Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Özet

Burada, fare bağırsak dendritik hücrelerinin (DC'ler) ve makrofajların hızlı izolasyonu için bir metodolojiyi detaylandırıyoruz. Bağırsak DC'lerinin ve makrofajların fenotipik karakterizasyonu, çok renkli akış sitometrik analizi kullanılarak gerçekleştirilirken, fonksiyonel çalışmalar için oldukça saf popülasyonlar elde etmek için manyetik boncuk zenginleştirme ve ardından hücre sınıflandırması kullanılır.

Özet

Bağırsakta, kommensal flora ve gıda antijenlerine karşı toleransı teşvik etmede rol oynayan ve aynı zamanda invaziv patojenlere karşı inflamatuar yanıtlar oluşturmaya hazır kalan doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin benzersiz popülasyonları bulunur^1,2. Antijen sunan hücreler, özellikle DC'ler ve makrofajlar, mikrobiyotayı algılama ve uygun şekilde yanıt verme yetenekleri sayesinde bağırsak immün homeostazının korunmasında kritik rol oynar^3-14. Bağırsak DC'lerinin ve makrofajların etkili bir şekilde izole edilmesi, bu hücrelerin fenotipini ve işlevini karakterize etmede kritik bir adımdır. DC'ler ve makrofajlar dahil olmak üzere bağırsak bağışıklık hücrelerini izole etmek için birçok etkili yöntem tanımlanmış olsa da^6,10,15-24, birçoğu hücre yüzeyi antijen ekspresyonunu, hücre canlılığını ve/veya hücre verimini olumsuz yönde etkileyebilecek uzun sindirim sürelerine dayanır. Burada, çok sayıda canlı, bağırsak DC'sinin ve makrofajın hızlı izolasyonu için bir metodolojiyi detaylandırıyoruz. Bağırsak DC'lerinin ve makrofajların fenotipik karakterizasyonu, çok renkli akış sitometrik analizi için izole edilmiş bağırsak hücrelerinin spesifik floresan işaretli monoklonal antikorlarla doğrudan boyanmasıyla gerçekleştirilir. Ayrıca, yüksek saflıkta DC ve makrofaj popülasyonları, CD11c ve CD11b manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama boncukları ve ardından hücre sıralaması kullanılarak fonksiyonel çalışmalar için izole edilir.

Protokol

1. Bağırsak Epitel Hücrelerinin Diseksiyonu ve Dissosiyasyonu

Reaktiflerin ve ekipmanın hazırlanması:

• Ca^{2 +} / Mg^{2 +} içermeyen PBS'YI (CMF PBS) oda sıcaklığına ısıtın.
• %5 FBS (CMF HBSS/FBS) ve 2mM EDTA ile Ca²⁺/Mg²⁺ içermeyen HBSS'yi oda sıcaklığına ısıtın.
• Orbital çalkalayıcıyı 37 °C'ye ısıtın.

Not: Hücre ölümünün derecesini en aza indirmek ve maksimum hücre verimi elde etmek için 1.1'den 1.7'ye kadar olan adımlar mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir.

