Yöntem makalesi

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

DOI:

10.3791/4208

⸱

1 Ekim 2012

 ,  ,  ,  , 
1Center for Inflammatory Bowel Diseases, Division of Digestive Diseases, David Geffen School of Medicine, The University of California Los Angeles, Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliği nakli Kemik iliği kaynaklı hücrelerin genotipi değiştirmek için bir yol sağlar. Ilgilenilen genin kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, kemik iliği transplantasyonu olmayan kemik iliği kaynaklı hücre genotip değiştirmeden, farklı bir genotip için kemik iliği kaynaklı hücre değiştirebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolit gelişimi arasında bir genin rolünü anlamak için, wild-tip farelerden ve kolit gen-faiz eksik nakavt fareler yanıtları karşılaştırıldı. Gen-of-ilgi kemik iliğinden elde edilen ve konak hücreleri olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, fakat kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliği içinde bir ilgi geninin rol ayırt etmek mümkündür kemik iliği nakli tekniği ile elde edilen kök hücrelerin. Farelerin kemik iliği kaynaklı hücre genotipi değiştirmek için, alıcı fareler orijinal kemik iliği radyasyon tarafından tahrip ve daha sonra farklı genotip yeni donör kemik iliği tarafından değiştirildi. Wild-tip farelerden donör kemik iliği knockout farelerde transplante edildiğinde, kemik iliğinden elde edilen hücreleri vahşi tip gen ekspresyonu ile nakavt fareler yaratacaktır. Alternatif olarak, ne zaman nakavt fareler donör kemik iliği gen-faiz ifade vermeden yabani tip alıcı fareler, yabani tip farelere nakledildiKemik iliği kaynaklı hücre üretilmiştir. Bununla birlikte, kemik iliği nakli,% 100 eksik olabilir. Bu nedenle, alıcı fareler ve kemik iliği nakli başarı donör kemik iliğinden elde hücrelerinin oranını izlemek için verici ve alıcı hücre belirteçleri olarak farklılaşma (CD) moleküllerinin kümelenme (CD45.1 ve CD45.2) kullanılmıştır. CD45.2 genotipi ile CD45.1 genotip ve nakavt fareler Wild-tip fareler kullanılmaktadır. Alıcı fareler ışınlanması sonra, farklı genotiplerin donör kemik iliği hücreleri alıcı fareler infüze edildi. Yeni kemik iliği onun dokunulmazlığını devralmaya rejenere zaman, farelerin kolit oluşturulan kimyasal ajan (dekstran sodyum sülfat, DSS% 5) tarafından itiraz edildi. İşte biz de farelerde kolit oluşturulan ve kemik iliğinden elde edilen hücrelerden eksprese ilgilenilen genin rolünü değerlendirmek için yöntem gösterdi. Kemik türetilmiş hücrelerden gen-of-ilgi hastalığının gelişmesinde önemli bir rol (örneğin coli gibi yürütülürsetis), kemik iliği nakli ile alıcı farelerin fenotipi önemli ölçüde değiştirilebilir. Kolit deneyler sonunda, kemik iliği kan ve kemik iliği hücreleri CD45.1 ve CD45.2 karşı antikorlar ile etiketlenmiş edildi ve varoluş nicel oranı flow sitometri ile kemik iliği nakli başarısını değerlendirmek için kullanılan olabilir türetilmiştir. Başarılı kemik iliği nakli alıcı farelerin kemik iliği ve kan hem de alıcı genotip üzerinde donör genotipi (CD molekülünün marker vadede) büyük bir çoğunluğu göstermelidir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Önce-sen-start Teknik Hususlar

  1. Ilgili CD molekülleri ile farelerin büyük fare satıcılardan satın alınabilir çünkü deney için C57/BL6 wild-tip farelerden ve nakavt fareler hem kullanmanızı öneririz.
  2. Bunu wild-tip farelerden ve kemik iliği transplantasyonu sonrası donör hücreleri türetilmiş nakavt fareler izlemek zor olduğundan, wild-tip farelerden temsil CD45.1 fareler kullanmak gereklidir. (CD45.1 C57/SJL WT farelerde Jackson Laboratuvarları stok # 002014).
  3. En çok fare koloniler CD45.2 vardır. Bizim knockout farelerde CD45.2 genotipi (: Jackson Laboratuvarları stok # 000664 alternatif bir CD45.2 WT farelerde kaynağı) aittir. CD45.1 veya CD45.2 genotip tayini bu protokolde 7. bölümünde belirtildiği gibi kemik iliği ve periferik kan akım sitometri kullanılarak yapılabilir.
  4. Işınlama sonrasında Fare bağışıklık tehlikeye. Patojen free özelliği fareler tutun.
  5. Işınlayıcı Operasyonu özel güvenlik clearanc gerektirire ve eğitim. Eğitim ve onay süreçlerinde zamandan tasarruf etmek için, bu ışınlayıcı çalisabilir kalifiye bir teknisyen ile bir laboratuar ile işbirliği için en iyisidir.
  6. Birçok kurum deneyimli teknisyenler ile akım sitometri laboratuvarları vardır. Akım sitometri işlemi ile ilgili sorunları en aza indirmek için, başlamadan önce deneyimli teknisyen ile akım sitometri deneme planı tartışmak daha iyidir.
  7. Fare bu şekilde (grup başına 10 fare) ayrıldılar:
Grup Alıcıya Kemik iliği donör Tedavi
A BM döviz CD45.1 WT CD45.2 KO DSS kolit
B Su normal kontrol
C BM döviz CD45.1 WT CD45.2 KO DSS kolit
D Su normal kontrol
E Sahte CD45.1 WT CD45.1 WT DSS kolit
F Su normal kontrol
G Sahte CD45.2 KO CD45.2 KO DSS kolit
H Su normal kontrol

