Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

Özet

Kranial mezenşimi muhtemel nöral kıvrımların yükselmesi için bir itici güç sağlar dramatik morfojenik hareketleri uğrar ^1,2. Burada basit bir tarif Ex vivo Nörülasyonu sırasında kraniyal mezenşimi ve hücresel davranışları karakterize tahlil eksplantasyona. Bu testte farmakolojik manipülasyonlar ve canlı görüntü analizlerinin mükellef olması dahil birçok uygulama vardır.

Özet

Merkezi sinir sistemi Nörülasyonu gibi bilinen bir işlem nöral tüp oluşumu ile sonuçlanan kompleks morfogenetik bir dizi hareket geçer sinir plaka elde edilir. Nörülasyonu sırasında nöral plakayı temelini mezenşimi morfogenezi nöral kat yüksekliği sürücü inanılıyor. Kranial mezenşimi paraxial mezoderm ve nöral krest hücrelerinden oluşur. Kraniyal mezenşimi formun hücreleri yıldızsı şekilli hücrelerden oluşan ve nöral kıvrımlar destekleyen ekstrasellüler matriks (ECM) ipliklerini karışmasının bir pourous ağ örgüsü. Nörülasyonu sırasında kraniyal mezenşimi genişlemesi sonucunda basmakalıp çevrilme uğrar ve bu hareketlerin nöral kat yüksekliği için bir itici güç sağlamak için inanılıyor. Ancak, kranial mezenşimi morfolojilerinden sürücü yolları ve hücresel davranışları kötü okudu kalır. ECM ve kafatası mezenşim underly thes hücreler arası etkileşimleriE hücre davranışları. Burada bu hücrelerin davranışlarını karakterize etmek için tasarlanmış basit bir ex vivo eksplant tahlil açıklamaktadır. Bu testte daha bu hücrelerin davranışını karakterize etmek dahil sinyalizasyon yolakları ve canlı görüntüleme analizleri incelemek için farmakolojik manipülasyonlar iyileştirilebilir. Bu ECM bileşenlerinin çeşitli kafatası mezenşim ve göç özelliklerini karakterize etmek için bu tahlil yararlarını gösteren temsili bir deney sunulmaktadır.

Giriş

Kranial bölgede Nöral tüp kapanma embriyonik gün 8,5 (E8.5) ve fare embriyo 9.5 arasında gerçekleşir. Düzgün anensefali, insanlarda ortak yapısal bir doğum kusuru merkez sonuçlar nöral tüp kapatmak ve Başarısızlık hayat ile uyumsuz. Sefalik nöral tüpün kapanmasında sürücü kuvvetler nöral doku kendisi ve çevresindeki epidermis ve mezenşimi ³ hem de üretilir. Kraniyal mezenşimi Özellikle genişlemesi kranial nöral kıvrımlar ^1,2 yükselmesine için gerekli olduğu düşünülmektedir. Kranial mezenşimi heparin sülfat proteoglikan, kondroitin sülfatlar ve hyaluronat ^4-8 gibi belirli glikozile proteinler ECM proteinleri bakımından zengindir.

Nöral krest hücreleri nöral tüp kapatılması sonrasında dorsal nöral tüp göç tavuk embriyo aksine, fare embriyo nöral krest nöral kıvrımlar r başlaması aynı zamanda göçimkb (5 somite aşamasından sonra). Böylece fare embriyo Nörülasyonu sırasında, kafatası mezenşim nöral tepe ve paraxial mezoderm türetilmiş hücrelerden oluşur. Nöral krest ve paraxial mezoderm nüfus gelişimi farklı zamanlarda indüklenir; embriyonun farklı pozisyonlarda lokalize ve farklı yapıları ^9,10 dönüşebilir. Paraxial mezoderm primitive streak kaynaklanan ve varsayımsal nöral plakayı rol oynadığı embriyo ön bölgeye göç eder. Nöral krest nöral plak ve epidermal ektoderm kavşağında indüklenir, geçiş mezenşimin bir epitel uğrar ve kemirgen embriyoda nöral kat yüksekliği hemen önce delaminates. Nöral krest hücrelerinden branşiyal kemer, frontonasal ve perioküler mezenşimi için subectodermal paraxial mezoderm içinde stereotipik yollar boyunca göç ederler. Paraxial mezoderm kafatasının ve yüz kasları kemiklere bazı katkı sağlayacak; oysa inciE nöral krest kranial sinirler ^9-11 yanında kafatası ve yüz kemiklerinin diğer katkıda bulunacaktır. Paraxial mezoderm ve nöral krest soylar ayirt sırasıyla ⁹ Mesp1-cre ve Wnt1-CRE transgenik fare hatları ile işaretlenmiş olabilir.

