Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Fetal Fare Modelinde Biyoaktif Ajan intratrakeal Yönetimi İçin Yeni Bir Cerrahi Yaklaşım

16.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4219

⸱

31 Ekim 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Virology and Gene Therapy, KU Leuven, 2Department of Woman and Child, KU Leuven, 3Neurobiology and Gene Therapy, KU Leuven, 4Division of Nuclear Medicine, KU Leuven, 5Biomedical NMR Unit/ MoSAIC, KU Leuven

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Biz fare fetüs olarak biyoaktif ajanların intratrakeal yönetimi için yeni bir cerrahi yaklaşım geliştirdi. Teslimat güzergahı sık kullanılan intra-amniyotik enjeksiyon dışında fetal fare akciğerlere hedefleme daha verimlidir. Bu işlem, bir fare modeli tarif edilmemiştir tarihe sahiptir.

Özet

Hücrelerin, genlerin veya farmakolojik ajanların Prenatal pulmoner teslimat genetik ve kazanılmış hastalıklar çeşitli yeni tedavi stratejileri için temel sağlayabilir. Apart kısa vadeli gen ekspresyonu veya farmakolojik girişimlerle tedavi edici etkileri elde etmek için yeterlidir teslim gen, çeşitli kalıtsal olmayan perinatal durumlar, uzun vadeli ifade şartı ile doğuştan veya kalıtsal bozukluklar, bu gelecekteki potansiyel endikasyon olarak kabul edilmektedir yaklaşım tarzı. Kısa süreli terapi doğum öncesi uygulama için aday neonatal hastalıklar solunum distres sendromu, 1,2 ya da neonatal akciğer 3 hiperoksik yaralanmasına neden olan yüzey aktif protein B geçici neonatal eksikliği olabilir. Kalıcı tedavi düzeltme Aday hastalıkları Kistik Fibrozis (CF) 4, sürfaktan eksiklikleri 5 ve α1-antitripsin eksikliği 6 genetik varyantları vardır. <p class = "jove_content"> Genellikle, doğum öncesi gen tedavisinin önemli bir avantaj böylece bireysel onarılamaz hasar görmemesi hastada klinik öncesi ya da erken gelişimi terapötik müdahale başlatmak için yeteneğidir. Cenin içine daha verimli bir gen ya da kök hücre transferine izin verebilir yetişkin organlarının ile karşılaştırıldığında, ek olarak, fetal organlar artan bir hücre proliferasyon oranına sahiptir. Ayrıca, doğum halinde uterus gen bireyin bağışıklık sisteminin tamamen olgun olmadığında gerçekleşir. Bu nedenle, doğru bir sürümü ile fonksiyonel olmayan ya da eksik protein heterolog hücreleri veya takviyesi transplantasyonu son zamanlarda hücresel ve genetik hem de tedavilerin 7 ile durum kanıtlanmıştır hücre, vektör veya transgen ürün, bağışıklık hassasiyete neden olmamalıdır .

Bu çalışmada, biz doğrudan bir fare m fetal trakeaya hedef potansiyeli incelenmiştirodel. Bu yöntem, tavşan, koyun 8, ve hatta klinik ortamda 9'daki gibi daha büyük hayvan modellerinde kullanımda, ancak bir fare modelinde, daha önce yapılmamıştır tarihe sahiptir. CF gibi genetik hastalıklar için fetal gen tedavisinin potansiyel öğrenim görürken, fare modeli, çünkü farklı transgenik fare suşları, iyi belgelenmiş embriyogenez ve fetal gelişim, daha az sıkı geniş kullanılabilirliği proof-of-concept bir ilk olarak çok yararlıdır etik düzenlemeler, kısa gebelik ve büyük çöp boyutu.

