Hücre Survival üzerinde Bakteriler ve Etki Dondurma-kurutma için formülasyonlar

Per Wessman; Sebastian Håkansson; Klaus Leifer; Stefano Rubino

doi:10.3791/4058

Yöntem makalesi

Hücre Survival üzerinde Bakteriler ve Etki Dondurma-kurutma için formülasyonlar

23.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4058

⸱

3 Ağustos 2013

Per Wessman¹ , Sebastian Håkansson¹ , Klaus Leifer² , Stefano Rubino²

¹Department of Microbiology, Uppsala Biocenter, Swedish University of Agricultural Sciences, ²Department of Engineering Sciences, Uppsala University

Bu makalede

Özet

Dondurma-kurutma genellikle canlı bakteri hücrelerinin kuru ürün elde etmek kolay ve kullanışlı bir yoludur. Sürecin bir sorun hücre hayatta kalabilmek. Burada ayrıntılı dondurarak kurutma esnasında hücre hayatta kullanılan formülasyonunun özelliklerini nasıl etkilediğini araştırmak için bir işlem.

Özet

Hücresel su geri dönüşümlü depolama kolaylaştırmak için mikroorganizmaların inaktive kaldırılabilir. Kaldırma Böyle bir yöntem, hafif bir dehidrasyon yöntemi olarak kabul edilir dondurarak kurutma vardır. Kurutma esnasında hücrenin hayatta kalması kolaylaştırmak için, hücreler, genellikle daha önce formüle edilmektedir. Formülasyon hücreleri katıştırır ve dondurma ve kurutma sırasında hücrelerin üzerine uygulanan çeşitli zararlı stresleri koruyan bir matris oluşturur. Burada ve dondurularak kurutulduktan sonra hücrelerin hayatta kalma oranını değerlendirmek için genel bir yöntem sunmak ve dört farklı formülasyonları ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması ile de gösterilmiştir: disakarid sukroz, polimer Ficoll PM400 elde sakaroz ve ilgili polisakkaritler, hidroksietil selüloz (HEC iki bakteri suşları, P.) ve hidroksipropil metil selüloz (HPMC), putida KT2440 ve A. chlorophenolicus A6. Bu çalışmada biz dondurarak kurutma için formülasyonları hazırlamak için nasıl ve mekanik araştırmak için nasıl göstermekdiferansiyel taramalı kalorimetre (DSC), yüzey gerilimi ölçümleri, X-ışını analizi ve elektron mikroskobu kullanarak ve sağkalım oranları için bu verileri ilgili formülasyonu karakterize tarafından rehidrasyon sonra hücre canlılığı izm. Polimerler, değişen derecelerde ilgili polisakarit benzeyen sukroz, monomer cinsi bir yapı elde etmek için seçilmiştir. Bu yöntemi kurulum kullanarak biz formülasyonun bazı fiziksel özellikleri ¹ kontrol eğer polimerler disakkaritler kadar etkili hücre sağkalım destekleyebilir gösterdi.

Protokol

1. P. yetiştirme ve hasat putida

P. bir koloni ile triptik soy broth 100 ml (TSB) aşılayarak Pseudomonas putida bir starter kültür hazırlayın putida hücreleri triptik soya suyu (TSA) ile desteklenmiş agar üzerinde kültürlenmiştir. 130 rpm ayarlanmış bir sallayarak gemide 30 ° C de kültür tutun.
7 saat taze TSB ortamı için marş kültür eşdeğer ana kültürün son hacminin 1/10 ile bir kısım aktardıktan sonra. 16 saat 130 rpm'de sallayarak gemide 30 ° C hücreleri tutun.
Büyüme 16 saat sonra hücreler, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1500 x g'de hücre kültürü iplik ile hasat edilir. Süpernatant süzün ve pellet besiyerine izotonik olan bir NaCl çözeltisi içinde olan hücre yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın. Bu durumda, 150 mM NaCI çözeltisi kullanıldı. , Hücreler daha sonra bir kez daha santrifüje tabi tutulur ve yüzer madde formülasyonu ortam içinde yeniden süspansiyona önce dekante ediliradım 3.2.

