Disseke gelen ekimi nöral eksplantlar Xenopus laevis Floresan füzyon proteinleri ifade embriyoların büyüme konisinin sitoskeletal dinamiklerinin görüntüleme için izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Akson rehberlik karmaşık bir süreç büyük ölçüde büyüyen akson ucundaki dinamik hareketli yapısı büyüme konisi tarafından tahrik edilir. Akson akıbet sırasında, büyüme konisi ileri büyüme konisinin itmek ve doğru kendi hedeflerini 1 bulmak için gitmek için kendi iskeleti modüle rehberlik ipucu çeşitli bilgi kaynaklarından entegre olmalıdır. Bu entegrasyon sitoskeletal düzeyinde oluşur nasıl hala ortaya çıkıyor, ve hücre iskelet protein ve büyüme konisi içinde efektör dinamiklerin incelenmesi bu mekanizmaların aydınlatılması izin verebilirsiniz. Xenopus laevis büyüme konileri vardır (çapı 10-30 mikron) yeterince büyük yüksek gerçekleştirmek için çözünürlüklü sitoskeletal dinamikleri canlı görüntüleme (örneğin 2-4) ve diğer omurgalılar ile karşılaştırıldığında bir laboratuar ortamında yalıtmak ve işlemek için kolaydır. Kurbağa büyüme konisinin Mikrofona gelişimsel nörobiyoloji çalışmaları ve önemli erken anlayışlar için bir klasik model sistemirotubule dinamikleri başlangıçta bu sistemi 5-7 kullanılarak bulunmuştur. Bu yöntem, 8, yumurta toplanır ve in vitro olarak fertilize, gen ekspresyonu işlemek için RNA kodlama floresan etiketlendi sitoskeletal füzyon proteinleri ya da başka oluşumlar ile enjekte edilir ve daha sonra nöral tüp aşama geliştirmek için izin verildi. Nöral tüpler disseksiyon ile izole edilir ve sonra kültive edilir, ve fazla uzama neurites üzerinde büyüme koni görüntülü. Bu yazıda, bu yöntem, sonradan yüksek çözünürlüklü görüntü analizi için kültür Xenopus laevis büyüme konileri için hangi hedefi gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Biz + TIP füzyon proteini EB1-GFP örnek sağlamakla birlikte, bu yöntem, büyüme koni içinde davranışları aydınlatmak için protein herhangi bir numaraya uygulanabilir.
Protokol
Not: Ayrıntılı bilgi ile mükemmel protokolleri odak daha spesifik adımları üzerine (örneğin 8-12) başka bir yerde yayınlanmış gibi biz sadece kısaca ilk iki bölümde adımları açıklar. Ayrıca, canlı hücre kültüründe Xenopus spinal nöronlar ile çalışmanın genel bir protokol daha önce ayrıntılı bir yöntem Madde 8 yayımlanmıştır. Buradan başarıyla gerçekleştirmek ve 3. adımda nöral tüp diseksiyonu ve kaplama protokolü gidermek için yeterli bilgi sağlarlar rağmen biz çok, bu video bir tamamlayıcısı olarak bu makaleyi incelemenizi öneririz.
Xenopus Yumurta 1. İn Vitro Fertilizasyon
- Yumurta toplama öncesi koryonik gonadotropin (400 adet / kurbağa) 12-18 saat enjekte edildi dişi kurbağa yumurtaları alın. 1X Marc Modifiye Ringer solüsyonu (MMR) (0.1 M NaCl, 2.0 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 2.0 mM CaCl2 yumurtaları toplayın, 5.0 mM HEPES, pH 7.4 9).
- Daha önce 9 açıklandığı gibi, kıyılmış testisler ile in vitro yumurta gübreleyin.