Farklı erişim yolları intra-amniyotik enjeksiyon 10-12, yolk kesesi damarlarının 15,16 veya umbilikal ven 17 içine (ultrason kılavuzluğunda) intrapulmoner enjeksiyon 13,14 ve intravenöz dahil fetal kemirgen akciğer hedef tarif edilmiştir. Bizim yeni bir cerrahi prosedür doğrudan sağlayan fetal fare trakea içine seçim ajan enjekte araştırmacılar sağlarmevcut tekniklerin 18 göre solunum yollarında daha verimli bir şekilde teslim için.

Protokol

1. İstenilen Gebelik Sahne Edinme Mice Çiftleşme

Zaman arkadaşı hamile NMRI fareler yüzden ameliyat sırasında hamile 18 gün (E18) (toplam gebelik E19.5) olduğunu. Ameliyat öncesi ve sonrası normal oda sıcaklığında su ve chow ücretsiz erişim ile normal gündüz de filtre üst kafesleri yerleştirilmiştir.

2. Fetal intratrakeal (BT) Enjeksiyon (Şekil 1)

  1. İlk olarak 1.5 L / dak O 2 karışımı içinde% 1.5 ile izofluran anestezi için hamile NMRI fare sunmak. Izofluran düzeyi fare yaş ve zorlanma bağlıdır, ancak genel olarak izofluran anestezi devlet hayvanlar koyar bir düzeyde olması gerekmektedir. Ardından sırasında vücut ısısını korumak için (37 ° C) bir ısıtma yastığı hamile fare koymak cerrahi.
  2. Tüm cerrahi prosedür iki cerrah tarafından gerçekleştirilir. Bir cerrah hamile fare ve inci müteakip maruziyet diseksiyonu yapacakintratrakeal enjeksiyon için e fetus. İkinci cerrah fetal intratrakeal Enjeksiyonun kendisi yapacaktır. Cerrahi prosedür steril alet ve aseptik teknikler kullanılarak yapılır.
  3. Povidon iyodür ile karın Dezenfekte ve hamile uterus maruz medyan laparotomi uygulandı. Bir seferde bir uterin horn Exteriorize ve gebelik kesesi sayısını. Korna başına bir fetüs üzerinde işletilen ve sonraki adımlarda fetal başın eksteriorizasyon için en uygun pozisyon dayalı seçilir. En uygun fetusun rahim duvarından görselleştirme tarafından seçilir. Fetal başın burun (as sonraki adım 2.5 'de açıklandığı) fetal başın teşhir ve geriye doğru düzelttikten sonra trakea içine enjekte edecek cerrah doğru bakmalıdır.
  4. İlk yaklaşık 1 rahim duvarından cm çapındadır ve fetal membranların (amniyotik membranın 6-0 polipropilen (Prolen) purse dize sütür geçmekalana e ve paryetal yolk kesesi) burada daha sonra fetal baş yoluyla maruz kalacak. Bu dikiş omuz itibaren rahim içinde sabit fetus tutar. Sonra, keskin bir makas kullanarak yaklaşık 0,8 cm çantanızda dize içinde rahim bir kesi yapmak.
  5. Yavaşça histerotomi yoluyla fetusun baş ve boyun sıkın. Boynuna hafifçe sıkı çantanızda dize sütür çekin ve 2 Mikro-Sivrisinek forseps ile pozisyonda sabitleyin. Fetal baş üst çene çevresinde ağzına yerleştirilen iki forseps bir 5-0 polyglactin 910 (Vicryl) sütür ile hiperekstansiyon tutulur.
  6. Stereoskopik zoom mikroskop altında (x10 büyütme) fetal trakea keskin ve künt diseksiyon kullanarak dikey bir boynu insizyonu yaparak görüntülenmiştir. Boyun bölgesinde kesi yaklaşık 5 mm uzunluğundadır. Alttaki doku daha trakea ulaşmak için künt diseksiyon ile disseke edilir gibi, yüzeysel bir kesi olduğunu.
  7. direk görüş altında stereoskopik zoom mikroskop ile, bir 30 G keskin iğne ile 50 ul Hamilton Cam Şırınga kullanarak trakea içine madde (örneğin flüoresan boncuk veya viral vektör) 30 ul toplam hacim enjekte. Iğne çıkarılmasından sonra, enjekte edilen sıvının en az bir akış doğru enjeksiyon sağlanır. Insizyon enjeksiyondan sonra kapalı değil.
  8. Rahim kafasını değiştirmek için, burun üzerinde hafif basınç uygulayın. Boyun ilk rahim içine geri gider, başının izlediği. Burun son gider. Sonraki, çantanızda dize sıkarak histerotomi kapatın. Daha sonra oligohidroamnios önlemek için amniyotik boşluğuna fizyolojik çözelti yaklaşık olarak 0.5 ml toplam enjekte edilir. Bunu yapmak için, çanta dize içinde insizyon içine bir iğne takın. Daha sonra, serum fizyolojik enjekte edilir, bunun ardından, iğnenin dikiş kapatın. Bir son adım olarak, tamamen p kapatma ardından iğne, geri çekmekdize urse.
  9. Iki ayrı katmanlar halinde bir 5-0 Vicryl çalışan sütür ile anne karın duvarı (periton ve iç ve dış kas tabakası) ve cilt kapatın. Bundan sonra, post-operatif ağrı için% 0,2 xylocaine ile kesi sızmak. Post-operatif ağrı kesici - Bu buprenorfin (0.1 mg / kg SC veya IP 0.05) kullanılması tavsiye edilir. Profilaktik tokolitik ne antibiyotik Ne kullanılmaktadır. Fareler bir ısıtma yastığı tutulur (37 ° C), tam olarak iyileştikten kadar (yaklaşık 1 saat).