2. Diğer türlerin ekimi

Diğer bakteri türleri için protokol uyarlamak için yetiştirme ve hasat işlemleri bu türlerin ihtiyaçlarına göre değiştirilmelidir. Hasat ve yıkama adım (lar) ve hücreleri işlerken ozmotik şok önlemek için, çözümlerin ozmolalite hasatta büyüme ortamı uyumlu olması gerekmektedir.

3. Hücre Formülasyon

Ilgili matris bileşenleri tartılarak formülasyonu çözümleri hazırlayın ve onları suda çözülür. Izotonik koşulları elde etmek için, ya yardımcı maddenin miktarını ayarlamak veya istediğiniz ozmolalite ulaşmak için NaCl veya başka bir hücre uyumlu çözünen ekleyin. Gibi disakaridler gibi düşük molekül ağırlıklı maddeler için miktarlarda kolayca izotonik koşullarına ulaşmak için ayarlanabilir. Yüksek moleküler ağırlığa sahip olan polimer gibi maddeler için, tonisite çok uyumlu hücre ile ayarlanmalıdırLutes, örneğin NaCl veya disakkaritler. Bir maddenin bir yanı da dondurma-kurutma davranışları ve hücre canlılığı etkileyebilir, formülasyonun fiziksel özelliklerine, etkileyecektir unutmayın.
Yıkama solüsyonu (bu durumda, NaCl) boşaltacaktır ve ilgili formülasyon dahil edilmesi, hücrelerin yeniden askıya.
Hücrelerin homojen bir şekilde disperse edilir olduğundan emin olun. Daha yüksek viskoziteler formülasyonlar kullanılarak karıştırılmış ise düşük viskoziteli formülasyonlar, örn., Bir karıştırma çubuğu eklenmesi ve homojen karışım elde edilene kadar kabı çalkalayarak vortekslenmiş.
Dondurarak kurutma şişeleri içine formülasyonlar bölün. Şişeleri önce ve dondurma-kurutma sırasında çıkarılan su miktarını hesaplamak için dondurularak kurutulduktan sonra numune ile, boş bir seçim yapılması gerekmektedir.
Şişeleri dondurma-kurutma makinesi içinde imzalanacak istiyorsak şişeleri için lastik tapalar ekle, 4.3 adıma bakın.
Dondurarak kurutmadan önce, her bir oluşum içinde hücrelerin Numaralandırma, adım 6 bkz.

4. Dondurma-kurutma

Dondurarak kurutma koşulları, formülasyonun fiziksel özelliklerine göre ayarlanması gerekir. En önemli parametre, bu durumda, cam geçiş ısısı Tg, formülasyon, bu su hala mevcut olduğunu belirtmek için donma-konsantre numune için Tg 'anlamına gelir. Dondurarak konsantre formülasyonun Tg 'kolayca diferansiyel tarama kalorimetresi (DSC) ile ölçülür, adım 7 bkz.
Dondurarak kurutma işleminin parametrelerini ayarlama dolayısı ile de numunenin sıcaklığı, numunenin Tg altında ve bu her zaman olduğu oda basıncı, yani sekonder, formülasyon içinde bir buz hızlı süblimasyon, yani birincil kurutma ve artık su sağlar kurutulması. Numune sıcaklığı kurutma işlemi sırasında 'Tg üzerindeki ise önemli hücresel yaşam azaltabilir numunenin Parçalanmaya büyük bir risk vardır.
F sonra kuru ürünlerini korumak içinreeze kurutma örnek atmosfer kontrol edilmesi gerekir. Mümkünse vakum dondurarak kurutma döngüsünün sonunda serbest bırakılmadan önce, dondurularak-kurutma örnekleri mühür. Seçenek olarak ise, tercih edilen şişe, atmosfer ile doldurulabilir. Bu depolama atmosferdeki nem ve oksijen mevcut olduğu gibi ortam koşullarına örnekleri maruz kalmasını önlemek için önemli olan hücrelerin hayatta kalma etkileyecektir.
Şişeleri tartılır.

5. Rehidrasyon

Iyonu giderilmiş ve steril su ile örnekleri rehidrate. Ilave edilecek su miktarı, dondurarak kurutma sırasında çıkarılan ve boş bir flakon, dondurarak kurutma öncesi ve sonrası örnek ile aynı flakonun ağırlığı hesaplanır miktarı olarak aynı olmalıdır. Vortex örnekleri şimdi ve sonra tekrar çözümler homojen görünür kadar.