- En az 20 dakika sonra, 3-5 dakika için 1X MMR içinde% 2 sisteyin (NaOH ile pH 7,8 'e getirildi) içinde kuluçkaya embriyolar embriyo tarafından jöle kat çıkarın. 3: 0,1 X MMR (88 mM NaCI, 1 mM KCI, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 2.5 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, pH 7.8) ya da 0,1 X MBS (Modifiye Barth salin, 1X tarifi) ile yıkayın İstenirse, oda sıcaklığında -5 kez, tutmak ve embriyolar enjeksiyon kadar, ya da, 14-18 yer embriyo gelişimini yavaşlatmak ° C ile.
2. RNA Mikroenjeksiyon
Not: burada RNA enjeksiyon faydalanırken, bu teknikler, RNA ile sınırlı değildir, ve DNA, protein ya da gen manipülasyonu için modifiye nükleik asitler de kullanılabilir ve önceden 12 tarif edilmiştir.
- Sitoskeletal veya diğer yapılar ar etiketlenmesi için deney, RNA'lar önceE mMessage mMachine kiti (Ambion) kullanarak doğrusallaştırılmış DNA şablonları transkripsiyonu. mRNA çeviri teşvik ve embriyolarda bozulmasını önlemek için 5 'kap ve bir 3' poliadenilasyon kuyruk gerektirir. pCS2 + Bu amaç için yaygın şekilde kullanılan bir vektör olup, transkripsiyon kiti sentez reaksiyon sırasında bir kapak analog içerir. Biz nükleaz içermeyen GKD 2 0 transkripsiyonu mRNA yeniden askıya, 500 ve 2.000 arasında bir stok konsantrasyonu az ul / ng, -80 ° C'de hızlı depolama izledi Enjeksiyondan önce, enjeksiyon için uygun bir konsantrasyon ile GKD 2 0 içinde RNA seyreltin. Sadece küçük bir hacme embriyoların içine enjekte edileceği gibi, tampon içinde resuspending gerekli değildir. Bizim nihai enjeksiyon konsantrasyonu yapı bağlı olarak, genellikle 50-200 pg / nl, ve birçok laboratuvar geleneksel toplam hacminin yaklaşık% 1'dir 10 nl, kadar enjekte rağmen biz genellikle, embriyo başına 4 nl kadar enjekte edecek bir embriyo. RNA yüksek dozlarda toksik olabilir ve embriyo cins başına doz olabilirEn fazla 5 ng ila belirli bir gen ve saflığına bağlı olarak tolere edilebilir rağmen lly, 10 pg den 1 ng arasında değişmektedir. Bununla birlikte, görüntüleme protein lokalizasyonu için, mümkün olan en düşük seviyede aşırı ekspresyonu eserler önlemek için enjekte edilmelidir. Bu protokolde EB1-GFP için RNA embriyo başına 250 pg nihai miktarda kullanılmaktadır.
- ~ 0.2 um arasında bir uç çapı için, çekici bir iğne 9 ile kılcal çekme yoluyla enjeksiyon iğneleri hazırlayın. Isı 644, çekme 125, hız 70, süresi 250, ancak bu parametreler makineye bağlı olarak değişir ve filament (şu anda 2,5 mm kullanabilirsiniz değiştirdikten sonra yeniden ayarlanması gerekir: bir Sutter P-87 çektirme ile, aşağıdaki ayarları kullanın Geniş 2,5 mm) kare kutu filament. Mikroskop altında, bir tüy gibi şekil oluşturmak için bir açıyla forseps ile iğne ucu bölünürler. Orada enjeksiyon iğneleri (örneğin 11,12) için kırma ve dolum için diğer yöntemleri vardır, ama biz küçük bir damla (0,5 - 1 ul) koyarak RNA ile iğne doldurun arkasında sonuna kadariğne. Embriyolara microinjecting için, Pico-enjektör (Medikal Sistemleri) olmanın en yaygın piyasada mevcut enjeksiyon sistemleri bir dizi, iki ve Nanoject (Drummond Bilimsel) (Daha fazla bilgi için bkz: 11) vardır. Biz tutarlı nanolitre hacimli sunmak için bir zaman dijital set süreyle sıkıştırılmış doğal gaz kullanan Medikal Sistemler PLI-100 Pico-Enjektör, kullanın. Enjeksiyon hacmi bir sahne mikrometre kullanarak her yeni mikropipet için kalibre edilmesi gerekir, ve enjeksiyon zamanı enjekte RNA istenilen miktarda elde etmek için ayarlanmalıdır.