3. Fetal İntra-amniyotik (IA) Enjeksiyon

  1. 2.1 'e bakınız
  2. Povidon iyodür ile karın Dezenfekte ve hamile uterus maruz medyan laparotomi uygulandı. Bir seferde bir uterin horn Exteriorize ve gebelik kesesi sayısını.
  3. Bunu gerçekleştirmek için daha az zaman alır gibi IA enjeksiyon bütün fetüs üzerinde yapılabilir. Ayrıca, fetus pozisyonu hükümetlerinin faaliyetleri konusun değilcal İntratrakeal enjeksiyon ile karşılaştırılmıştır. Rahim duvarı yarı saydam olduğundan, bu tür kafa, bacak ve kuyruk ve plasental konum olarak fetal yapıların güzel görünür.
  4. Yukarıdaki ile aynı iğne ve şırınga kullanılarak (2.7), fetal ağız çevresinde madde 30 ul enjekte edilir. Bu da fetal baş ve ayakları arasında ya da alt bacaklarda ve kuyruk arasındaki en kolay yapılabilir. Enjeksiyon tek fetal yapı enjeksiyon sırasında ucu ile temas halinde olmasını sağlamak için iğne pozisyon dikkatli bir şekilde incelenmesi sonra gerçekleştirilir.
  5. Rahim karın yeniden konumlandırılır ve karın duvarı ve cilt gibi (2.9) Yukarıda açıklanan kapalı.

