Yöntem makalesi

Vahşi Tırtıllar gelen Hemocytes ayıklamak için basit bir protokol

DOI:

10.3791/4173

⸱

15 Kasım 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The George Washington University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böcek hemocytes böcek tüm gelişim aşamalarında immün ve non-immün hem de pek çok önemli fonksiyonları, yürütmek. Hemocyte türleri ve işlev Bizim bugünkü bilgi böcek genetik modeller üzerinde çalışmalar geliyor. Burada, biz, ayıklanması ve niceleme yabani tırtıllar gelen hemocytes görselleştirmek için bir yöntem mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böcek hemocytes (memeli beyaz kan hücreleri eşdeğer) bir böceğin yaşam döngüsü 1 boyunca birçok fizyolojik olayda önemli bir rol oynamaktadır. Lepidoptera (güveler ve kelebekler) ve Diptera (gerçek sinekler) emrine ait böceklerin larva evrelerinde hemocytes lenf bezi (özel hematopoetik organı) veya embriyonik hücrelerden oluşur ve erişkin aşamasına kadar yapılabilir. Embriyonik hemocytes inflamasyon sırasında gelişen ve kemotaksis düzenlenmesi sırasında hücre göçü katılmaktadırlar. Onlar da hücre apoptozu katılabilir ve embriyogenesis 2 için gereklidir. Hemocytes, hücre yayılması, hücre agregasyonu, nodül oluşumu, fagositoz ve yabancı işgalciler 3 kapsülleme gibi çeşitli fonksiyonları içeren böcek doğal immün yanıtın hücresel kolu arabuluculuk. Bunlar pr gibi, aynı zamanda enfeksiyon sırasında belirli böcek humoral savunma düzenlemekten sorumludur, antimikrobiyal peptitler ve diğer efektör moleküller 4, 5 oduction. Hemocyte yapısının ve fonksiyonunun başlıca meyve sineği, Drosophila melanogaster 6, 7, sivrisinekler Aedes aegypti ve Anopheles gambiae 8, 9 ve tütün hornworm, Manduca Sexta 10, 11 de dahil olmak üzere, genetik ya da fizyolojik böcek modellerinde çalışıldığı edilmiştir. Ancak, çok az bilgi şu anda çeşitliliği, sınıflandırılması, morfolojisi ve özellikle non-model böcek türleri, yaban 12 toplanan olanlarda hemocytes işlevi hakkında var.

Burada yabani tırtıllar gelen hemocytes ayıklamak için basit ve etkili bir protokol açıklar. Biz sondan instar Lithacodes Fasciola (sarı-omuzlu slug güvesi) (Şekil 1) ve Euclea delphinii (dikenli meşe slug) tırtılların (Lepidoptera: Limacodidae) kullanın ve gösteriyor ki hemolimf, yeterli miktarda (böcek kan)izole edilmiş ve hemocyte sayıda bireysel larva sayılabilir. Bu yöntem, verimli bir şekilde bu tür hem de tarla hasat ilgili diğer lepidopteran tırtılların içinde hemocyte türleri çalışmak için kullanılabilir, ya da kolayca mikrobiyal veya parazit organizmalar ile enfeksiyonu takiben 13 hemocyte araştırmak üzere tasarlanmış imünolojik deneylerlerde ile kombine edilebilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Malzeme Hazırlanması

  1. Borosilikat cam kapiller tüplerin ve mikropipet çektirmenin kullanarak iğne (1-2 mikron ucu ve 3-4 mm konik) hazırlayın. Cihaz ayarları: rampa: 561; hızı: 20; ısı: 560; gecikmesi: 1; çekme: 100; basıncı: 500.
  2. Sığır fetüs serumu (FBS) ve% 10 ve Antikoagülan tamponu (% 20 98 mM NaOH, 186 mM NaCI, 1.7 mM EDTA, 41 mM sitrik asit, pH 4.5 ile desteklenmiş Grace Medium (GM),% ​​60: toplama çözeltisi hazırlayın ). Yukarıdaki çözelti, steril koşullar altında, taze hazırlanmış ve her zaman buz üzerinde tutulur.
  3. GM% 90 FBS% 10 oranında arttırılmıştır: inkübasyon tampon çözeltisi hazırlayın. Bu çözüm ayrıca taze hazırlanan ve her zaman buz üzerinde tutulur.
  4. En az 15 ul toplam x toplama ve inkübasyon çözüm hem böceklerin sayısı hazırlayın.

