde lentiviral vektör aracılıklı gen aktarımının bir örnek oluşturmaktadır. Bizim yöntemleri diğer hücre türleri için de geçerli olabilir In vitro Ve In vivo.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi
Bu makalede
Özet
Özet
Merkezi sinir sistemi (MSS) etkili gen teslim nörolojik hastalıklar modelleme ve tedavi yaklaşımların geliştirilmesinde, gen fonksiyonları okuyor önemlidir. Lentiviral vektörler ikisi de bölünmesi ve non-bölünen hücreleri, transgenlerin destek sürekli ifade transdüksiyonu olarak MSS nöronlar ve diğer hücre tipleri iletiminde çekici araçlar ve nispeten büyük paketleme kapasitesi ve düşük toksisite 1-3 var. Lentiviral vektörler başarılı bir in vitro 4-6 birçok sinir hücre tipleri transdüklenmesinden ve 7-10 hayvanlarda kullanılmıştır.
Büyük çabalar geliştirilmiş biyogüvenlik ve gen teslimatı için verimlilik ile lentiviral vektörler geliştirmek için yapılmıştır. Mevcut üçüncü nesil çoğaltma-arızalı ve kendini inaktive (SIN) lentiviral vektörler Şekil 1'de gösterilmiştir. Vektör paketleme için gerekli elemanları dört plazmidler ayrılır. Lentiviral transplazmid fer, 5 ', uzun terminali tekrarlama (LTR) içinde U3 bölge başka bir virüs kuvvetli bir promotör ile değiştirilir. Bu normal olarak modifikasyonu HIV gen ifadesi 11 için gerekli olan HIV-1 Tat protein vektörü sekansının transkripsiyon bağımsız sağlar. Ambalaj sinyali (Ψ) encapsidation ve Rev-duyarlı elementi (HKD) için gerekli olan yüksek titresi vektörler üretimi için gereklidir. Merkez polypurine yolu (cPPT) vektörü DNA Nükleer alma, non-bölünen hücre 12 transdüklenmesinden için gerekli bir özellik için önemlidir. 3 'LTR olarak, cis-düzenleyici sekanslar tamamen U3 bölgesi kaldırılır. Bu silme işlemi iki LTR transkripsiyonel inaktivasyonu sonucunda, ters transkripsiyon sonra 5 'LTR kopyalanır. Plazmid pMDLg / pRRE yapısal proteinler ve ters transkriptaz temin HIV-1 GAG / pol genler, içerir. pRSV-Rev çekirdekten verimli RNA ihracat için HKD bağlar Rev kodlar. pCMV-G kodlarHIV-1 Env yerini veziküler stomatit virüsü glikoprotein (VSV-G). VSV-G vektörlerin tropizmi genişler ve ultra-santrifüj ile 13 konsantrasyonu sağlar. Vif, VPR, VPU ve Nef gibi aksesuar proteinleri şifreleyen genler Bütün, ambalaj sistemi içinde tutulur. Lentiviral vektörlerin üretim ve manipülasyon rekombinant DNA (ilgili araştırma için NIH kurallarına göre yapılmalıdır http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). Bireysel Kurumsal Biyolojik ve Kimyasal Güvenlik Komitesinden bir onay lentiviral vektörler kullanmadan önce gerekli olabilir. Lentiviral vektörleri genellikle lentiviral transferi plazmid vektörü ve ambalaj için gerekli olan proteinleri şifreleyen plazmitler ile birlikte yardımcı 293T hücrelerinin kotransfeksiyonu ile üretilmektedir. Birçok lentiviral transferi ve plazmid helper plazmidler Addgene, bir non elde edilebilirKar plazmid deposu ( http://www.addgene.org/~~V ). Bazı stabil ambalaj hücre hatları geliştirilen, ancak zamanla bu sistemler üzerinden 14 daha az esneklik ve paketleme verimliliği genellikle azalır, 15 sunmak olmuştur. Piyasada bulunan transfeksiyon kitleri transfeksiyon 16 yüksek verimlilik desteği olabilir, ancak büyük ölçekli vektör hazırlıkları için çok pahalı olabilir. Kalsiyum fosfat çöktürme yöntemleri 293T hücrelerinin yüksek verimli transfeksiyon sağlamak ve böylece lentiviral vektör üretimi için güvenilir ve maliyet etkin bir yaklaşım sağlamak.
Bu protokolde, bir% 20 sukroz yastık yoluyla saflaştırma ve ultra-santrifüj ile konsantrasyon izledi kalsiyum fosfat çöktürme prensibine dayanan dört plazmit ile 293T hücrelerinin kotransfeksiyonu ile lentiviral vektörler üretirler. Vektör titreleri floresans aktive hücre sıralama (FACS) anal tarafından belirleniranalizden veya gerçek zamanlı qPCR tarafından. Bu protokolde lentiviral vektörlerin üretimi ve titrasyon 9 gün ile bitmiş olabilir. Biz nöron ve astrositlerine içeren fare neokortikal kültürleri içine bu vektörlerin transducing bir örnek sağlar. Biz lentiviral vektörler iletimi ve MSS primer kültürlerinde hücrelerinde hücre tipine özgü gen ekspresyonu yüksek verimlilik desteği göstermektedir.
Protokol
1. Lentiviral Vektörler Ambalaj
Lentiviral vektörlerin, bir lentiviral transferi vektör ve kalsiyum fosfat transfeksiyonu yöntemi ile 293T hücrelere ambalaj için gerekli olan diğer plasmidlerin kotransfeksiyonu ile üretilmektedir. Bu protokol 10 100-mm doku kültürü tabaklar kullanın. Bu büyütülüyor ya da aşağı uygulamalara bağlı olabilir. 293T hücre hattı% 10 fetal bovin serumu (FBS), 100 ünite / mL penisilin, 37 ° C'de 100 ug / ml streptomisin ile desteklenmiş, yüksek glikoz (4500 mg / L) ile Dulbecco'nun değiştirilmiş kartal besiyeri (DMEM) korunur % 5 CO2 inkübatör.
- Kültür ortamında 10 100-mm doku kültürü ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolde, bu neokortikal kültürlerde bu vektörlerin lentiviral vektörler ve uygulamanın üretimi göstermiştir. Bu yöntem tarafından üretilen vektörleri ile verimli ve hücre tipinde belirli bir transdüksiyon-göstermiştir. Synapsin promotör kullanıldığında, GFP tanımı katı nöron özgüdür. GFAP organizatörü kullanıldığında, GFP astrositlerde münhasıran. Herhangi bir hücre tipinde belirli-ifadesi gerekli ise, her yerde bulunan bir promotör kullanılabilir. Biz sahipleri neokortikal kültürler 6 yüksek düzeyde ge.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma Washington Üniversitesi, Programı Projesi Hibe NS032636 (BJS) ile NIH Neuroscience Blueprint Çekirdek hibe (P30 NS057105, BJS) tarafından ve Sinir Hastalıkları Umut Merkezi tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Fetal sığır serumu | Hyclone | SV3001403 | |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM | |
| Tripsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| Sodyum butirat | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Hexadimethrine bromür (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 293T hücreleri | ATCC | CRL-11268 | |
| HT1080 hücreleri | ATCC | CCL-121 | |
| Falcon 100 x 20 mm doku kültüre çanak | BD Biosciences | 353003 | |
| X 3 ½ polyallomoer santrifüj tüpünde 1 | Beckman-Coulter | 326823 | |
| 0.2-mikron şırınga filtresi | Corning | 431219 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
Kaynaklar
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