4. Injected Fetüsler Değerlendirilmesi ve Çapraz-teşvik

  1. Fetal müdahale (E19.5 az) sonra onaylanmış bir ötenazi yöntemi 36 saat kullanarak baraj öldür. Ek olmadan Servikal dislokasyonanestezi (pentobarbital, örneğin izofluran) içerir ötenazi diğer tüm formları her zaman istemeyeceğini fetuslarda, uyutmak hatta öldürecek gibi anestezi, en iyi yöntem olacaktır. Sezaryen ile çalışan-on fetus sunun. Çalışan fetuslarda konumlarını tarafından rahim içinde tanımlanır. Amniyon kesesi Bikornuat rahim yumurtalık ucundan başlayarak numaralandırılır.
  2. (1) bir kalp atışı, (2) pembe ten rengi (versus siyanotik) ve (3) spontan hareketlerin varlığı: Doğumdan sonra, aşağıdaki kriterler fetusların uygulanabilirliğini değerlendirmek için kullanılır. Bir günlük eski yavruların içeren bir bakıcı annenin çöp Bu kriterlere uygun sadece yavrular yerleştirin. Deneyim derken zayıf bir kalp atışı, siyanotik deri rengi ve / veya minimal spontan hareketleri ile yavrular genellikle üvey anne çöp veya maternal yamyamlık tarafından reddedilmesi nedeniyle hayatta olmayacağını biliyorum.
  3. Sevkiyat o sonraIT IA veya enjeksiyon (örneğin, kırmızı flöresanlı moleküller) üzerinden fa görünür boya, BT sonra akciğer içine doğrudan enjeksiyon ile de torasik ((enjekte edilen kırmızı fluospheres dan pembe renkli) bu boyanın mevcudiyeti ile bir uygun enjeksiyon sağlamak mümkündür enjeksiyon veya IA enjeksiyonundan sonra akciğerlere inhalasyon) veya karın boşluğunda (yutma) tarafından. Bu yeni doğmuş farelerin akciğer ve mide vivo değerlendirilmesi için izin yarı-saydam olması nedeniyle mümkündür.
  4. Subkutan kuyruk temelini üzerinde Çinli Mürekkepli doğru enjekte yavrular işaretleyin. Üvey anne döküntü 4.2 belirtilen şartları yerine tüm yavrular, yerleştirin.
  5. Maksimal kabul ile işletilen-on yavruların hayatta kalma sağlamak için, bakıcı annenin çöp içinde toplam (her ikisi de kendi başına 1 günlük yavrular, hem de çapraz beslenen köpekler) içinde en fazla 10 yavrular bırakın. Çalışan-on yavru yerleştirmeden önces üvey annenin çöp, onu dışkı ve idrar hem de olmayan herhangi bir tanıdık kokuları maskelemek için içeren, üvey anneden yatak malzemesi onları kapsar.
  6. Sessiz bir ortamda kafes yerleştirin ve en az 12 saat (gece) için çöp rahatsız etmeyin.
  7. Ertesi gün, üvey annenin yavrularının ve işletilen-on yavrular (Çince Mürekkep ve diğer yavrular daha küçük ortalama işaretlenmiş) arasındaki ayrım yapmadan, bütün yavrular sayarak teşvik hayatta kalma oranını dikkatlice değerlendirmelidir. Anne tarafından reddedilme önlemek ve hipotermi önlemek için bu yavruların manipülasyon zamanı en aza indirin. Genel olarak, eğer yavru (yenidoğan yavruların yarı saydam doğası nedeniyle görünür olan) midelerinde hiç süt yok, prognoz bu hayvanların daha hayatta kalmak için çok kötü.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Denemenin genel düzeni Figür tasvir edilmiştire 2.

İntratrakeal enjeksiyon için optimum hacim Belirlenmesi

BT enjeksiyonu için en uygun ses belirlemek için, biz ampirik 10 arasında değişen farklı hacimlerde, 20 ila 30 mikrolitre (n = 3/volume) seçti. Kolay tespiti için, 100 nm boyutlarında kırmızı floresan molekülü (fluospheres, Moleküler Probları, Leiden, Hollanda) enjekte seçti. E18 eski fetuslarda BT enjeksiyonu sonra, akciğerler ° C ve 6 mikron frozen yapıldı 4 gecede% 4 paraformaldehid sabit, 24 saat sonra hasat edildi. Çekirdek ve aktin filamentler Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium) ve Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, Merelbeke, Belçika) sırasıyla, oda sıcaklığında 20 dakika süreyle boyandı. Konfokal görüntüler Carl Zeiss LaserSharp2000.6 yazılımı ile BioRad Radiance 2100 Konfokal mikroskop kullanılarak yapılmıştır. Göreceli floresans (mavi floresan temsil fluospheres ve nükleer stainin kırmızı oranısırasıyla g) ImageJ online yazılım (Şekil 3) ile ölçüldü. Fetal cerrahi sırasında, bir geri akış enjekte sıvıların aşırı gösteren, sadece 30 ul enjeksiyonundan sonra tespit edilmesine karşın göreli floresans (varyans analizi ölçerek nicellefltirilen, 30 ul akciğer parankiminde floresan sinyal en yüksek miktar verdi , Student t-testi kullanılarak her bir çifti için karşılaştırmalar, * p <0.05, *** p <0.001).