6. Sayım

Her bir örnekten 100 ul çizmek ve 10-kat seri dilüsyonları olun. Inte dilüsyonları itibarengeri kalan 100 ul TSA-plakalar üzerinde kaplıdır. Plakalar gerekli olan sıcaklık ve süre inkübe edilir.

7. Donma Davranış formülasyonu karakterizasyonu

Küçük bir miktar, Take 5 - 10 mg, örnek ve kapaklı bir DSC-alüminyum tava içine alın. Bir referans olarak boş bir tava hazırlayın.
DSC sıcaklık tarama programı ayarlayın. Soğutma programı dondurarak kurutma programına dondurma basamağı taklit etmek için ayarlanır. Soğutma kinetik sulu formülasyonların Tg 'etkileyebilir olarak bu yapılır. Isıtma tarama de normal olarak incelenmiştir formülasyonların beklenen Tg ', -100 ° C'nin altında bir sıcaklıkta, çökertmek başlamadan önce
40 ° C / dak kullanılır - uygun bir ısıtma hızında, 5 normal olarak bir ısıtma hızı seç. Kaydedilen ısı akışı sinyal watt olarak ifade edilir ve ısıtma hızı etkilenir. Daha yüksek ısıtma hızı Tg 'daha büyük bir sinyal verecektir.
Sıcaklık aralığı ayarlayın, böylece it Tg 've formülasyonun erime kapsar.

8. Sulu Formülasyonlarının Yüzey Gerilimi Ölçümleri

Bu deneyde kullanılan deney düzeneği yüzey ölçmek için du Nouy yöntemine göre.
Dikkatlice platin halkası ve ölçüm kabı temizleyin. Geminin, aseton ile durulanır tüy bırakmayan bir doku ile sildi ve daha sonra renksiz bir alev ile iç yakılır. Halka renksiz bir alev kırmızı renkte yanar.
Çözüm ile gemi doldurun ve yüzey ölçmeden önce yerleşmek izin. Denge durumu sadece uzun bir süre sonra ulaşıldığında çözümler için, örneğin polimerler, burada kullanılan basit kurulum nitel veriler sağlayacaktır.
Yüksek viskoziteli,% 2 arasında örneğin, çözeltiler (w / w) olan formülasyonlar için HEC veya HPMC, yüzey gerilimi daha düşük konsantrasyonlarda çözümlerine ölçülmelidir çıkılarak ve daha sonra. Bu gerçeği yararlanarak yapılabilir ki% 0.5 altındaki konsantrasyonlarda (a / a) de yüzey gerilimi seviyeleri kapalı düşüş.

9. Kuru formülasyonlar arasından X-ray Analizi

Matris / bakteri az miktarda alın ve bir numune tutucu üzerine yük.
X-ray difraktometresi içine numune tutucu monte edin.
Örnek herhangi bir kristal faz analiz etmek üzere Bruker ikinci EVA program paketi kullanılabilir.

10. Elektron Mikroskobu

Şişeleri matris / bakteri küçük bir miktar dışarı atın ve bir SEM saplama üzerine sabitleyin.
Sıçramasına-lak (Bu çalışmada kullanılan Thermo VGScientific Polaron SC7640) ve Au / Pd veya Pt birkaç nm ile kat örnek SEM tutucu yükleyin. Bu deneylerde püskürtme parametreler: Bir ~ 5 için 1.900 V, 20 mA ve 20 sn, - 10 nm Au / Pd kaplama. Kaplama görüntü alımı sırasında elektrik şarj azaltır. Şarj devam ve görüntü neden ise, ince bir kaplama ile başlamak önerilir veeşya, numune tekrar kaplanmalıdır.
SEM odasında SEM tutucu yükleyin. Uygun görüntüleme parametreleri seçin. Şekil 2 (FEI Strata DB235) kullanılan alet için biz 5 kV hızlandırma gerilimi, spotsize 3, 5 mm ve ikincil elektron dedektörü bir çalışma mesafesi kullanılır.
İsteğe bağlı olarak, daha fazla ayrıntıları ortaya çıkarmak için, polimer içinde gömülü bakteri çapraz kesitleri için odaklanmış iyon yaygı kullanmak mümkündür.