Yöntem makalesi

Mikroarray'ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

14.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4238

⸱

17 Aralık 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Australian Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of Botany, University of Melbourne, 2Plant Cell Biology Research Centre, School of Botany, University of Melbourne, 3CSIRO Plant Industry, Black Mountain Laboratories, 4Department of Plant Biology and Biotechnology, University of Copenhagen

Bu makalede

Özet

Denilen bir tekniği C Omprehensive M Icroarray P olymer profil (CoMPP) tarif edilir. Bu yöntem, biyolojik bağlamlarda geniş bir aralıkta glikan geçtiği tarama izin veren bir minyatür mikrodizi analitik platformu ile tanımlanan glikan-epitoplara karşı yönelik monoklonal antikorlar özgüllük birleştirir.

Özet

Bitki hücre duvarları fizyolojisi ve bitki gelişmesinde önemli bir rol oynar ve insan topluluklarının (örneğin tahta, kağıt, tekstil ve biyoyakıt endüstrisi) 1,2 için hammadde sağlamak heterojen glukanlardır karmaşık matrisler vardır. Bununla birlikte, bu bileşenlerin biyosentezini ve işlevlerini anlamada zorlu kalır.

Hücre duvarı glukanlardır kimyasal ve yapı taşları, glikozil kalıntılarının karmaşıklığı nedeniyle conformationally çeşitlidir. Bu formu çoklu pozisyonlarda bağlar ve halka yapısı farklı, izomerik ya da anomerik konfigürasyon, ve ek olarak, non-şeker artıkları bir dizi ile sübstitüe edilmiştir. Glukanıdır kompozisyonu hatta farklı hücre ve / veya doku tipleri veya tek bir hücre duvarı 3 alt alan adları değişir. Ayrıca, bunların bileşimi, aynı zamanda 1 geliştirme sırasında, ya da çevresel işaret 4 yanıt olarak modifiye edilir.

Ex2.000 genlerin cess Bitki hücre duvarlarının heterojen glukanlardır karmaşık matrisler Arabidopsis 5 hücre duvarı glukanıdır biyosentezi ve modifikasyonu yer alacağı öngörülmüştür olanlarıdır. Bununla birlikte, biyosentez genlerinin göreceli olarak az sayıda işlevsel olarak 4,5 karakterize edilmiştir. Genlerin çoğu zaman farklı olarak hücre tipleri 6 arasında, sık sık düşük seviyelerde ifade edilir çünkü karşıt genetik yaklaşım zordur. Ayrıca, mutant çalışmalar genellikle uygun hücre duvarı işlevi 7 korunmasını sağlamak için gen fazlalık veya telafi edici mekanizmalar tarafından engellenmiştir. Böylece yeni yaklaşımları hızla glukanıdır yapıların çeşitli karakterize etmek ve anlayış hücre duvarı biyosentezi ve modifikasyonu fonksiyonel genomik yaklaşımlar kolaylaştırmak için ihtiyaç vardır.

Monoklonal antikor (mAb) 8,9 Bitkilerde glukanıdır yapısı ve dağılımı belirlenmesi için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu dist tanımakpektinler, xyloglucans, xylans, mannans, glukan ve arabinogalactans gibi bitki hücre duvarının glukanlardır ana sınıfları, içinde bulunan inct epitoplar. Son zamanlarda bunların kullanımı bitki ve doku tipleri eşzamanlı 9,10,11 geniş bir yelpazede glukanlardır göreli bolluğu belirlemek için geniş çaplı tarama deneyler kadar uzatılmıştır.

Burada düşük reaktif ve numune hacimleri ile minyatür bir mikroarray platformu kullanarak ekranlı olması (100 sn) çoklu örnekleri sağlar Kapsamlı Mikroarray Polimer Profiling (CoMPP) (Şekil 1 ve 2) 10,11 adlı bir mikroarray tabanlı glukanıdır tarama yöntemi sunuyoruz. Mikroarray üzerinde nokta işaretleri resmen glukanıdır epitop oluşumu hakkında yarı-nicel veri vermek için ölçülebilir. Bu yaklaşım karmaşık biyolojik sistemlerin 12 glukanıdır değişiklikleri izleme ve hücre duvarı kompozisyonları küresel bir bakış sağlamak için uygundur, özellikle önceki bilgilerif Bu kullanılamıyor.