Gastro-intestinal sistem, akciğer dokusu ve biyodağılımını içinde fluospheres kantitatif değerlendirilmesi

Sonra, IA enjeksiyon karşı BT sonrası fetal fare akciğer hedefleme verimliliğini karşılaştırmak istedik. Bunu yapmak için, fluospheres 30 ul E18 hamile NMRI fareler (n = 5 grup başına) BT veya IA enjeksiyonu ya sonra fetal fare akciğer teslim edildi. BT enjeksiyonu IA ile karşılaştırıldığında fetal akciğer fluospheres bir anlamlı teslimat sonuçlandı. Rota (1.43 ± 0.56 ve 0.05 ± 0.02 göreli floresans (sırasıyla Hoechst için fluospheres oranı, varyans analizi, Student t-testi, *** p <0.001) (Şekil 4 ac). Tedavi edilmeyen kontrol fetusların floresan normalleşmesi için kullanıldı arka sinyal. gastro-intestinal sistem BT ve IA enjekte hayvanlar (Şekil 4 d) hem de olumlu oldu. Hiç kırmızı floresans tedavi fetusun diğer dokularda veya negatif kontrol hayvanları (veriler gösterilmemiştir) gözlenmiştir.

Fetal akciğer rAAV2/6.2 aracılı gen teslimini izleyen intratrakeal ve intra-amniyotik enjeksiyon Karşılaştırılması

Floresan molekülü enjekte ederek hem dağıtım yöntemlerini karşılaştırarak sonra, biz IT ve IA enjeksiyon rAAV vektörler kullandıktan sonra viral transdüksiyon ve sonraki gen ekspresyonu etkinliğini değerlendirmek istedik. rAAV2/6.2 kodlama ateşböceği lusiferaz (Fluc) (3x10 10 GC / fetüs)tavuk-β-aktin (CBA) promotörün kontrolü altında E18 fetal NMRI fareler BT (n = 8) ya da IA ​​(n = 6) enjekte edildi. Sezaryen ve yavruların hayatta, teşvik non-invaziv biyolüminesans görüntüleme (BLI) tarafından takip ve yaş 1 hafta (Şekil 5) Fluc aktivitesi (foton / saniye, p / s) monitorize edildi sonra. BT grubu için toplam foton akısı IA grubu ve negatif kontrol göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (varyans analizi, Student t-testi kullanılarak her bir çifti için karşılaştırmalar, * p <0.05). IA grubu ortalama BLI sinyali, negatif kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha yüksek değildir.

Doğru ve yanlış fetal intratrakeal enjeksiyon arasındaki ayrım

Doğru ve bir incorrectI.T arasındaki ayrım. enjeksiyonu birkaç düzeyde değerlendirilebilir. Ameliyat sırasında noktada, fetal trakea içine enjeksiyon sırasında, hiçbir direniş fark edilecektir zaman needle trakea konumlandırılmış. Paratrakeal boşluk içinde enjekte Bununla birlikte, daha yüksek bir direnç fark edecektir. Cenin yarı-saydam olduğu İkincisi, sezeryan de, bu, bir akciğer ve görünür boya (örneğin Çin mürekkebi, flüoresan moleküller) daha sonra varlığını görmek mümkündür. Doğru bir enjeksiyon değerlendirmek için son bir seçenek optik görüntüleme ve daha spesifik biyolüminesans görüntüleme gereğidir. BLI muhabiri gen ateşböceği lusiferaz ve non-invaziv takip gen ekspresyonu için zarif bir sistemdir, ancak uzaysal çözünürlüğü ve anatomik bilgiler sınırlıdır. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) yüksek çözünürlük, ayrıntılı anatomik bilgi içeren tomografik görüntüler sağlar. Bu nedenle derin anatomik yapıları (iç organlar) bir görselleştirme ile yüzeye BLI sinyal birleştiren bir kaplama görüntüsü elde etmek için MRI ile BLI kombinasyonu araştırılmıştır. Amacımız yerel vivo bilgiler daha ayrıntılı elde etmek,Yanlış bir BT enjeksiyonu bir doğru ayırt edebilmek için gen ifadesinin sıkışmış.