1. Fareleri bir CO₂ odasında ötenazi yapın ve karın ve göğüs kafesine% 70 etanol püskürtün.
2. Karnın ortasında bir makasla küçük bir yatay kesi yapın ve peritonu ortaya çıkarmak için cildi soyun.
3. Pilor sfinkterini keserek mideyi üst ince bağırsaktan ayırmaya devam edin. Mezenteri forseps ile uzaklaştırın ve tüm ince bağırsağı kalın bağırsaktan kurtarmak için ileoçekal valfte tekrar kesin. Anal kenarda bir kesik yapın ve kalın bağırsak serbest kalana kadar mezenteri tekrar ayırın.
4. Kolonu makas kullanarak uzunlamasına kesin ve oda sıcaklığında CMF PBS'deki bağırsak lümeninden dışkı içeriğini ve mukusu yıkayın.
5. İnce bağırsağın anti-mezenterik yüzeyi boyunca Peyer yamalarını makroskopik olarak incelemek için makas ve forseps kullanın ve ince bağırsağı uzunlamasına kesin.
6. Dışkı içeriğinin ve mukusun ince bağırsak lümenini CMF PBS'de oda sıcaklığında yıkayın.
7. İnce/kalın bağırsağı yaklaşık 1,5 cm'lik parçalar halinde ayrı ayrı kesin ve 30 ml önceden ısıtılmış CMF, HBSS/FBS ve 2mM EDTA içeren 50 ml'lik ayrı konik tüplere yerleştirin. 50 ml konik tüp başına 1'den fazla bağırsak eklemeyin.
8. Her 50 ml'lik konik tüpü yatay olarak bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve 37 ° C'de 20 dakika boyunca 250 rpm'de çalkalayın.
9. Bir atık kovasının üzerine tek gözenekli bir tel süzgeç yerleştirin ve 1,5 cm'lik bağırsak parçalarını geri kazanmak için her 50 ml'lik konik tüpün içeriğini dökün ve bunları 2 mM EDTA ile 30 ml önceden ısıtılmış CHBSS/FBS içeren ayrı 50 ml'lik konik tüplere yerleştirin.
10. 1.8'i tekrarlayın.

2. Doku Sindirimi ve Bağırsak Hücrelerinin İzolasyonu

Reaktiflerin ve ekipmanların hazırlanması:

• Kollajenaz çözeltisi: 40 μg/ml DNaz I ile önceden ısıtılmış CMF HBSS/FBS içinde çözülmüş 1.5 mg / ml Tip VIII Kollajenaz.
• Önceden ısıtılmış CMF HBSS/FBS ve 2mM EDTA.
• 37 °C'de önceden ısıtılmış orbital çalkalayıcı.
• Buz gibi CMF HBSS/FBS.

1. İkinci çalkalama turundan sonra, her 50 ml'lik konik tüpün içindekileri süzgeçten dökün ve 1,5 cm'lik bağırsak parçalarını, fazla ortamı bir kağıt havlu yardımıyla temizledikten sonra küçük bir plastik tartı teknesine aktarın.
2. 1,5 cm'lik bağırsak parçalarını doğrudan ağırlık teknesinde makas kullanarak hızlı bir şekilde kıyın ve 20 ml kollajenaz solüsyonuna kıyılmış bağırsak ekleyin. Her 50 ml'lik konik tüpü yatay olarak bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve 37 °C'de 10-20 dakika boyunca 200 rpm'de sindirin. Lütfen optimizasyonla ilgili aşağıdaki tartışmaya bakın.
3. Kalan bağırsak dokusunun tamamen ayrışmasını sağlamak için kısaca vorteksleyin ve 100 μm'lik bir hücre süzgecinden doğrudan 50 ml'lik konik bir tüpe süzün.
4. Her 50 ml'lik konik tüpü CMF HBSS/FBS ile doldurun ve 1500 rpm'de 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra kolon numuneleri için katı bir pelet gözlenmezse, numuneler 3,5 dakika boyunca tekrar santrifüjlenmelidir. Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
5. Süpernatanı dökün ve hücre peletini buz gibi CMF HBSS/FBS'de yeniden süspanse edin ve numuneleri buzun üzerine yerleştirin.
6. FACS alımı/analizi için Bölüm 3'e veya yüksek hızlı hücre sıralama için manyetik boncuk zenginleştirme için Bölüm 4'e geçin.

3. DC'lerin ve Makrofajların Çok Renkli Akış Sitometrik Analizi için Antikor Boyama

Reaktiflerin ve ekipmanların hazırlanması:

• Buz gibi CMF PBS.
• Buz gibi soğuk boyama tamponu (CMF PBS +% 5 FBS).
• Ölü hücre lekesini buz gibi CMF PBS'de 1:1000 seyreltmede CANLI/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Leke Kiti kullanarak hazırlayın.
• Buz gibi soğuk boyama tamponuna aşağıdaki floresan etiketli monoklonal antikorları (mAbs) ekleyerek antikor boyama kokteylini hazırlayın: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (I-A^b)-Alexa Fluor 700, CD11b-eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.