Protokol

1. Doku Toplama ve Hazırlama

  1. Ilgi her doku için en az üç nüsha halinde bitki dokularının 100 mg taze ağırlık (10 mg kuru ağırlığının minimum) toplayın. Aşağıdaki adımları vejetatif doku hücre duvarı malzemesinin hazırlanması açıklanmaktadır. Depolama dokularının durumunda, un istenen nişasta enzimatik olarak daha önce 13 açıklandığı gibi hücre duvarı polimerlerin ekstraksiyon işlemine devam etmeden önce kaldırılır.
  2. 24 boru adaptörü kümeleri ve 3 mm tungsten karbid boncuklar (30 Hz, 2 x 30 saniye) ile, Qiagen TissueLyser II kullanılarak sıvı azot ile birlikte ince toz haline örnekleri homojenize edilir. Sadece birkaç örnek işleniyor Alternatif olarak, eğer bir havanda kullanılır.
  3. 10 ml plastik konik tüpler içine homojenatlarında aktarın.
  4. Oda sıcaklığında 10 ml% 80 v / v etanol içinde homojenat yıkama ve 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde vorteks hücre çeperi materyali hazırlanır.
  5. 3.500 x g'de santrifüjleyin ve supernatant atın. Süpernatant berrak olana kadar% 70 etanol, özellikle, klorofil içeren dokular için, ya da en az üç kez yıkama tekrarlayın.
  6. % 100 aseton ile son yıkama yapın ve gecede kurumasını bekleyin Alkol Çözünmeyen Kalıntı (AIR) içeren granül bırakın.
  7. Elek AIR ince, homojen toz elde etmek ve kötü, bazen homojenat kalır zemin partikülleri büyük kaldırmak için 0.4 mm 2 mesh ile örnekleri.
  8. Mikrotüpler, numunelerin karışım yardım etmek için bir 3 mm cam boncuk içeren her birine 10 mg AIR örnek tartılır.

2. Hücre Duvarı glukanlardır çıkarımı

  1. Pektinler ile ilişkili pektinler, ve polimer her bir örnek için 50 uM CDtA (pH 7.5), 500 ul ilave edilerek numune çıkarılır.
  2. Kısaca girdap boruları çözücü numune malzeme ile temas halinde olmasını sağlamak ve böylece 8 Hz, 3 saat boyunca TissueLyser ile karıştırılır.
  3. Dikkatle, 12.000 xg'de santrifüjleyin r4 ° C'de süpernatan ve mağaza kaydının silinmesi
  4. 13,000 x g hızında kalan herhangi bir çözücü, girdap ve santrifüj sulandırmak ve çıkarmak için de-iyonize su, 1 ml granül yıkayın. Pelet bozmadan bu adımı yineleyin ve sonraki adıma geçmeden önce tüplerin tüm sıvı kaldırmak.
  5. Çapraz bağlama glukanlardır ardışık olarak% 0.1 ile 4M NaOH ile 500 ul, kalan hücre duvarı peleti elde edilir adımlar 2.1 'de tarif edilen prosedür kullanılarak w / v NaBH4, - CDtA çıkarılması için 2.4. NaBH4 böylece polisakaritlerin soyulma baz engelleyen bir alkol ile polisakaritler azaltılması sonunda aldehit (ya da keto) grubu azaltmak için eklenir.
  6. Santrifüjlemeden sonra, süpernatan tekrar çıkarılır, 4 ° C de depolanır ve peletlerin bir sonraki ekstraksiyon işlemine geçmeden önce de-iyonize su ile iki kere yıkandı.
  7. Isteğe bağlı bir adım olarak, bu tür selüloz gibi polimerlerin kalıntı, 500 ul cadoxen (% 31 v / v 1,2-diami ile ekstre edilmiştir2.4 - 2.1 adımlar açıklandığı gibi aynı prosedürü kullanarak 0.78 M CdO ile noethane). Alternatif olarak, kalan pelet mutlak selülozik içeriği Asetik / Nitrik testler (Tartışma bakınız) kullanılarak tespit edilebilir.