Kombine BL-MR görüntüleri yaş bir hafta (Şekil 6) az rAAV2/6.2 CBA-Fluc ve CBA-LacZnls (3x10 10 her vektör, n = 10 için GC / fetüs) ile BT enjekte çeşitli hayvanlar üzerinde elde edildi. BL görüntüleme boyun ve göğüs bölgesinde kaynaklanan bir sinyal tespit edildi. BLI bulunan lusiferaz gen doğru bir enjeksiyon (Şekil 6) takiben pulmoner bölgede ifadesi, ama yanlış bir enjeksiyon (Şekil 6 b) sonra boyun ve karın bölgesinde. MRG Eş kaydı X-gal boyama ile histolojik analiz vivo co-kayıt doğruladı.

Intratrakeal ve intra-amniyotik enjeksiyon sonrası sağkalım

  1. Flüorosferleri
    E18 eski NMRI fetusların teslim sağkalım 30 ul 100 nm kırmızı flüoresan ile BT veya IA enjektet molekülleri her iki grupta da% 100 idi ve fetal cerrahi işlem (Tablo 1) sonra, hasat zamanında canlı enjekte fetusların sayısı olarak 24 saat tanımlandı.
  2. rAAV vektör
    Fetusların teslim sağkalım oranları sırasıyla% 85.3 ve% 86.3, (Tablo 1), sezaryen 36H sonrası fetal enjeksiyon zaman noktasında canlı fetusların sayısı olarak tanımlanır rAAV2/6.2, BT veya IA enjekte. Erken doğan sağkalım oranı% 53.3 (m) ve sırasıyla% 74.5 'i (IA), ve enjekte fetus ilk numara ile teşvik 1 gün sonra canlı yavruların sayısı korelasyonu ile elde edildi. Bu son sağkalım oranları elde etmek için, (1) bir inhalasyon yerine ketamin (75 mg / kg IP) ile medetomidin karışımı idare anestezi gibi izofluran (1 mg / kg IP) ile cerrahi perioperatif prosedür protokolü optimize , (2) ameliyat sırasında hipotermi önlemek için bir ısıtma pedi, (3),bir stereoskopik zoom mikroskop ve (4) operatörleri cerrahi prosedür ile daha deneyimli oluyor.

figure-protocol-1
Şekil 1. E18 fetal farelerde intratrakeal enjeksiyonu. Bu şekilde fetal BT enjeksiyonu için cerrahi işlemin ana adımları gösterilmiştir. Bir ilk adımda bir uterus boynuzu dışarıya alınır. Bir sonraki adımda, bir çanta dize sütür rahim duvarına geçirilir ve bölge üzerinde fetal membranların (amniyon zarı ve paryetal yolk kesesi) burada daha sonra fetal baş yoluyla maruz kalacak. Sonraki, fetusun baş ve boyun fetal başın çene arasındaki iki forseps bir 5-0 polyglactin 910 sütürle hiperekstansiyon tutulur ve bunun ardından, histerotomi yoluyla dışarıya edilmektedir. Stereoskopik zoom mikroskop altında (x10 büyütme) fetal trakeaya dikey boyun incis yaparak görüntülenmiştirkeskin ve künt diseksiyon kullanılarak iyon. Son bir adım olarak, maddenin 30 ul toplam hacmi stereoskopik zoom mikroskop ile direk görüş altında trakea içine enjekte edilir.

figure-protocol-2
Şekil 2. Deney genel bakış.