1. Hücreleri 5 ml'lik polistiren yuvarlak tabanlı (FACS) bir tüpe aktarın.
2. Hücreleri buz gibi CMF PBS'de iki kez yıkayın.
3. Ölü hücre lekesi olan örnekleri karanlıkta buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
4. Hücreleri buz gibi CMF PBS'de iki kez yıkayın.
5. Buz üzerinde 10 dakika boyunca buz gibi soğuk boyama tamponunda 2.4G2 anti-FcγRIII / II ile hücreleri bloke edin.
6. Hücreleri buz gibi soğuk boyama tamponunda yıkayın.
7. Örnekleri karanlıkta buz üzerinde 20 dakika boyunca antikor boyama kokteyli ile inkübe edin.
8. Hücreleri buz gibi soğuk boyama tamponu ile iki kez yıkayın ve numuneleri 400 μl buz gibi soğuk boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve FACS tüplerindeki 40 μm filtre kapağından geçirin.
9. Bölüm 5 ve Şekil 1'deki geçit stratejisi ile tanımlandığı gibi LSR II sitometre (BD) üzerinde örnekler alın.

4. Bağırsaktan DC'lerin ve Makrofajların Zenginleştirilmesi

Reaktiflerin ve ekipmanların hazırlanması:

• Buz gibi soğuk boyama tamponu (CMF PBS +% 5 FBS).

1. Adım 2.5'ten elde edilen tek hücreli süspansiyonu üreticinin talimatlarına göre CD11b ve CD11c MACS boncukları ile inkübe edin.
2. Hücreleri buz gibi soğuk boyama tamponu ile yıkayın ve ardından santrifüjleyin.
3. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL buz gibi soğuk boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve 100 μm'lik bir hücre süzgecinden ve ardından 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
4. MACS LS manyetik kolon kullanarak pozitif seçim ile manyetik boncuk bağlı hücreler için zenginleştirin.
5. Adım 4.2'yi tekrarlayın ve süpernatanı atın.
6. Hücreleri, adım 3.7'de açıklandığı gibi yüzey işaretleyici mAbs ile inkübe edin.
7. Manyetik boncukla zenginleştirilmiş hücreleri buz gibi soğuk boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Hücre peletlerini sodyum azid içermeyen 500 μL buz gibi soğuk boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve 40 μm hücre süzgecinden bir FACS tüpüne geçirin.
8. İlgilenilen bağırsak DC ve/veya makrofaj alt kümelerini sıralamak için BD ARIA II Hücre Sıralayıcısında FACS sıralamasına geçin.

5. LP APC'ler için Geçit Stratejisi

Not: Boyanmamış bağırsak hücrelerinin, pozitif ve negatif popülasyonları ayırmak için kapıların uygun şekilde yerleştirilmesine yardımcı olmak için negatif bir kontrol olarak kullanılabileceğini lütfen unutmayın.