2. Koleksiyon Çözüm ile Tırtıllar Enjeksiyon

  1. Sondan ins uyuşturhemocyte ekstraksiyon öncesinde 20 dakika süreyle buz üzerinde ürpertici tarafından tar larva.
  2. 20 ml'lik bir cam şırıngaya (Şekil 2) bağlı olan bir boru sistemi içine temiz bir kılcal iğne (16-gauge) sivri ucu monte edin. Toplama çözeltisi ve laboratuar tezgahının üstüne açmak ve yavaş yavaş tampon ile doldurmak kılcal boru içeren bırakın. Kılcal genellikle tırtıl ve boyutuna bağlı olarak, toplama çözeltisi, yaklaşık 10-15 ul ile doldurulur (tırtıl tüm vücut kütlesinin 10 mg başına yaklaşık olarak 1 ul solüsyon = tüm vücut kütlesinin% 0.01). Diseksiyon mikroskobu yanına yerleştirilen bir kil topu iğne dinlendirin.
  3. Bir Petri kabındaki tırtıl yerleştirin. Böcek spiracles (Şekil 3) açık bir şekilde görünür hale gelir ki, yan üzerinde konumlandırılmalıdır.
  4. Diseksiyon mikroskop altında görüntülerken, forseps bir çift ile yerde tırtıl tutun ve spiracles biri için iğne yakın yerleştirdiğiniz yere içindemezhep kütikül genellikle yumuşaktır. Yavaşça böceğin vücudunda karşı kılcal iğne basın. Iğne manikür nüfuz sonra, tırtıl (Şekil 3) içine çözeltinin toplam hacmi enjekte. Bu tırtıl içine hava kabarcıkları enjekte önlemek için önemlidir. Tırtıl vücut enjeksiyonu takiben (örneğin,% 20 oranında hacim artışı) şişer ancak patlama veya sızmak gerekir.
  5. Yara (Şekil 3) dışarı sızmasını önlemek için tampon dorsal böcek konumlandırma, buz tırtıl dönün.
  6. Tekrar hemolimf ekstraksiyonu için kullanılan her tırtılın için 2,1-2,4 adımları. Bu aşamada, her haşarat devam etmeden önce, 30 dakika süreyle buz üzerinde soğuk izin verir.

3. Hemocytes çıkarımı

  1. Diseksiyon mikroskobu altında bir Petri kabındaki tırtıl yerleştirin.
  2. Steril bir scalpe kullanarak tırtıl posterior bölgede sığ bir (2-3 mm uzunluğunda) kesi olun l (Şekil 3). Hedefi dikkatle ponksiyon manikür ve bireysel böceklerden hemocytes içeren tampon / hemolimf karışımı toplamak; bağırsak ve diğer iç organları zarar vermemeye özen gösterin.
  3. 10 ul pipet ucu ile hemolimf karışımı (yaklaşık 10-20 ul) toplarken tekrar iç doku (Şekil 3) kesmemeye özen, esnek plastik forseps kullanarak hafifçe tırtıl sıkıştırın. Hemolimf tırtıl vücudundan sıkılmış damlacık toplanır. Tırtıl naaşı atın.
  4. Ayrı etiketli silikonlu 0,5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine her tırtılın hemolimf toplayın.
  5. Bireyin tırtılın toplanan her hemolimf örnek inkübasyon solüsyonu eşit hacmi (yaklaşık 10-20 ul) ekleyin. Her zaman buz üzerinde hemolimf örnekleri tutun.
  6. Tekrar deneyde kullanılan her tırtılın için 3,1-3,5 adımları.
Hemocytes le "> 4. Niceleme