figure-protocol-3
Şekil 3,. İntratrakeal enjeksiyon için optimum hacim belirlenmesi. Bu enjeksiyon için optimum hacim belirlemek için, 10, kırmızı fluospheres 20 ya da 30 ul (n = 3/volume) 100 nm E18 eski fetüs uygulanmıştır ölçekli ve akciğer 24 saat hasat edilmiştir sonra. Çekirdekler ve aktin filamentleri sırasıyla Hoechst 33258 ve Alexa Fluor 488 phalloidin ile boyandı. Göreceli floresans (fluosph temsil mavi floresan kırmızı oranısırasıyla eres ve nükleer boyanma) ImageJ online yazılım kullanılarak ölçüldü. Ortalama ± SD, varyans analizi, Student t-testi kullanılarak her çifti için karşılaştırmalar, * p <0.05, *** p <0.001.

figure-protocol-4
Şekil 4. Gastro-intestinal sistem, akciğer dokusu ve biyodağılımını içinde fluospheres kantitatif değerlendirilmesi. Kırmızı fluospheres 30 ul (a) BT veya E18 hamile NMRI farelerde (b) IA Enjeksiyon hedefleme verimliliğini karşılaştırmak için sonra fetal fare akciğer teslim edildi fetal fare akciğer. Tedavi edilmeyen kontrol fetus floresan bir arka plan sinyali normalleştirilmesi için kullanılmıştır. Çekirdekler ve aktin filamentleri sırasıyla, Hoechst 33258 ve Alexa Fluor 488 phalloidin ile boyandı. (C) mavi flüoresan vermelerinden göreli floresans (kırmızı oranı fluosp temsilsırasıyla heres ve nükleer boyanma) ImageJ online yazılım kullanılarak ölçüldü. (d) gastro-intestinal sistem BT ve IA enjekte hayvanlar için olumlu oldu. Ortalama ± SD, varyans analizi, Student t-testi, *** p <0.001. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-protocol-5
Şekil 5,. Fetal akciğer rAAV2/6.2 aracılı gen teslimini izleyen intratrakeal ve intra-amniyotik enjeksiyon karşılaştırılması. Toplam foton akısı karşılık gelen miktar ile rAAV2/6.2 enjeksiyonu (3 × 10 10 GC / fetüs CBA-Fluc) sonra 1 hafta BLI sinyal . Tüm hayvanlar tarandı, komşu hayvanlara foton saçılma önlemek için, siyah bölümleri ile ayrılır. Yalancı ölçekli saniyede foton akısı gösteriyor, Steradyan (p / s / cm 2 / sr) başına santimetrekare başına. Ölçümler ilgi 4.3 cm 2 dikdörtgen bölgede elde edilmiştir. Ortalama ± SD, varyans analizi, Student t-testi kullanılarak her çifti için karşılaştırmalar, * p <0.05. Carlon ve ark., 2010 uyarlanmıştır Şekil. Macmillan Publishers Ltd izni ile yayımlanmaktadır: [Moleküler Terapi] (DOI: 10.1038/mt.2010.153), telif hakkı (2010). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-protocol-6
Şekil 6. Fetal akciğer rAAV2/6.2 aracılı gen teslimini izleyen bir doğru ve yanlış fetal intratrakeal enjeksiyon arasındaki ayrım. RAAV2/6.2 CBA-Fluc ve CBA-LacZnls (3x10 10 ile BT enjekte BL-MR görüntüleri çeşitli hayvanlar üzerinde elde edildi Kombine GC / Her vecto için fetusr) yaş bir hafta. BL görüntüleme boyun ve göğüs bölgesinde kaynaklanan bir sinyal tespit edildi. BLI bulunan lusiferaz gen doğru bir enjeksiyon (a) takiben pulmoner bölgede ifadesi, ama yanlış bir enjeksiyon (b) sonra boyun ve karın bölgesinde. MRG Eş kaydı Histolojik analiz vivo co-kayıt içinde doğruladı. Ölçek bar = 100 mikron. Carlon ve ark., 2010 uyarlanan sandın. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Enjeksiyon madde Enjeksiyon yöntemi Teslimat bir hayatta kalma B teşvik yaşama oranı Erken yenidoğan sağkalım c
fluospheres BT 100 (8/8) na na
IA 100 (5/5) na na
rAAV2/6.2 BT 85,3 (64/75) 62,5 53,3 (40/75)
IA 86,3 (44/51) 86,4 74,5 (38/51)