- Sıra 1 embriyolar döllenmiş - 4 hücreli aşamaya 0,1 X MMR% 5 Ficoll içeren bir plastik tabak içine. Forseps ile yerde embriyo Holding, ya bir holding platformu (plasticine veya diş mumu ile çanak alt yapıştırılmış bir ~ 1 mm ızgara ile plastik örgü,) yerleştirerek, (adım 2.1 hayvan blastomer içine istenilen ses enjekte ) enjeksiyon hacimleri ile ilgili ayrıntılar için. Birçok loc Dağıtembriyo boyunca ations, hayvan blastomerlerin her biri en azından bir kere enjeksiyon (örneğin, bir 4-hücre aşaması embriyo için, genellikle bir 2 hücreli aşamada ise her bir blastomerli 1-2 kere enjekte daha homojen bir dağılım elde etmek için Embriyo, biz) her blastomer 2-4 kez enjekte. 2-4 hücre aşamasına kadar bekleyen bir yararı embriyonun normal çatlatma başladı emin olmasıdır. Zaman özünü ise Ancak, enjekte edilmesi gereken fazla embriyoların başka sonuç farkı az olan, 1-hücreli aşamada başlayabilirsiniz. Eski dönem embriyoların sıra kullanılan ve özel hücre tiplerinin enjeksiyon için hedeflenen, ama biz genellikle daha geniş bir anlatım tercih olarak, biz daha fazla sayıda enjeksiyon ihtiyacını azaltmak için genç embriyolar enjekte edilir, bu özellikle yararlıdır edilebilir.
- 0,1 X MMR içeren bir plastik tabak için enjekte edilen embriyolar transfer ve onları sahnede 20-23 13 kadar geliştirmeye olanak sağlar. 14 yaşında 22 embriyolar inkübe ° C istenilen SPE bağlıgelişme ed. (~ 14 ° C kullandıktan sonra ertesi gün nöral tüp diseksiyon için, gün için ~ 22 ° C tuşunu kullanın)
3. Nöral Tüp Diseksiyon ve Kaplama
- Önceki diseksiyonları gerçekleştirmeden, kültür tabaklarında 14 hazırlarlar. İlk olarak, Mattek veya Lab-tek kültür kabı ya da bir lamel yüzeyi üzerinde havuzu ve bir saat (ya da alternatif için inkübe için 200 ug / ml PBS içinde poli-lisin yeterli çözeltisi ile ceket lamelleri, bir oturma cam lameller kullanabilir görüntüleme ve immünsitokimya için cam slaytlar daha sonra yerleşim için bir Petri kabındaki,) gevşek. Aspire ve PBS 3 kez bir fazlası ile yıkayın ve kurumaya bırakın. Sonra 10 mikrogram / PBS ml laminin ile kat yemekler 37 derece az bir saat için (biz genellikle yeterli yüzey üzerinde havuz lamel başına 500 ul kullanın). Laminin çözüm aspire ve PBS fazlalığı ile 3 kere yıkayın, laminin kaplı yüzeylerin hava arayüzü maruz kalmalarına izin için dikkatli olmak. Yenileriyle değiştirilmesinikültür ortamı E PBS ile (% 50 Ringer,% 49 L-15 ortamı,% 1 fetal bovin serumu, artı 50 ug / ml penisilin / streptomisin ve gentamisin, pH 7.4 ve filtre sterilize). (Ringer Ortam, 115 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 10 mM Hepes pH 7.4, 0.5 mM EDTA). Bizim bu protokol ortam kullanan iken, bu nöronların enerji ayrılmış azaltmıştır büyük Xenopus retinal ganglion kültürleri için ortak zenginleştirilmiş bir ortam olduğunu belirtmek gerekir. Genç omurilik kültürlerin hayatta ve ek büyüme faktörleri olmadan saf Ringers Medya fazla 24 saat için büyümek, ve bu gerçekten bu sistemi kullanmanın avantajlarından biri olacak. İsteğe bağlı: Eklentiyi NT3 ve BDNF akson akıbet artırmak için kültür ortamına (25 ul / ng her son konsantrasyonları için).
