Disseke gelen ekimi nöral eksplantlar Xenopus laevis Floresan füzyon proteinleri ifade embriyoların büyüme konisinin sitoskeletal dinamiklerinin görüntüleme için izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Akson rehberlik karmaşık bir süreç büyük ölçüde büyüyen akson ucundaki dinamik hareketli yapısı büyüme konisi tarafından tahrik edilir. Akson akıbet sırasında, büyüme konisi ileri büyüme konisinin itmek ve doğru kendi hedeflerini 1 bulmak için gitmek için kendi iskeleti modüle rehberlik ipucu çeşitli bilgi kaynaklarından entegre olmalıdır. Bu entegrasyon sitoskeletal düzeyinde oluşur nasıl hala ortaya çıkıyor, ve hücre iskelet protein ve büyüme konisi içinde efektör dinamiklerin incelenmesi bu mekanizmaların aydınlatılması izin verebilirsiniz. Xenopus laevis büyüme konileri vardır (çapı 10-30 mikron) yeterince büyük yüksek gerçekleştirmek için çözünürlüklü sitoskeletal dinamikleri canlı görüntüleme (örneğin 2-4) ve diğer omurgalılar ile karşılaştırıldığında bir laboratuar ortamında yalıtmak ve işlemek için kolaydır. Kurbağa büyüme konisinin Mikrofona gelişimsel nörobiyoloji çalışmaları ve önemli erken anlayışlar için bir klasik model sistemirotubule dinamikleri başlangıçta bu sistemi 5-7 kullanılarak bulunmuştur. Bu yöntem, 8, yumurta toplanır ve in vitro olarak fertilize, gen ekspresyonu işlemek için RNA kodlama floresan etiketlendi sitoskeletal füzyon proteinleri ya da başka oluşumlar ile enjekte edilir ve daha sonra nöral tüp aşama geliştirmek için izin verildi. Nöral tüpler disseksiyon ile izole edilir ve sonra kültive edilir, ve fazla uzama neurites üzerinde büyüme koni görüntülü. Bu yazıda, bu yöntem, sonradan yüksek çözünürlüklü görüntü analizi için kültür Xenopus laevis büyüme konileri için hangi hedefi gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Biz + TIP füzyon proteini EB1-GFP örnek sağlamakla birlikte, bu yöntem, büyüme koni içinde davranışları aydınlatmak için protein herhangi bir numaraya uygulanabilir.
Protokol
Not: Ayrıntılı bilgi ile mükemmel protokolleri odak daha spesifik adımları üzerine (örneğin 8-12) başka bir yerde yayınlanmış gibi biz sadece kısaca ilk iki bölümde adımları açıklar. Ayrıca, canlı hücre kültüründe Xenopus spinal nöronlar ile çalışmanın genel bir protokol daha önce ayrıntılı bir yöntem Madde 8 yayımlanmıştır. Buradan başarıyla gerçekleştirmek ve 3. adımda nöral tüp diseksiyonu ve kaplama protokolü gidermek için yeterli bilgi sağlarlar rağmen biz çok, bu video bir tamamlayıcısı olarak bu makaleyi incelemenizi öneririz.
Xenopus Yumurta 1. İn Vitro Fertilizasyon
- ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Eğer şartlar uygun olursa Xenopus laevis nöral eksplantlar laminin / poli-lisin substrat üzerindeki kaplama sonra 24 saat ile çok sağlam bir şekilde dışarı neurites gönderebilirsiniz. Tipik bir uzunluk 100 um ya da daha fazla olmasına rağmen, bu alt-tabaka ile, büyüme koni son derece öldürücüdür ve eksplant dışa doğru her yönde uzanan, 1 mm 'ye kadar akson uzunlukları elde edilebilir. Neurites dışarı büyümek yoksa, durum bu nedenleri sınırlı sayıda vardır. Bir olasılık nöral eksplantlar düzgün çanak bağlı d.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Yazarlar kurbağa tesisin kullanımı için eğitim ve Kirschner laboratuar Bob Freeman teşekkür ve destek için Van Vactor laboratuar üyeleri olacaktır. Biz Şekil 1'de görüntüler için ışık mikroskobu ile yardım için Harvard Tıp Okulu'nda Nikon Görüntüleme Merkezi ederim. Bu çalışma aşağıdaki tarafından finanse edildi: NRSA NIH dostluk ve LAL NIH K99 dostluk, Temel Bilim Ortaklığı finansman ( https://bsp.med.harvard.edu/ to AEF) ve NIH RO1 NS035909 DVV için
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog Numarası | |
| Koryonik gonadotropin | Argent Kimya Laboratuvarları | C-HCG-ON-10 | |
| Sistein | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kiti | Ambion | AM1340 | |
| Borosil İğneler 1,2 mm Kılcal (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma | F2637 | |
| Dumont # 5 Biologie Inox Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11252-20 | |
| Kollajenaz | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek yemekler | Mat Tek A.Ş. | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| NT3 | Sigma | N1905 | |
| BDNF | Sigma | B3795 |
Kaynaklar
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosc....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