1. Şekil 1'de gösterildiği gibi, bir nokta grafiği oluşturun ve ölü hücre lekesi için pozitif olan hücreleri hariç tutun (Şekil 1A) ve ardından ikili olayların hariç tutulmasını (Şekil 1B ve C) takip edin. Ardından, döküntüleri dışarıda bıraktığınızdan emin olarak öne ve yan saçılmaya göre ilgili hücreleri kapatın (Şekil 1D).
2. APC'leri fenotipik olarak karakterize eden CD45⁺ ve I-A^b+ hücreleri üzerinde başka bir nokta grafiği ve daha fazla kapı oluşturun (Şekil 1E).
3. Ayrı bir nokta grafiğinde, belirli DC ve makrofaj alt kümelerini (R1, R2 ve R3; Şekil 1F). R1 hücreleri CD11c⁺ CD11b^donuk/- hücrelerdir. Bölge, R2, bu hücrelerin CD11c için R1 hücrelerinde olduğu gibi benzer yüzey ekspresyonu seviyelerine sahip olacağı, ancak R2 hücrelerinin de CD11b'yi eksprese edeceği şekilde tanımlanmıştır. Daha sonra, R3 bölgesi, CD11b ⁺ ve CD11c^{donuk / -} olan hücreler için belirlenmiştir.
4. Makrofaj ve DC popülasyonlarını ayırt etmek için sırasıyla F4/80 ve CD103 ekspresyonu için R1, R2 ve R3 bölgelerini daha fazla analiz edin. R1'in CD11c⁺ CD11b^donuk/- hücreleri, αE integrin, CD103'ün yüksek seviyelerini ve düşük F4/80 seviyelerini eksprese eder (Şekil 1G). R2'nin CD11b⁺CD11c⁺ hücreleri, CD103 ve F4/80'in ikili ekspresyonlarına dayanarak hem DC'lerden hem de makrofajlardan oluşur (Şekil 1H). Son olarak, R3'ün CD11b⁺CD11c^donuk/- hücreleri, F4/80⁺ ve CD103^- fenotipik profiline dayalı makrofajları oluşturur (Şekil 1I)¹⁶.

6. Temsili Sonuçlar

Şekil 1. Bağırsak DC'leri ve makrofajlar için geçit stratejisi. Ölü hücreler (A) ve çiftler (B ve C) önce analiz dışı bırakıldı ve daha sonra ince bağırsak hücreleri ileri ve yan saçılmaya (D) uygun şekilde rezerve edildi ve APC'ler CD45⁺I-A^b+(E) olarak tanımlandı. Makrofajlar ve DC'ler CD11b ve CD11c (F) ekspresyonu ile tanımlandı. R1 (G), R2 (H) ve R3 (I) popülasyonlarında önceden kapılanmış hücreler için CD103 ve F4/80 ekspresyonu analiz edildi.

Şekil 2. Hücre verimi ve antikor boyama kalitesi sindirim süresine bağlıdır. CD11b ve CD11c boyama paterni ve yetersiz (A, D), optimal (B, E) veya aşırı sindirilmiş (C, F) bağırsak dokusunun toplam hücre verimi.

Bağırsak hücreleri bir C57BL/6 fare ince bağırsağından izole edildi ve DC'ler ve makrofajlar BD LSR II'de FACS ile analiz edildi. Voltaj ve kompanzasyon, boyanmamış ve tek florokrom lekeli splenositler kullanılarak ayarlandı. Ölü hücreler (Şekil 1A) ve çiftler (Şekil 1B ve C) ilk olarak analizden çıkarıldı. İlgilenilen hücreler daha sonra ileri ve yan saçılmaya göre analiz edildi (Şekil 1D), ardından CD45⁺ ve I-A^b+ hücreleri üzerinde geçit yapıldı (Şekil 1E). Daha sonra, CD11b ve CD11c ekspresyonu, üç bölgeyi (R1, R2 ve R3; Şekil 1F). Üç bölgedeki CD103 ve F4/80 ekspresyonu, sırasıyla DC'ler ve makrofajlar arasında ayrım yapmak için değerlendirildi. R1'in CD11c⁺ CD11b^donuk/- hücreleri, yüksek αE integrin, CD103 seviyelerini ve düşük F4/80 seviyelerini eksprese etti (Şekil 1G). R2'nin CD11b⁺CD11c⁺ hücreleri, CD103 ve F4/80'in ikili ekspresyonlarına dayanarak hem DC'lerden hem de makrofajlardan oluşurken (Şekil 1H), R3'ün CD11b⁺CD11c^donuk/- hücreleri, F4/80⁺ ve CD103^- fenotipik profiline dayalı makrofajları oluşturur (Şekil 1I)¹⁶. R2 kapısı içindeki makrofajlar ve R3 kapısı içindeki makrofajlar benzer ileri ve yan saçılma özelliklerine sahiptir ve CD11c ekspresyonu ile ayırt edilebilirler. Bu alt kümelerin işlevsel ikilemi tam olarak anlaşılamamıştır.