Nöral tüpün kapanmasında kranial mezenşimi hayati rolü deney ile kanıtlandı olmuştur nerede ECM, Nörülasyonu düşüklüğüne nöral tüpün kapanmasında ⁷ sırasında hyalüronidaz chondroitinase ABC, heparitinase veya Diazo-okso-norlösin (DON) gibi ajanların bozucu olan kemirgen embriyo ^{tedavisi, 12-14.} Bu deneylerde, Nörülasyonu sonrasında statik bölümlerinin histolojik analiz kraniyal mezenşimi ^7,12-14 arasında ilişkili dysmorphogeneis saptandı. Teratojenik ajan birden dokulara erişimi beri Ancak, kranial mezenşimi gerçekten hedef doku olup olmadığını tespit edilecek kalır. Sonuç destek olarak bu dokuNörülasyonu için gerekli olan, kraniyal mezenşimi eksensefali ^15-17 ile bazı fare mutantlar histolojik analizler üzerine anormal görünür. Yine de, çoğu durumda, kafatası mezenşim bir hücresel davranışı üzerindeki mutasyon etkisi giderilmiş değildir.

Biz doğrudan kranial mezenşimi hücreleri ¹⁵ davranışı üzerinde genetik bir mutasyon ya da farmakolojik manipülasyon sonucu incelemek için bir ex vivo eksplant tahlil geliştirdiler. Bu tahlil, kranial mezenşimi farklılaşma potansiyeli ulaşmak için Tzahor ark 2003 tarafından yayınlanan benzer olduğunu temelini anterior nöral temelini biz kranial mezenşimi daha ön nüfusun göç özelliklerini incelemek için eksplant diseksiyon değiştirdiyseniz hariç rhombomeres ¹⁸ plaka. Bizim yöntemi de ke ile nöral krest göç davranışlarını analiz etmek tavuk embriyo gerçekleştirilen eksplant deneyleri bir değişikliky farklılıklar. Önceki hazırlıkları nöral krest veya daha posterior paraxial mezoderm ^19,20 eksplante oylandı. Ayrıca, tavuk embriyosunda nöral kat yükselmesi sırasında, nöral krest henüz dorsal nöral tüp göç olmamıştır ve böylece anterior paraxial mezodermin alınan eksplantlar nöral krest hücreleri içeren olmaz. Bizim analizde, paraxial mezoderm, nöral krest ve yüzey ektoderm oluşan kranial mezenşimi eksplantlar bir substrat üzerine hazırlanan ve kaplanır. Genetik mutantlar gelen eksplant izolasyon, farklı ECM veya farmakolojik tedaviler eksplantlar kaplama dahil Deneysel manipülasyon yapılabilir. Eksplant ve mesafe, sayısı ve davranış Hücreler göç analiz ve tedavi grupları arasında karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, bu hazırlık canlı görüntüleme teknikleri ile hücresel göç analizleri iyileştirilebilir. Kürk göç deneyden sonra, eksplantlar tespit edilebilir ve immünohistokimyasal analizler tabitedavilerin etkisini açıklamak Ther. Genel olarak, burada sunulan protokol kraniyal mezenşimi davranışını araştırmak için basit bir ex vivo bir testtir. Temsilcisi deney olarak, farklı ekstraselüler yüzeylerde kranial mezenşimi göç incelemek için bu testte kullanmaktadır.