- Çünkü enjekte mRNA ekspresyonu değişkenlik, embriyo floresan bir mozaik gösterebilir. Önceki exp embriyoların tespit etmek diseksiyonları, floresans varlığı için ekran embriyolar, gerçekleştirmedennöral tüp floresan füzyon proteini Arş. Steinberg'in ortamı (58 mM NaCl, 0.67 mM KCI, 0.44 mM Ca (NO 3) 2, 1.3 mM MgSO4, 4.6 mM Tris, sonra 7.8 pH ile dolu bir agaroz-kaplı plastik çanak içine sahne 20-23 de floresan embriyolar yerleştirin otoklav) 5. Agaroz kaplı çanak, 0,1 X MMR ve let sertleşmesine eritilmiş% 1 agaroz ile plastik tabak kat altında yapmak. Zarar sonraki diseksiyon adımları sırasında kullanılan ince forseps ve tungsten iğne oluşmaz böylece bu yumuşak bir yüzey sağlar. Aşamada 23 ötesine embriyoların Diseksiyonu mümkündür, ancak dokular birbirine daha yakından yapışır ve böylece kollajenaz ile daha uzun tedavi gerektiren olarak daha zordur.
- Diseksiyon kapsamında, ince forseps ile vitellin membran kaldırmak ve sonra kesiler bir dizi yaparak, embriyonun tüm dorsal kısmını izole eder. Tek bir forseps yerde embriyo tutun da, bir kesi yapmak için ikinci kullanınbosluga açığa embriyonun tarafına. Sonra, böylece nöral tüp içeren dorsal kısmını izole etmek yarısında embriyo kesme, embriyonun dorsal ve ventral yarıları arasındaki doku boyunca çimdik iki forseps kullanın.
- Dokulara gevşetmek için bir döndürücü üzerine 15-20 dakika, daha sonra taze Steinberg solüsyonu ile bir plastik kaplı agaroz çanak içine pipet dorsal eksplant Steinberg ortam içinde 2 mg / ml kollajenaz ile bir Eppendorf tüpü içinde dorsal eksplant yerleştirin. Alternatif olarak, eksplant tüm disseksiyon sonra yerine getirilebilir 15 dk için kolajenaz çözeltisi içeren bir Petri tabağına yerleştirilir.
- Forseps bir çift ile hafifçe dorsal epidermis ve ventral Notokordun gelen nöral tüp teşrih. Epidermis ve altta yatan doku arasındaki forseps ucu kaydırın ve yavaşça nöral tüp altında açığa epidermisin geri çekin. Daha sonra, uç arasında kaydırmak için doku tutmak için forseps kullanır ve bir başkanöral tüp ve Notokordun. Son olarak, tüp her iki tarafında Somitlerin kaldırmak için forseps kullanır.
- Adım 3.1 'de açıklandığı gibi, kültür ortamı ile dolu bir agaroz kaplı çanak nöral tüp aktarın.
- Birkaç nöral tüp toplandıktan sonra, yayılan, orta (adım 3.1 'de hazırlanmış) ile doldurulur sonra bilenmiş tungsten iğne veya forseps ve plaka kültür tabaklarında parçaları kullanarak çok sayıda parça (yaklaşık 20, tüm tüp izole ise) parçaya böldüler eşit satır eksplantlar.