Doku sindirim süresinin toplam hücre verimi üzerindeki ilişkisi ile CD11b ve CD11c ekspresyonu arasındaki ilişki Şekil 2'de gösterilmiştir. 3 dakika boyunca sindirilen bağırsak dokusu (yetersiz sindirim) düşük toplam hücre sayısı (Şekil 2D) ve dolayısıyla karakterizasyon için az sayıda DC ve makrofaj mevcut (Şekil 2A) vermiştir. 11 dakika boyunca doku sindirimi, yüksek seviyelerde CD11b ve CD11c ifade eden ve fenotipik olarak farklı olan DC ve makrofaj popülasyonları ile sağlam bir canlı hücre verimi (Şekil 2E) üretti. Buna karşılık, 50 dakikalık sindirim (aşırı sindirim), optimize edilmiş sindirim ile karşılaştırıldığında benzer bir hücre verimi ile sonuçlanmıştır (Şekil 2E ve F), ancak, CD11b ve CD11c kullanılarak farklı hücre popülasyonlarının tanımlanması, CD11c'nin ekspresyonu azaldıkça (Şekil 2C) ve ölü hücrelerin sayısı arttıkça (veriler gösterilmemiştir) daha belirsiz hale gelmiştir.

Tartışma

Şekil 3. Hücre veriminin ve yüzey antijen ekspresyonunun optimizasyonu için önemli faktörler. Hücre verimi ve yüzey antijen ekspresyonu, doku sindirimi süresinden, kollajenazın spesifik özelliklerinden, doku kıyma derecesinden ve doku bütünlüğünü ve hücreselliğini etkileyebilecek inflamasyonun ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1X PBS, Fenol kırmızısı Fisher Scientific ile Ca < > 2 + < / sup>- ve Mg2 + < / sup> içermeyen
Hank'in fenol kırmızısı	Fisher Scientific	SH3001603
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S6014
0.85 NaCl	Lonza Inc.	17-737E
Fetal sığır serumu (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H	Isıyla etkisiz hale getirilmiş
0.5M EDTA (pH 8.0)	Cellgro	46-034-CI
Kollajenaz tip VIII	Sigma-Aldrich	C2139
DNase I	Roche Grubu	14785000	Stok solüsyonu: 100mg/ml
CANLI/ÖLÜ 405 nm uyarma için Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti	Invitrogen	L34957	1:1000
CD45-PerCP mAb'de (30F11)	BD Biosciences	557235	1:100
CD103-PE mAb'de (M290)	BD Biosciences	557495	1:100
fcγ'de kullanın; RIII/II mAb (2.4G2)	BD Biosciences	553141	1:200'de kullanım
CD11c-APC mAb (N418)	eBioscience	17-0114-82	1:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb'de	eBioscience	56-5321-82	:100'de kullanın
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70)	eBioscience	48-0112-82	:200
F4/80-PE-CY7 mAb (BM8)	eBioscience	25-4801-82'de kullanın
CD11b mikro boncuklar	Miltenyi Biotec	130-049-601
CD11c mikro boncuklar	Miltenyi Biotec	130-052-001
50 mL konik tüpler	BD Biosciences	352098
Tek gözenekli tel süzgeç	Chefmate
Küçük kantar	Fisher Scientific	08-732-116
100 μ m hücre süzgeci	BD Biosciences	352360
40 & mu; m hücreli süzgeç	BD Biosciences	352340
5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpler	BD Biosciences	352235	1:100
MaxQ 4450 tezgah üstü orbital çalkalayıcıda	Thermo Fisher Scientific, Inc.
LS MACS sütunu	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSR II	BD Biosciences
FACSAria II	BD Biosciences