Protokol

1. ECM Kaplı Kültür Yemekleri veya lameller hazırlanması

1. PBS içinde ECM substrat (Dulbecco Saline, Invitrogen, # 14040-133 Fosfat Tamponlu) çözülmesi ECM stok solüsyonu hazırlayın. -80, Bir 0.2 mm şırınga filtresi (VWR, # 28145-495) ve alikots içinde dondurularak ° C ile filtre
2. PBS içinde istenilen konsantrasyona ECM stok solüsyonu seyreltin. MaxGel için DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Medium, Invitrogen, # 11995-065) içinde seyreltin.
3. Immünofloresan yapılacak ise, etanol daldırma ile 12 mm dairesel cam lamelleri (VWR, # 89.015-724) sterilize ve kurumaya bırakın. Bu, steril laminer başlık içinde yapılmalıdır. Immünofloresan gerçekleştirilmez ise 1.5 adıma atlayın.
4. Sıra (Corning, # 3526), ​​24 kuyulu plakanın her bir kuyuya lamelleri sterilize edilir.
5. 3 saat boyunca oda sıcaklığında 24 kuyulu plaka ve inkübe her bir kuyucuğa seyreltilmiş substrat çözeltisi 0.5 ml ilave edilir.
6. ECM çözümü kapalı aspire ve thre yıkayınPBS e kat.
7. PBS kapalı aspire ve hemen kullanın ya parafilm sarılmış ve 4 ° C'de en fazla 2 hafta saklanabilir.

2. Diseksiyon araçları hazırlanması

Ilave mangal kömürü ile Sylgard plakaları üreticinin protokolüne göre hazırlanır. Bu levhaların dayanıklı siyah arka embriyo aşağı bağlantılarını ve renkli saydam embriyo görselleştirme kolaylaştırır iyi bir kontrast sunuyor için destek sağlar.

1. Plakaları hazırlamak için bir denge 150 gr Bölüm A sıvı 15 g Kısım B ve 1 g kömür tozu (Dünya Hassas Aletler, # SYLG184) üzerinde bir tri-dökmek behere doğrudan tartın. Tahta bir popsicle sopa veya dil depressor kullanarak birlikte karıştırın. Cam veya plastik 100 cm tabaklar içine dökün. Kabarcıkları yakmak için yemekler yukarıdaki 10 ila 12 inç hakkında tutulan küçük bütan meşale kullanın. Sıra plakaları üzerinde kapakları ve izin ayarlamak için en az 24 saat boyunca oturmak.
2. (0,1 mm Diamete bir Minutien pin ucu diseksiyon araçları hazırlamakr) bir pim tutucusu (İnce Scientific araçları, # 26002-10 ve # 26018-17, sırasıyla) alternatif olarak 26 gauge iğne (BD, # 309597) forseps yardımıyla dik açılı kıvrılmış içine kesme araçları olarak kullanılabilir. Bir taş netlik (Güzel Bilimsel Araçları, # 29008-22) kullanarak Netleştirilmiş Öğrenci Dumont # 5 Forseps (Güzel Bilim Araçları, # 91150-20).
3. Kullanmadan önce% 70 etanol ile tüm diseksiyon aletleri sterilize edin.

3. Embriyolar Koleksiyonu

1. Hayvan kullanımını komitesi yönetmeliklere göre 8.5 gün sonrası coitum de zaman aşımına hamile fare Euthanize ve rahim kaldırmak.
2. Steril PBS ile bir plastik Petri kabı yerleştirin rahim.
3. Steril PBS ile bir kez rahim yıkayın.
4. Bir diseksiyon mikroskobu altında dikkatle forseps bir çift kullanarak desidual elde edilen embriyo çıkarın.
5. Extraembryonic membranlar çıkarın ve gerekirse genotipleme için kaydedin.
6. Somitlerin sayarak Sahne embriyo. İdeal aşamaları eksplantlar hücresel beh analiz yapmaknöral kat yüksekliği boyunca Avior nöral kıvrımlar sadece yükseltmesine başlıyor ve kraniyal mezenşimi önemli morfolojilerinden gerçekleşmeden önce 6 ve 10 somite aşamaları arasında olacaktır.
7. PBS içinde embriyo yıkayın. Hiçbir fenol kırmızısı (Invitrogen, # 21.063-029) içeren DMEM ile siyah Sylgard tabak koyun. Extraembryonic membranlar çıkarın ve gerekirse genotipleme için kaydedin.