Deneysel protokol * Bir kısa açıklama Şekil 1 'de gösterilmiştir.

2. Alıcı Fare Işınlama

  1. Fare yetiştirilen ve patojen-free özelliği tutulur. Filtre ile otoklavlanmış ışınlama pasta koyun fareler. Işınlama pasta her yuvaya bir fare yerleştirin. Işınlayıcı içine pasta yerleştirin ve pikap ve pasta dönüm emin olun.
  2. Hava pompasını açınhavalandırma için. Işınlayıcı kapağını kapatın ve kilitleyin.
  3. 10 dk (radyasyon kaynağı ve yarılanma ömrü bağlı olarak) yaklaşık 1,000 rad (10 Gy eşdeğer) sahip fareler ışın. Bu sefer noktadan itibaren, ışınlanmış farelerde immün yetmezlikli ve enfeksiyona karşı zayıf dokunulmazlığım var. Radyasyon sonrası, pasta almak ve hayvan tesis biyogüvenlik kabini ulaşım için steril bir kap içinde yerleştirin. Enfeksiyon riskini en aza indirmek için dış ortama farelerin maruz bırakmaktan kaçının.
  4. Biyogüvenlik kabini içinde, otoklava yatak (. - 100 ml su başına 3.12 ml kafes başına 4 fare sulfatrim süspansiyon ile yeni steril su ekleyin) ile otoklavlanmış fare kafesleri içine fare aktarın.
  5. Antibiyotikler ışığa duyarlı olarak alüminyum folyo ile su şişesi sarın. Kafesine yerleştirmeden önce iyice sulfatrim solüsyonu şişesi karıştırmak için sallayın.

3. Donör Kemik İliği Ekstraksiyon

  1. Karbon dioksit ya da isoflur ile fareler kurban edinmesafeler ve 1:200 Lysol çözeltisi daha sonra batırmayın. Deri ıslak ve açık kemikleri incelemek için% 70 etanol ile farelerin püskürtün.
  2. Sterilizasyon için% 70 etanol içinde diseksiyon aletleri bekletin.
  3. Bir biyogüvenlik kabine diseksiyon gerçekleştirin. Kaslar ve bağlar ekleme ücretsiz humerus, femur, tibia ve fibula kemikleri açığa çıkarmak için steril diseksiyon aletleri kullanın.
  4. Kırmızı kemik iliği göstermek için kemiklerin iki ucu açık kesin. Forseps ile kemikleri tutun. Bir Petri kabı 3 ml şırınga ve 25G iğne ile soğuk PBS ile kırmızı kemik iliği çalkalayın. Daha fazla kemik iliği hücreleri elde etmek için kemik her iki ucundan yıkayın.
  5. Tekrarlanan aspirasyon ve ejeksiyon tarafından kırmızı kemik iliği fişleri kırmak için 6 ml şırınga ve 18G1 / 2 iğne kullanın. 50 ml Falcon tüpleri ile kemik iliği aktarın.
  6. 5 dakika 4 ° C için 1,800 rpm kemik iliği aşağı Spin 5-10 sn vorteks süpernatant, tekrar süspansiyon pelet atın.
  7. Steril su ile 10X RBC lizis tamponu ile seyreltilir. Iland 1X RBC lizis tamponu (donör fare başına 5 mi), 5 saniye süreyle yeniden girdap ve oda sıcaklığında tam olarak 3 dakika tut.
  8. 3 dakika sonra, lizis ve karışım durdurmak için 20 ml soğuk PBS ile boru doldurun. Doğrudan yeni bir 50 ml Falcon tüp içine, 40 mikron hücre süzgecinden içerik dökün.
  9. 5 ml PBS ile durulayın ve orijinal tüpler gibi bir hücre süzgecinden transfer. PBS ve karışımı ile 50 ml kadar ekleyiniz.