3. Baskı Mikroarray'ler

  1. Santrifüj süpernatantlar herhangi bir partikül madde kaldırmak için 13.000 xg'de hücre duvarı polimerleri ekstre içeren.
  2. Bir de polipropilen 384 numune doku tipi ve ekstraksiyon tipine göre düzenlenir Önceden tasarlanmış özel bir düzen kullanarak mikrotiter plaka içine her bir örnek 50 ul yükleyin.
  3. Deiyonize su ile 0, 5 ve 25 × seri dilüsyon serisi hücre duvarı polimer örneği seyreltin.
  4. Böyle pin yüksekliği, toplama ve bekleme süresi, ve yıkama adımları gibi parametreler microarrayer kontrol yazılımı ayarlanır.
  5. Baskı bölmesinin nem örnek buharlaşmasını önlemek için% 60 kontrol edilir.
  6. Yazdırma işi LabNEXT softwa ile başlatıldığıyeniden ve mikroarray düzeni karşılık gelen bir program.
  7. Robot makine düz bir levha üstüne tutturulmuş 20 x 20 cm nitroselüloz membran üzerinde numune plaka çözümleri yazdırmak için kılcal kanal işaretçilerine kullanır. Dizisindeki her nokta çözümü 15 nl içerir ve üç nüsha halinde basılır.
  8. Yazdırma işi tamamlandıktan sonra Özdeş mikroarrayler Tek tek dizileri içine membran ve kesim birbirlerine yanında yazdırılır.
  9. Her bir deneyde, diziler daha fazla ya da daha az örnekleri, seyreltici ya da çoğaltır yerleştirmek için modifiye edilebilir.

4. Glukanıdır Mikroarray'ler arasında Sondalama

  1. Baskıdan sonra, spesifik olmayan bağlayıcı azaltmak için fosfat içinde çözüldü ağırlık / hacim kaymağı alınmış süt tozu 2 saat boyunca oda sıcaklığında (Mpbs) tamponlu tuzlu su içinde% 5 bireysel mikrodizileri bloke eder.
  2. Mpbs içinde 2 saat için hücre-duvar glikan epitoplar için spesifik monoklonal antikorlar ile Sondası mikrodizileri. Monoklonal antib çoğunluğuHücre duvarı glukanlardır karşı odies üç firmalardan ticari olarak temin edilebilirler; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource Hizmetleri ( www.carbosource.net ) ve PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
  3. Bir negatif kontrol, sadece Mpbs ve birincil antikor ile birlikte inkübe bir mikro içerir.
  4. Fosfat içinde 3 kez spesifik olmayan bağlanma kaldırmak için 5 dakika için (PBS), tamponlu tuzlu su mikrodizileri yıkayın.
  5. 2 saat için Mpbs içinde yabanturpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonder antikor ile mikrodizileri kontrol edin. Hücre duvarı glukanlardır karşı en monoklonal antikorlar, anti-fare veya anti-sıçan sekonder antikor gerektirir.
  6. Spesifik olmayan bağlanma kaldırmak için 5 dakika için 3 kez PBS tamponu ile yıkama adımları tekrarlayın.
  7. Kromojenik (3,3-diaminobenzidin) ya da chemil kullanılarak mikrodizileri geliştirmekuminecent (luminol) yüzeyler.

5. Niceleme

  1. Kalkınma sonra, yüksek çözünürlüklü (1200 dpi) masaüstü tarayıcı kullanarak bireysel mikroarrayler taramak ve negatif, 16 bit TIFF dosyaları (Şekil 3) olarak kaydedin.
  2. Otomatik ızgara aracı ile donatılmış Görüntü İşleme Yazılımları (LabNEXT) Xplore kullanarak her nokta ayrılmaz yoğunluğunu hesaplayın. Tamamlayıcı nokta yoğunluğu her bir nokta çevreleyen ızgara alanı içinde piksellerin toplamı elde edilir.
  3. Her mikroarray için grid veri bir txt dosyası olarak ihraç edilir ve manuel analizi için bir Excel elektronik tablo içine alınabilir. Bir çevrimiçi araç ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) otomatik olarak tercüme ve bireysel txt dosyalarından veri işlemek için geliştirilmiştir.
  4. İntegral nokta yoğunluğu baskı çoğaltır genelinde ortalama bir 'ortalama bir nokta elde etmek dilüsyonları edilirHer numune için yoğunluk 'değeri (Şekil 2). Alternatif olarak, bir dizi üzerinde sadece tek bir seyreltme değerine karşılık gelen nokta sinyaller her bir numune için göreli bolluk glikan epitop ölçmek için kullanılır.
  5. Farklı numuneler arasındaki göreceli ortalama nokta yoğunlukları excel veya çevrimiçi heatmapper araçları (koşullu biçimlendirme kullanarak bir heatmap (Şekil 4) olarak sunulmaktadır http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Her antikor tipi için veriler 100 düzeltilir ve% 5 eşik değeri arka sinyal ve yanlış pozitif kaldırmak için uygulanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Nicotiana alata çiçeklerden altı doku tipleri (anter filamentler, polen, yumurtalıklar, yaprakları, sepals ve stigma) olarak glukanlardır göreli bolluğu CoMPP kullanılarak belirlendi. Şekil 3A kısmen (düşük) methylesterified homogalacturonan (HG), pektik polisakkaritler 14 oluşur bir epitopu için mAb JIM5 özel ile probed edilmiş bir temsilcisi mikroarray gösterir. JIM5 epitopunu çiçek dokuların CDtA özleri algılanırsa ancak mercek dokusu (Şekil 3A ve 4A) polen ve en düşük en yüksek o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CoMPP birkaç gün içinde yüzlerce bitkisel kaynaklı numunelerin glukanıdır kompozisyonu profilleme için hızlı ve hassas bir yöntemdir. Bu yöntem, lektinler, reseptörleri ve antikorları 16 gibi glukanıdır-bağlayıcı proteinler ile karbohidrat etkileşimleri yüksek verimli tarama zaten mevcut bakteriyel veya memeli glukanıdır dizi platformlar tamamlar. Hücre duvarı glukanlardır tespit etmek için kullanılabilir probları geniş bir çeşitliliği ile, bitki hücre duvarı 8,9 polisakkaritlerin tüm ana sınıfa ai...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

