Protokolü, temiz ve kolay bir adacık veya hücreleri farelerin böbrek kapsülü altında sunmak için geliştirildi. Hücreler, böbrek kapsül altında hücrelerinin nakli için kullanılan son tüp pelet içine yoğunlaşmıştır. Bu tekniğin kolaylığı hücreleri ve fare stresi azaltır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Diyabetik Fare Böbrek Kapsül içine, Pankreas Islets Nakli
Bu makalede
Özet
Özet
Protokolü, temiz ve kolay bir şekilde diyabetik veya normal farelerin böbrek kapsülü altında adacıklar veya hücreleri sunmak için geliştirildi. Biz böbrek kapsülü altında hücre nakli için kullanılan son teslim boru (PE50) pelet içine adacıklar veya hücrelerin konsantre kolay olduğu bulundu. Bu teknik, hücrelere ya da fare herhangi bir aşırı stres azaltırken hem hız ve kolaylık sağlar.
Yükleme: oturanlar, el adacıklar veya tohum hücreleri dikkatle P200 pipetteman ve düz, ince duvar pipet kullanarak 1,5 mL mikrosantrifüj tüp alt aspire, aldı. PE50 boru uzunluğu, küçük bir silikon adaptörü tüp kullanarak pipet ucu takılır. Hücreler ucu, yerleşmeye ve sonra yavaş yavaş pipetteman arama PE50 boru aktarılır izin verilir. PE50 boru sonuna yakın hücrelerin sonra, bir bükülme yapılır ve silikon adaptör boru kink üzerine yerleştirilir. PE50 tüp 15 ml içeren konik bir kesim 5 ml pipetlemeyin aktarılır ve PE50 tüp santrifüj sırasında kıvrık önlemek için 5 ml pipetlemeyin yan üzerinde bantlanmış. Hücreler 1.000 rpm ulaşmak için izin ve durdu.
Nakli: Alıcı fareler anestezi, traş ve temizlenmelidir. Farenin sol kanadında küçük bir kesi yapılır ve böbrek maruz kalmaktadır. Böbrek, yağ ve doku normal tuzlu çubukla nemli tutulmalıdır. PE50 distal ucu silikon adaptörü boru kullanarak, pipet içeren, Hamilton vidalı tahrik şırınga eklenir. Küçük bir nick çok büyük ne de çok derin değil, böbrek sağ kanadında yan üzerinde yapılır. PE50 boru kesik uç, hücrelerin en yakın dikkatle kapsül altına yerleştirilir, tüp normal salin sürüntü sırasında yer açmak için hafifçe dolaştı; kuru bir kapsülü kolayca yırtılabilir. Kapsül altında küçük bir hava kabarcığı, yavaş yavaş şırınga vida sürücü arama tarafından teslim edilir. Adacıklar sonra yavaş yavaş hava kabarcığı arkasında teslim edilir. Adacıklar teslim edilmiştir böbrek homeostazı korunur ve ıvır düşük ısı ile koterize. Böbrek boşluğuna yerleştirilir ve periton ve cilt sütüre ve zımbalanmış. Fare hemen Flunixin ve Buprenorfin ² ile tedavi edilen ve bir ısıtma yastığı bir kafes yerleştirilir.
Protokol
Nakli için Islets hazırlanması (Tx)
- Inverted mikroskop altında, P200 Pipetman ve 100mm plaka kültür adacıkları düz pipetlemeyin ucu kullanarak el almak adacıklar.
- Kont, her mikrosantrifüj tüp (~ 500 adacık / tüp / fare) bir zaman ve transfer 100 adacık.
- Adacıklar mikrosantrifüj tüplerin altına yerleşmek için izin ver.
- Düz bir ince duvar pipetlemeyin ucunu kullanarak P200 Pipetman (130ul ayarlanır) içine bir adacık pelet çizin.
- Şırınga ucu üzerinde bir silikon tüp adaptörü yerleştirin. PE50 boru uzunluğu silikon adaptörü içine yerleştirin.
- Kaput duvara PE50 boru uç adacıklar daha yüksek bant kaput ve yan Pipetman asın. Bu adacıklar sadece pipet ucu yerleşmek için izin verecektir.
- Yavaş yavaş sonuna adacıklar sınırdışı Pipetman arama ve PE50 tüp içine adacıklar hareket dikkatli olmak adacıklar PE50 tüp içine aktarın.
- PE50 boru kesik sonunda bir kink olun. Kink korurken, Pipetman silikon adaptör boru bağlantısını kesin ve silikon adaptör ile kink güvenli.
- Konik bir kesim 5 ml pipetlemeyin ve bant santrifüj ise PE50 boru kıvrık önlemek için 5 ml pipetlemeyin yan üzerinde PE50 tüp içine 15 ml, PE50 tüp, bükülmüş silikon adaptör boru tarafı, adacıklar yerleştirin.
- 1000 rpm PE50/15mL conicals Santrifüj ve santrifüj kapatın. (Bir kerede 10'dan fazla adacık hazırlıkları hazırlamak asla).
- Buz tüpü yerleştirin.
Nakli için Mouse hazırlanması
- Isofluorane veya Ketamin / Xylexene (bkz. hazırlık protokolü) ile fareleri anestezisi.
- Anestezik etkileyebilir alındıktan sonra, farenin sol kanadını tıraş.
- Swab fare Povidon İyot çubukla cilt, merkez, ve sonra bir ETOH bez ile silin.
- (Dalak sadece sağ) sol böbrek bulun. Periton açığa, deride küçük bir kesi olun.