4. Eksplant Hazırlanması

1. Embriyonun baş bölge üzerinde mümkün olan en yüksek büyütmede mikroskop Refocus.
2. Her elinde bir diseksiyon iğne ile kesikler yapın. Kesinti yapmak yerine doku ve diğerini tutmak için bir iğne kullanın.
3. Rhombomeres anterior embriyonun kafasını kesti.
4. Iki eşit parçaya kafasını ikiye bölmek orta hat boyunca kesin.
5. Baş ve orta hat dış saçaklar etrafında kesin. Bu kesikler dış sınırda premigratory kret ve yüzey ektoderm kaldırmak ve olacakorta hattan prechordal plakası. Kalan doku eksplant olacak ve göç kranial nöral krest, paraxial mezoderm ve yüzey ektoderm içerecektir.
6. Doku kesilmiş olarak, steril bir Pasteur pipeti kullanılarak tabaktan parçalara artığı çıkarın. Bu disseke enkaz ile eksplant karıştırıyor önler.
7. Yavaşça 20 ul pipet ve Pipetman yukarı veya aşağı pipeting tarafından eksplant yıkayın. Bu gevşek tutturulmuş hücreler kaldırmak ve eksplantlar üzerinde pürüzlü kenarları engeller.
8. Dikkatli bir şekilde 20 ul pipet ucu ile Pipetman ve de kaplanmış kültür merkezinde yer kullanarak sıvı, yaklaşık 10 ul, her eksplant al.
9. Eksplant karşılamak için% 15 FBS ile takviye kültür ortamı 20 ul ekleyin.
10. 1-2 saat boyunca nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi (% 5 _CO2, 37 ° C) içinde yer plaka eksplant çanak tabanına takmak için izin verir. Eksplant kuru değil emin olmak için periyodik olarak görüntüledışarı.
11. Eksplant bağlı sonra, dikkatli bir şekilde ° C'de bir su banyosu içinde 37 ısıtıldı edilmiş% 10 FBS ile takviye edilmiş Her bir oyuğa 250 ul DMEM ilave edin. Bir kez eksplantları plakası yavaşça mikroskop altında sarsıldığı zaman onlar hareket etmez eklenmiş.
12. Doku kültürü inkübatör tabak dönün.
13. 24 saat sonra, eksplantlar sıkıca tutturulmuş olacak ve hücrelerin göç başlayacaktır. Bu zamanda farmakolojik ajanlar ortama ilave edilebilir.
14. 48 saat sonra kaplama, hücreler eksplantlar göç olacaktır. Göç mesafesi görüntülenebilir ve görüntülü olabilir. Eksplantları uzun inkübasyonlar azalmış canlılık belirtileri göstermeye başlayabilir çünkü biz genellikle bu noktada kültür durdurun. A, akridin turuncu ve tripan mavi boyası gibi hayati da eksplant canlılığı kontrol etmek için de kullanılabilir.
15. Bu noktada görüntüleri eksplant göç hücrelerinin mesafe ve sayısını belgelemek için elde edilebilir. Alternatif olarak, eğer eksplantlar, lamelleri üzerine ekildionlar sabit ve immünohistokimyasal analizler ilgi proteinlerin görselleştirmek için yapılabilir.

Protokolünde Kritik adımlar

1. Yaklaşık olarak aynı boyut ve eksplantlar kesin.
2. İstediğiniz eksplante dokusu ile kafa karıştırıcı enkaz önlemek için diseksiyon gibi kesme plakası kapalı tüm diseksiyon enkaz temizleyin.
3. Kuyularda veya lamelleri üzerine kaplama eksplantları kuyu merkezinde eksplant ile medya damlacık yer emin olun zaman.
4. Medya ile de sel önce takmak için yeterli zaman eksplantasyona bekleyin.
5. Tedavi şartları kullanılan her test yüzey ve farmakolojik ajan için standardize edilmelidir.
6. İki eksplantlar (soldan ve bir nöral tüpün doğru bir kişi) her bir embriyo yapılabilir.
7. Farklı deneysel koşullar altında mutant fare hücre hatlarından göç test ederken, tedavi edilen grup içinde bir mutantı, kontrol grubunda eksplant ve diğer koydu.