4. Kemik İliği Donör Hücreleri Sayma

  1. Bir Eppendorf tüp ve bir Eppendorf tüp ve karıştırmak için kemik iliği süspansiyon 100 ul Tripan mavisi 100 ul ekleyin. Hemasitometre için lekeli hücre karışımı pipet.
  2. Hücrelerin miktarı Falcon tüpleri içinde toplam canlı kemik iliği hücre sayısı = boyanmamış hücre sayısı 16 kareler x 2 (Tripan mavi seyreltme bağlı olarak) x 10,000 x 50 ml hesaplanır
  3. 5 dakika 4 ° C için 2,000 rpm'de 50 ml Falcon tüpleri içinde kemik iliği hücreleri aşağı Spin
  4. Süpernatantı. Merkezlitoplam hücre sayıları, ml başına 1 x 10 8 hücre PBS ile pelet tekrar süspansiyon

5. Alıcı Fare için İnfüzyon

  1. Bir ısı pedi ve bir ısınma lamba altında alıcı fareler ısıtın. Süzgeç, alıcı fareler koyun. Intravenöz 100-200 ul fare başına 1 x 10 7 hücre enjekte edilir.
  2. Donör kemik iliği enjeksiyonu ışınlama sonrasında 4-24 saatleri arasında yapılmalıdır.
  3. Kafes başına 4 enjekte edilmiş farelere kadar tutun. Patojen ücretsiz hayvan tesisi ilk 4 hafta boyunca antibiyotik ile tedavi edilen su ile otoklava kafeslerde enjekte alıcı fareler Bakım ve farelerin bağışıklık kazanmak izin. Değişim kafesleri, antibiyotik ile tedavi edilen su ve gıda her 4 günde bir hijyen sağlamak için.

6. Kolit Kolit ve Değerlendirme İndüksiyon

  1. 4 hafta radyoterapi ve kemik iliği nakli sonrası, normal yeniden antibiyotik vermeden düzenli su geçiş ve 2 hafta daha farelerin korumakmikroflora gut.
  2. 6 hafta kemik iliği enjeksiyonu sonrası, başlangıç ​​vücut ağırlığı ölçmek. Bazı farelerde kolit indüklemek için su ad libitum içme içinde% 5 dekstran sülfat verilmiştir. Bazı fareler sadece normal kontrol grubu olarak normal içme suyu verilir.
  3. 5 gün sonra, periferik kan geri heparin kaplı borular (Vacutainer) aktarmak ve buz tutmak. 1 tüp 4 farelerden alınan kan Sandalye. Hücre boyama tampon = 600 ul 300 ul kan 300 ul birleştirin. 100 ul 5 Eppendorf tüpleri, her kan bölün.
  4. Karbon dioksit ya da izofluran ile fareler kurban edin. Makroskopik hasar skorları (ayrıntılar için 1 için başka JOVE video yayın bakınız) değerlendirin. Vücut ağırlığı değişimi ölçün. Dijital kumpas ile ölçün barsak uzunluğu ve kalınlığı. Dışkı dokusu (sert, yumuşak veya kanlı) gözlemleyin. Hemooccult ile dışkıda gizli kan belirleyin. Kolon dokularında inceleyin ve H & E boyama için formalin düzeltin.
  5. 1 femur bo teşrihne başı fare kemik iliği ayıklamak ve 25G iğne ve 1 ml şırınga ile soğuk PBS ile kemik iliği yıkayın. Havuz 4 kemik iliği 1 tüp takılır ve buz tutmak.
  6. Hiçbir kemik iliği fişi kalkıncaya kadar Petri, makaslama 18G iğne ve 5 ml şırınga ile birkaç kez kemik iliği fişine kemik iliği dökün.
  7. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1500 devir ile aşağı Spin Süpernatant ve 600 ul hücre boyama tamponu ile tekrar süspansiyon çıkarın. 100 ul 5 Eppendorf tüpleri, her yeniden süspanse kemik iliği bölün.

7. Akış sitometri yöntemi ile Kemik İliği Transplantasyonu Kalite Kontrol

  1. Kan veya kemik iliği # 1-5 her numune tüpleri Etiket:
  2. Karanlık olarak her bir ilgili tüp için antikor karışım hazırlayın.