Tablo 1. FETAL intratrakeal VE intra-amniyotik enjeksiyon sonrası sağkalım. Fetal cerrahi sonrası ve sezaryen, teslimat, yani bir Survival, teşvik önce. Onlar pembe olsaydı b Pups sadece teşvik edildi, hareketli ve normal nefes. C erken neonatal sağkalım oranı ifade edilir enjekte yavruların ilk sayısının bir fonksiyonu olarak. Kısaltmalar: BT intratrakeal enjeksiyonu; IA İntra-amniyotik enjeksiyon; na geçerli değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kritik adımlar

  • Onlar yavru bol sayıda (ortalama DKBKS 14.4 ± 1.8, kendi veri) çünkü biz çalışmayı seçti fare zorlanma NMRI fareler, iyi müdahaleler tahammül ve iyi maternal özelliklere sahip.
  • Sadece travma olmaksızın neredeyse imkansızdır aksi konumlandırılması, fetal başın değil omuz maruz istediğiniz gibi rahim duvarı ve fetal membranlar yoluyla çantanızda dize yerleştirilmesi kritik bir adımdır.
  • Fetal başın optimal pozisyonu büyük kan damarlarının (şahdamarından) trakea ile paralel çalış...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

MC ve AVDP Flanders Bilim ve Teknoloji (IWT-Vlaanderen) aracılığıyla Yenilik Geliştirme Enstitüsü hibe tarafından desteklenen doktora öğrencisinin vardır. JT UZ Leuven bir part-time Klinik Araştırma Bursu (Koor) tutar. DV KU Leuven, DBOF/10/062 bir hibe ile desteklenen doktora üyesidir. MMdC Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) ve Erasmus Mundus bir hibe ile desteklenen doktora üyesidir. Araştırma Avrupa Komisyonu hibe DIMI (LSHB-CT-2005-512146) tarafından ve KU Leuven in vivo Moleküler Görüntüleme Araştırma grubu (İmir) In tarafından IWT-Vlaanderen tarafından finanse edildi. Biz rAAV vektör üretimi için plazmid AAV6.2 ambalaj onların tür hediye James M. Wilson tarafından kurulan UPenn Vektör Çekirdek kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
NMRI fareler Janvier, Le Genest St Isle, Fransa
İzofluran Isoba, Intervet / Schering-Plough Hayvan Sağlığı, Milton Keynes, UK
Prolen 6-0 Ethicon, Groot Bijgaarden, Belçika
Vicryl 5-0 Ethicon, Groot Bijgaarden, Belçika
50 ul Hamilton Cam Şırınga, Model 1710,5 TLLX SYR Hamilton, Reno, NV, ABD 5495-20
30G keskin iğne Hamilton, Reno, NV, ABD 7762-03
% 2 xylocaine AstraZeneca, Zoetermeer, Hollanda

Kaynaklar

  1. Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
  2. Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
  3. Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
  4. Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
  5. Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
  6. Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
  7. Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
  8. Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
  9. Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
  10. Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
  11. Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
  12. Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
  13. Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
  14. Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
  15. Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
  16. Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
  17. Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
  18. Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
  19. Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
  20. Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fetal Fare Trakesintratrakeal EnjeksiyonFetal Gen TedavisiCerrahi Prosed rHisterotomi Tekni iFloresan BoncuklarViral Vekt r letimiKonfokal G r nt lemeBiyol minesans G r nt lemeManyetik Rezonans G r nt leme
Bir Fetal Fare Modelinde Biyoaktif Ajan intratrakeal Yönetimi İçin Yeni Bir Cerrahi Yaklaşım
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.