- Böbrek açığa periton küçük bir kesi olun. Kesi küçük tutulması böbrek kaldırdı ve pozlanmış tutmada yardımcı olacaktır.
- Kesi her iki taraf için hafif bir basınç uygulayın, artırma veya böbrek farenin dışarı pop.
- Bir pamuk ile normal salin uygulayarak böbrek nemli tutun çubukla uçlu.
- Bir şırınga 23 veya 25 iğne kullanarak, böbrek kapsülünde bir nick oluşturmak, böbrek sağ kanadında küçük bir çizik çok derin ya da çok büyük değil.
Islets Nakli
Not: fare Tx için hazırlanan edilirken, ikinci bir kişi Hamilton vida sürücü adacık nakli şırınga hazırlamalıdır.
- Hortumun kink tutarken silikon adaptör tüp PE50 tüp yavaşça çıkarın.
- Silikon adaptör tüp ve yer "vida-drive" cam Hamilton şırınga bağlı pipet ucuna silikon adaptör tüp içine PE50 hortumun diğer ucunu yerleştirin. Yavaş yavaş, adalarında sızıntı olmadığını emin olun, PE50 boru kink bırakın.
- "Vida" mekanizması kullanılarak PE50 hortumun ucu yavaş yavaş adacıklar Advance, ancak küçük bir hava kabarcığı PE50 tüp adacıklar önünde tutmak.
- Nick böbrek içine küçük bir cep dikkatlice, kapsül altında PE50 boru slayt. Kapsül ile böbrek veya delinmesiyle oymak için çok dikkatli olun.
- Normal tuzlu-Gentamisin ıslatılmış pamuklu uçlu alan ve kapsül nemli kalmasına yardımcı olur, kuru bir kapsülü kolayca gözyaşı olacak.
- Yavaşça geri kalanı için nakledilen adacıklar için bir "cep" oluşturarak, tüm yönlerde boru hareket ettirin. Bölgenin nemli tutmak için ek olarak normal serum fizyolojik yeniden unutmayın.
- Fare açtı ve kim, böbrek kapsülü altında fare ve Hamilton nakli şırınga hazırlanan ikinci kişi, PE50 tüp yerleştirilir kişinin yönetimi altında yavaş yavaş, "cep" içinde, kapsül altında adacıklar ilerleyecektir PE50 tüp tarafından verilen küçük bir hava kabarcığı arkasında, tüm adacıklar kadar nakledilmektedir.
- Yavaşça, PE50 tüp kaldırmak için, kuru bir bez ile bölgeyi kuru ve düşük ısıda dikkatlice nick dağlamak.
- Tüm kanama durdu emin olun ve kuru bir pamuk kullanarak çubukla uçlu. Kanama durduktan sonra, steril serum fizyolojik ile böbrek tekrar nemlendirin ve yavaşça dikiş ve cilt zımba ile fare kapanış önce periton içine böbrek yerine.
Kapanış / Mouse Revival
- Periton 5-0 ipekle w / C-6 19mm iğne kullanarak çalışan bir dikiş ile kapatın.
- Kullanarak forseps birlikte cilt insizyonu her iki tarafında çizin.
- 2 veya 3 zımba ile birlikte cilt Zımba.
- Herhangi bir kan fare Cildin temiz bir pamuk kullanarak sürüntü ve SALIN uçlue.
- Hemen fareyi Flunixin ve Buprenorfin bir cilt altı enjeksiyonu ile tedavi.
- Fare, fare tam aktif olana dek, bir ısıtma yastığı veya altında bir ısıtma lambası yerleştirilir bir kafes yerleştirin.
- 2 hafta içinde cilt zımba çıkarın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, temiz ve kolay bir şekilde diyabetik veya normal farelerin böbrek kapsülü altında adacıklar veya hücreleri sunmak için pratik ve etkili bir seçenek sunmaktadır. Hücrelere herhangi bir aşırı stres ya da fare azaltırken hücrelerin nakli, böbrek kapsül altında hücre nakli için kullanılan son teslim boru (PE50) adacıklar veya hücreleri zenginleştirme ve peletleme tekniği kolay ve etkili bir yöntem sunmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
UCSF Diyabet Merkezi. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LIFESCAN A.Ş. Johnson & Johnson Company.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cerrahi eldivenler | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Cerrahi scrub süngerleri | Moore Medical | 42940AK | |
| Pensler | Miltex Inc. | 6-114 ve 6-26 | 2 dişli, 2 düz |
| Diseksiyon makasları n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster tıraş makinesi (40 no'lu bıçak) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Steril gazlı bez pedler | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidon İyotlu pedler | Moore Medical | 08486AK | |
| Alkolle ıslatılmış pedler | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Isıtma pedi | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G veya 25G iğneler | 1" uzunluğunda | ||
| Cidex solüsyonu | Moore Medical | 07535AK | enstrüman temizleme/dezenfeksiyonu için |
| PE50 polietilen tüp | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm Dış Çap x 0.58mm İç Çap |
| Cidex + 28 günlük solüsyon | Moore Medical | 35625AK | |
| Silikon tüp | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32” Dış Çap x 1/32” İç Çap |
| Enstrüman sterilizasyon kabı | Moore Medical | 39074AK | |
| Düz pipet uçları | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | steril |
| Vidalı şırınga (cam) | Hamilton Co | 1001 | |
| Koterizasyon aleti | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| İğne tutucu | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 ipek | LOOK Surgical | 754B | sütür için (6-C) |
| Pamuk uçlu çubuk | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip zımbalayıcı | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm zımbalar | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm zımba sökücü | BD Biosciences | 7637 |
Kaynaklar
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