- Bu bağlama hücreleri rahatsız çünkü kaplama sonra, yemekler kıpırdama. 20-22 çevresindeki kaplama nöral tüp eksplantlar inkübe ° C. Bu tipik olarak gece boyunca oda sıcaklığında, tezgah üzerinde hücrelerin çanak bırakın. Xenopus laevis nöronların faydalarından biri CO 2 düzeyleri veya sıcaklık düzenleyen hücre kültürü için özel bir inkübatör gerekli değildir olmasıdır. Neurites ve büyüme konileri oda sıcaklığında 12 gözlenen ve imaged olabilirKaplama sonrası -24 saat, akıbet büyüme faktörlerinin eklenmesiyle hızlandırılabilir rağmen. Genel olarak, bir RNA ya da plazmid ürünün ekspresyonu hücreleri arasındaki değişken ifade neden olur ve böylece büyüme konisi arasındaki floresan ifade seviyelerinin, bir dizi olabilir. Bu özel yapı bağlıdır ancak biz, kaplama sonrası 48 saat sonra da devam etmek floresan proteinleri RNA ifade gözlemledik.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1A özetlenmiştir protokolü, izledikten sonra, sağlıklı, doğru-disseke ve kültüre nöral eksplantlar laminin / Şekil 1B gösterildiği poli-lisin substrat, her yönde çok sayıda akson ya neurites dışarı göndereceğiz. Akson uçlarında büyüme konileri lo incelemek için resmin genel motilite dinamikleri Şekil 1C görülen DIC optik,,, ya da yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu biri tarafından görüntülenebilir olabilirfloresan-etiketli hücre iskeleti proteinlerin calization, örneğin, EB1-GFP Şekil 1B 'de gösterilmiştir.
Şekil 1. Deney protokolü ve beklenen sonuç özeti. A) Protokol akış şeması. 3. günde diseksiyonu ile ilgili ayrıntılar için film izlemek. Tüm nöral tüp yaklaşık 20 eşit büyüklükte parçalar halinde kesilir ve lamel satırları eşit olarak yayılması gerekir. Bu karikatürde, makasla ince forseps ile doku kesme temsil tasvir edilir. CG koryonik gonadotropin B) eksplant (sol üst köşesindeki eksplant) dışında büyüyen aksonların veya neurites DIC görüntü. Büyüyen bir aksonun ucunda büyüme konisinin C) Yüksek büyütmeli görüntü. Büyüme konisinin EB1-GFP D) Floresan mikroskobu görüntüsü. Ölçek çubuğu 10 mikron. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Eğer şartlar uygun olursa Xenopus laevis nöral eksplantlar laminin / poli-lisin substrat üzerindeki kaplama sonra 24 saat ile çok sağlam bir şekilde dışarı neurites gönderebilirsiniz. Tipik bir uzunluk 100 um ya da daha fazla olmasına rağmen, bu alt-tabaka ile, büyüme koni son derece öldürücüdür ve eksplant dışa doğru her yönde uzanan, 1 mm 'ye kadar akson uzunlukları elde edilebilir. Neurites dışarı büyümek yoksa, durum bu nedenleri sınırlı sayıda vardır. Bir olasılık nöral eksplantlar düzgün çanak bağlı d...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Yazarlar kurbağa tesisin kullanımı için eğitim ve Kirschner laboratuar Bob Freeman teşekkür ve destek için Van Vactor laboratuar üyeleri olacaktır. Biz Şekil 1'de görüntüler için ışık mikroskobu ile yardım için Harvard Tıp Okulu'nda Nikon Görüntüleme Merkezi ederim. Bu çalışma aşağıdaki tarafından finanse edildi: NRSA NIH dostluk ve LAL NIH K99 dostluk, Temel Bilim Ortaklığı finansman ( https://bsp.med.harvard.edu/ to AEF) ve NIH RO1 NS035909 DVV için
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog Numarası | |
| Koryonik gonadotropin | Argent Kimya Laboratuvarları | C-HCG-ON-10 | |
| Sistein | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kiti | Ambion | AM1340 | |
| Borosil İğneler 1,2 mm Kılcal (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma | F2637 | |
| Dumont # 5 Biologie Inox Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11252-20 | |
| Kollajenaz | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek yemekler | Mat Tek A.Ş. | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| NT3 | Sigma | N1905 | |
| BDNF | Sigma | B3795 |
Kaynaklar
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890(2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
