Yöntem makalesi

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/4040

⸱

21 Mayıs 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Emory University, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Emory University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fare bağırsak dendritik hücrelerinin (DC'ler) ve makrofajların hızlı izolasyonu için bir metodolojiyi detaylandırıyoruz. Bağırsak DC'lerinin ve makrofajların fenotipik karakterizasyonu, çok renkli akış sitometrik analizi kullanılarak gerçekleştirilirken, fonksiyonel çalışmalar için oldukça saf popülasyonlar elde etmek için manyetik boncuk zenginleştirme ve ardından hücre sınıflandırması kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsakta, kommensal flora ve gıda antijenlerine karşı toleransı teşvik etmede rol oynayan ve aynı zamanda invaziv patojenlere karşı inflamatuar yanıtlar oluşturmaya hazır kalan doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin benzersiz popülasyonları bulunur1,2. Antijen sunan hücreler, özellikle DC'ler ve makrofajlar, mikrobiyotayı algılama ve uygun şekilde yanıt verme yetenekleri sayesinde bağırsak immün homeostazının korunmasında kritik rol oynar3-14. Bağırsak DC'lerinin ve makrofajların etkili bir şekilde izole edilmesi, bu hücrelerin fenotipini ve işlevini karakterize etmede kritik bir adımdır. DC'ler ve makrofajlar dahil olmak üzere bağırsak bağışıklık hücrelerini izole etmek için birçok etkili yöntem tanımlanmış olsa da6,10,15-24, birçoğu hücre yüzeyi antijen ekspresyonunu, hücre canlılığını ve/veya hücre verimini olumsuz yönde etkileyebilecek uzun sindirim sürelerine dayanır. Burada, çok sayıda canlı, bağırsak DC'sinin ve makrofajın hızlı izolasyonu için bir metodolojiyi detaylandırıyoruz. Bağırsak DC'lerinin ve makrofajların fenotipik karakterizasyonu, çok renkli akış sitometrik analizi için izole edilmiş bağırsak hücrelerinin spesifik floresan işaretli monoklonal antikorlarla doğrudan boyanmasıyla gerçekleştirilir. Ayrıca, yüksek saflıkta DC ve makrofaj popülasyonları, CD11c ve CD11b manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama boncukları ve ardından hücre sıralaması kullanılarak fonksiyonel çalışmalar için izole edilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bağırsak Epitel Hücrelerinin Diseksiyonu ve Dissosiyasyonu

Reaktiflerin ve ekipmanın hazırlanması:

  • Ca2 + / Mg2 + içermeyen PBS'YI (CMF PBS) oda sıcaklığına ısıtın.
  • %5 FBS (CMF HBSS/FBS) ve 2mM EDTA ile Ca2+/Mg2+ içermeyen HBSS'yi oda sıcaklığına ısıtın.
  • Orbital çalkalayıcıyı 37 °C'ye ısıtın.

Not: Hücre ölümünün derecesini en aza indirmek ve maksimum hücre verimi elde etmek için 1.1'den 1.7'ye kadar olan adımlar mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir.

  1. Fareleri bir CO2 odasında ötena....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Factors in cell yield optimization, diagram; tissue digestion, collagenase, integrity, size, mincing.
Şekil 3. Hücre veriminin ve yüzey antijen ekspresyonunun optimizasyonu için önemli faktörler. Hücre verimi ve yüzey antijen ekspresyonu, doku sindirimi süresinden, kollajenazın spesifik özelliklerinden, doku kıyma derecesinden ve doku bütünlüğünü ve hücreselliğini etkileyebilecek inflamasyonun .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aaron Rae'ye (Emory Üniversitesi Pediatri ve Atlanta Flow Core Çocuk Sağlığı Bölümü) hücre sıralaması için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibe AA01787001, Amerika Crohn ve Kolit Vakfı'ndan Kariyer Geliştirme Ödülü ve TLD'ye Emory-Egleston Çocuk Araştırma Merkezi tohum hibesi ile desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1X PBS, Fenol kırmızısı Fisher Scientific ile Ca < > 2 + < / sup>- ve Mg2 + < / sup> içermeyen
Hank'in fenol kırmızısıFisher ScientificSH3001603
Sodyum bikarbonatSigma-AldrichS6014
0.85 NaClLonza Inc.17-737E
Fetal sığır serumu (FBS)Atlanta BiologicalsS11150HIsıyla etkisiz hale getirilmiş
0.5M EDTA (pH 8.0)Cellgro46-034-CI
Kollajenaz tip VIII Sigma-AldrichC2139
DNase IRoche Grubu14785000Stok solüsyonu: 100mg/ml
CANLI/ÖLÜ 405 nm uyarma için Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke KitiInvitrogenL349571:1000
CD45-PerCP mAb'de (30F11)BD Biosciences5572351:100
CD103-PE mAb'de (M290)BD Biosciences5574951:100
fcγ'de kullanın; RIII/II mAb (2.4G2)BD Biosciences5531411:200'de kullanım
CD11c-APC mAb (N418)eBioscience17-0114-821:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb'de eBioscience56-5321-82:100'de kullanın
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70)eBioscience48-0112-82:200
F4/80-PE-CY7 mAb (BM8)eBioscience25-4801-82'de kullanın
CD11b mikro boncuklarMiltenyi Biotec130-049-601
CD11c mikro boncuklarMiltenyi Biotec130-052-001
50 mL konik tüplerBD Biosciences352098
Tek gözenekli tel süzgeçChefmate
Küçük kantarFisher Scientific08-732-116
100 μ m hücre süzgeciBD Biosciences352360
40 & mu; m hücreli süzgeçBD Biosciences352340
5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplerBD Biosciences3522351:100
MaxQ 4450 tezgah üstü orbital çalkalayıcıdaThermo Fisher Scientific, Inc.
LS MACS sütunuMiltenyi Biotec130-042-401
LSR IIBD Biosciences
FACSAria IIBD Biosciences
1M HEPES ile dengeli tuz çözeltisi (HBSS) % kullanın 1 1 kullanın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
  2. Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immu....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tissue DigestionFlow CytometryMagnetic Activated Cell SortingCD11cCD11bCell IsolationPhenotypic Characterization

İlgili makaleler