  1. Hemolimf örnek karıştırın ve önceden sayma hemocytes hemen inkübasyon çözüm. Bu tedavi hemocytes uygun bir şekilde ayrılmasına izin verir ve topaklanma önler.
  2. Hemasitometre üzerine inkübasyon çözelti ile karıştırılır hemolimf örnek 10 ul aktarmak için temiz bir pipet ucu kullanın.
  3. Bir bileşik mikroskop kullanarak, saymak ve büyük kareler en az 15 (kare bir alanı 0,1 mm: 0.04 mm 2, derinlik) olarak hemocytes sayısını kaydetmek hemasitometre merkezi ızgara (Şekil 3). 15 kare olarak hemocytes sayısının toplam miktar elde etmek için bu değerler ekleyin.
  4. Iyice distile ve deiyonize su ile yıkama şişesi kullanılarak hemasitometre ve kapak slaytı durulayın ve her bir örnek arasındaki Kimwipes (Kimberly-Clark) ile kurulayın.
  5. Tekrar her hemolimf örnek için 4,1-4,4 adımları.
  6. Hemolimf volum ml başına hemocytes sayısı ortalaması hesaplamaHer tırtıl için e aşağıdaki gibi:

Hemasitometre ızgaranın her karenin toplamı: (0.04 mm 2 alan) × (0.1 mm derinlik) = 0.004 mm 3 × 15 kare = 0,06 mm 3 tüm 15 sayılır kareler = toplam hacmi.

(15 sayılan tüm kareler / toplam hacim sayılan 15 kare olarak hemocytes toplam sayısının toplamı) x 2 seyreltme faktörü = hemocytes / mm 3 sayısı x 1000 = hemocytes / hemolimf ml sayısı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol bireysel tırtılların böcek hemolimf 10-20 ul en az hacim toplanmasını sağlar. Bu yöntemi kullanarak toplanan Hemocytes hücre topaklanma, melanization kusurları, doku artıkları veya diğer kirletici ücretsizdir. Dolayısıyla hemocytes kolayca gözlenir ve mikroskop altında sayılır, ve birkaç böcek birkaç Hosur içinde gözlenen edilebilirler. Biz bizim örneklerinde hemocytes çoğunluğu plazmatositler 3 (hemocytes asimetrik yayılma) (Şekil 4) oluştuğunu gözlemledik. Şu anda,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tıbben önemli böcekler ve lepidopteran modeli böceklerden hemocytes ayıklamak için Yöntemler önce 9, 14 rapor edilmiştir. Hemocyte ekstraksiyon yöntemleri böcek türlerine göre uyarlanmış, böcek ve morfolojik özellikleri gelişim aşamasında. Örneğin, Manduca larva hemolimf izolasyonu kolayca karın 15 sonuna yakın kırpma kavisli boynuz ile gerçekleştirilebilir. Sümüklüböcek tırtıllar (Limacodidae) bu karın yapıdan yoksundur Çünkü, biz küçük ölçekli saha toplanan tırtılların gelen hemolimf çık...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TMS Bu çalışma sırasında Harlan Trust Bursu (GWU) tarafından desteklenmiştir. Alan koleksiyon için fon ve L. damızlık Fasciola ve E. delphinii JTL NSF hibe DEB 0642438 tarafından sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
Mikropipet çektirme Sutter Aletleri P-1000
Borosilikat cam tüpler Sutter Aletleri B100-50-10 OD: 1.0, ID: 0.50 mm
Grace'in Orta Sigma G8142
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH3007102 Inaktive Isı
Dumont # 5 Forseps Güzel bilimi araçları 11252-40
Neubauer hemasitometre Hausser Bilimsel 3200
Plastik tubing Tri-Tech TT-3-32OD OD: 3/32'', ID: 1/32 '
Cam tıbbi şırınga Fortuna Optima D-97877 50 ml hacim
Blunt sonunda iğne Küçük Parçalar KD-162PL-25 16 Gauge x 1 "uzunluk

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).
  2. Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542(2007).
  3. Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1(2008).
  4. Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373(2011).
  5. Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743(2011).
  6. Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651(2011).
  7. Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249(2011).
  8. Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218(2010).
  9. Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891(2006).
  10. Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181(2010).
  11. Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840(2009).
  12. Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417(2006).
  13. Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805(2004).
  14. Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63(2008).
  15. Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695(2010).
  16. Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hemosit EkstraksiyonuT rt l HemolenfiB cek Ba kl k Yan tHemositometre Say mT rt llar n AnestezillenmesiS nsizyon Tekni iTampon zelti EnjeksiyonuHemolenf ToplanmasYabani T rt l AnaliziH cresel Ba kl k Analizleri

İlgili makaleler