# 1 Hayır antikoru
# 2 30 ul FITC izotip kontrol + 30 ul PE izotip kontrol + 15 ul CD16/32 engelleme
# 3 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 ul CD16/32 engelleme
# 4 30 ul PECD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 engelleme
# 5 30 ul FITC CD45.1 Ab + 30 ul PE CD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 engelleme

Kan veya kemik iliği örneği # 1 şey ekle
Her kan veya kemik iliği örneği # 2 antikor karışımı arasında 2. 5 ul ekleyin
Her kan veya kemik iliği örneği # 3 antikor karışımı 3. 3 ul ekleyin
Her kan veya kemik iliği örneği # 4 antikor karışımı 4. 3 ul ekleyin
Her kan veya kemik iliği örneği # 5 antikor karışımı # 5 5 ul ekleyin
  1. 30 dakika buz içinde karanlıkta saklayın.
  2. Her tüpe 2 ml 1X eritrosit lizis tamponu ekleyin. 15 dakika boyunca buz üzerinde karanlıkta saklayın.
  3. 5 dakika 4 ° C'de 1,500 rpm'de hücreleri aşağı Spin (GH 3.8 rotor 1.500 rpm = 350 xg) Süpernatantı. Koyu, daha sonra girdaplı kısa bir süre içinde 500 ul hücre boyama tamponu ile pelet yeniden süspanse edin.
  4. Flow sitometri ile immunohistokimyasal kan ve kemik iliği örneklerinde CD45.1 (WT temsilen) ve CD45.2 (KO temsilen) kontrol edin. KO CD45.2 temsil WT CD45.1 ve PE temsil FITC seçin.
  5. FlowJo yazılım tarafından flow sitometri sonuçları analiz edin. PE oranı veya PE: FITC oranını hesaplayın FITC oranı donör genotipi kan ve kemik iliğinde baskın genotip olup olmadığını belirlemek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen-faiz kolit gelişimi sırasında bağışıklık hücrelerinin önemli bir rol oynarsa, farelerin kemik iliği transplantasyonu (WT KO veya WT KO) aracılığıyla farklı genotip kemik iliği alma DSS kolit değiştirilmiş bir yanıtı olmalıdır. Kolit şiddetini belirleyen en önemli parametrelerden biri kolon dokularında H & E boyama olduğunu. Kolon doku yapısı değişiklikleri ve inflamasyon belirtileri kantitatif H & E histolojisi skorlama sistemi ile değerlendirilebilir. H & DSS kolit modeli için E histoloji puanlama ölçüt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu, kemik iliği transplantasyonu yaklaşım immünoloji kolit araştırma, enfeksiyon, kanser, aşırı şişmanlık ve diğer hastalıklar için de uygundur. Bu kemik iliği nakli deneyi gen-faiz hem de kemik iliğinden elde edilen ve non-kemik iliğinden elde edilen hücreleri ve gen-faiz ya nüfus hücreleri tarafından hastalık arabuluculuk şüphelenilen ifade edildiğinde gereklidir. Örneğin, antimikrobiyal peptit katelisidin akut kolit modüle etmek için gösterilir. Ancak epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri (örneğin makrofajlar gibi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma UCLA-CURE Merkezi, Crohn ve Amerika Kariyer Geliştirme Ödülü (# 2691) ve Sağlık NIDDK K01 Ulusal Enstitüsü (DK084256) Hon Wai Koon finansman Kolit Vakfı Pilot ve Fizibilite Çalışması hibe ile finanse edildi.

Kemik iliği ışınlama işlemi Bernard Levin ve AIDS Araştırma Fare / İnsan Chimera Çekirdek tesisi için UCLA Merkezi'nde Scott Mutfak tarafından yardım edildi. Flow sitometri çalışması UCLA Vektörel Çekirdek tesisi tarafından yardım edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası
Hücre boyama tamponu Biolegend # 420201
10X RBC lizis tamponu Biolegend # 420301
FITC fare izotip kontrol Biolegend # 400207
PE fare izotip kontrol Biolegend # 400211
PE anti-fare CD45.2 Biolegend # 109807
FITC anti-fare CD45.1 Biolegend # 110705
Anti-fare CD16/32 engelleme Biolegend # 101301
40 mikron hücre süzgecinden Fisherbrand # 22363547
PBS 1X MP Biomedicals # 1860454
Heparin Fisherbrand # BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (balıkçı)
Lysol IC Andwin Bilimsel NC9745686 (balıkçı)
Vaccutainer BD # 8000813
Fare süzgeç Braintree Bilimsel # TV-150
Işınlayıcının JL Çoban ve İştirakler Ben 68A işaretle
Akış sitometresi BD BD FACSCanto II
Akış sitometresi test tüpü Şahin # 352052
Dijital kumpas Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult BİT Beckman Coulter G0328QW

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
  3. Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
  4. Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
  5. Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11(2011).
  6. Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
  7. Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
  8. Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145(2010).
  9. Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. Gut. , (2012).
  10. Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
  11. Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
  12. Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
  13. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
  14. Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bone Marrow TransplantationFlow CytometryColitis InductionDextran SulfateCD45 1 CD45 2 MarkersWild Type MiceKnockout MiceBone Marrow IsolationHistology AnalysisCell Staining

İlgili makaleler