IEM finansman Danimarka Araştırma Konseyi (FTP ve FNU) kabul etmek istiyorum. ERL bir ARC DP hibe desteği kabul etmektedir. AB Bitki hücre duvarları hibe Mükemmellik ARC Merkezi'nin desteği ile hazırlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
3 mm Tungsten Karbür boncuk Qiagen 69997
Koleksiyon mikrotüpler (1,2 mm) Qiagen 19560 1.5 ml mikrofüj tüpler de kullanılabilir
Qiagen TissueLyser II Qiagen 85300
3 mm cam boncuklar Sigma Aldrich Z143928
CDtA Sigma Aldrich 34588
Oksit Kadmiyum Sigma Aldrich 202894
1,2-diaminoetan Sigma Aldrich 03550
Nitroselüloz membranı (0.22 mikron gözenek boyutu) GE-su ve proses teknolojileri EP2HY00010 farklı gözenek boyutlu membranlar farklı pin tipleri için uygundur
Xact II microarrayer robot Labnext 001A Xact II robot nitroselüloz membran bağlı olduğu özel bir 20 x 20 cm seramik plaka takıldı
RM mikroarray işaretçilerine Xtend Labnext 0037-350 işaretçilerine zarlarında tespit için uygun olmalıdır
384 oyuklu plakalar (polipropilen) Greiner 781207
Anti-glikan monoklonal antikor / Bitki Probları
CarboSource / Biosupplies 		Web siteleri; PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "target =" _blank "> www.carbosource.net) ve Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ).
Anti-sıçan IgG (tüm molekül) - keçi üretilen peroksidaz antikor. Sigma A9037 İkincil antikor tipi (örneğin fare, sıçan, keçi vb yükseltilmiş) kullanılan birincil antikor bağlıdır.
SIGMA FAST 3,3 '-diaminobenzidin tablet Sigma D4293 reaktif geliştirilmesi tipi, kullanılan ikincil antikorlar ve tespit yöntemi (colourmetric, ya da chemiluminecent) bağlıdır.
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Yüzey Thermoscientific 34080 yukarıya bakın
Görüntü İşleme Yazılımları Xplore LabNext 008 Otomatik gridding araçları ile birçok yazılım türleri mevcutturmikroarray noktalar piksel değerini ölçmek için.
Bitki polisakkaritler Sigma / Megazyme
tr>

Kaynaklar

  1. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
  2. Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
  3. Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
  4. Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
  5. Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
  6. Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
  7. Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
  8. Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).
  9. Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
  10. Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
  11. Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
  12. Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506(2011).
  13. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , In Press (2012).
  14. Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
  15. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
  16. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
  17. McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
  18. Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
  19. Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
  20. Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
  21. 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
  22. Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
  23. Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
  24. Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
  25. Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikrodizilim AnaliziMonoklonal AntikorlarH cre Duvar GlikanlarKapsaml Mikrodizilim Polimer ProfilllemeAlkolde z nmeyen Kal ntCDTA EkstraksiyonuSodyum Hidroksit EkstraksiyonuSpot Sinyal Kantifikasyonu

İlgili makaleler