Sorun Giderme

1. Eksplantları takmak için başarısız olursa, eki için ayrılan süre artar. Bizim tecrübelerimize göre, eksplantlar yaklaşık yarısı binmemelidir ve büyük eksplantlar daha verimli yapışır.
2. Eksplantları kuyunun çevresine eklerseniz bunlar görüntü zor olacaktır. Kuyunun merkezi eksplantlar yerleştirdiğinizden emin olun.
3. İdeal eksplantları yaklaşık aynı boyutta olacaktır. Bununla birlikte, eksplant büyüklüğü arasındaki çelişkiler eksplantlarından hücre göçü quanitating zaman bir düzeltme faktörü olarak eksplant çap kullanılarak düzeltilebilir.
4. Bulaşması halinde steril çalışma koşulları kullanılmaktadır emin olun. Tüm araçlar ve çalışma yüzeyleri% 70 etanol ile sterilize edilmelidir. Pipetler ve Petri kutularına yeni ve steril olmalıdır.
5. Eksplantları diseksiyonu sırasında kaybolan alıyorsanız, periyodik eksplant kaybını engellemek için enkaz kaldırma.
6. Mastering diseksiyonu zaman alıcıdır ve pratik gerektirir. Optimal büyütme, keskin diseksiyon araçları ve iğneler yardımı.

Sonuçlar

Kafatası mezenşim eksplantlar göç eden hücrelerin görünümü Şekil 2 'de gösterilmiştir. , Laminin (100 mg / ml, Sigma # L2020), MaxGel ECM (DMEM içinde 1:500 seyrelti, biz fibronektin (Sigma # F1141 100 mg / ml) içeren Nörülasyonu sırasında kafa mezenşim içinde mevcut olan çeşitli ECM substratlar üzerinde göç test ; Sigma # E0282) ve hiyalüronik asit (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Hiçbir ECM (Veri gösterilmemiştir) mevcut olduğunda Hücreler eksplant göç başarısız ve tüm yüzeylerde hücrelerin desteklenen göç test. Şekil hem de eksplantlar göç eden hücre boyutları her iki alt tabaka bağlıdır. Daha önceki çalışmalarda farklı ECM ​​ile hücre etkileşimi tarafından üretilen mekanik kuvvetlerin hücrelerin ²¹ şekli ve göç özellikleri hem de etkili olduğunu göstermek olarak bu beklenmektedir.

Şekil 1. Eksplantlar hazırlanması. (A) hazırlamak için eksplantlar, E8.5 embriyolar desidual ve extraembryonic dokulardan disseke edilir. (B) embriyo kafaları gövde ön dan rhombomeres için disseke edilir. Eksplantlarından sırasıyla, sınırda orta hatta ve premigratory nöral krest ve yüzey ektoderm de prechordal plakasını kaldırmak için orta hat ve başın dış kenarları dokular çıkararak tarafından hazırlanır. (C) Eksplantlarından orta hat ve sınırlardaki premigratory nöral krest ve yüzey ektoderm de prechordal plaka çıkarmak için baş orta hat ve dış kenarlarından doku keserek hazırlanır. (D) eksplantlar ECM kaplı tabaklar / lameller üzerine küçük bir ortam hacmi içinde yerleştirilir ve daha fazla ortam ilave edilmeden önce eklenmesi sağlanır.

Şekil 2. Farklı yüzeylerde kaplama eksplantlarından kranial mezenşimi hücrelerin Göç. Eksplantlarından Fibronektin, laminin, MaxGel ECM veya Hyaluronik asit kaplama ve kültür içinde 48 saat sonra fotoğraflandı. Boyut bar = 200 mm.

Tartışma

Burada uygulanan yöntem, kranial mezenşimi hücrelerin davranışlarını incelemek için güçlü bir tahlil sağlar. Burada yer alan statik analiz ek olarak, GFP-etiketli proteinlerin ekspresyonu ile parlak saha olarak ya da kombinasyon halinde görüntüleme deneyler yaşayan bunlar eksplant göç gibi, gerçek zamanlı olarak hücre davranışlarını incelemek için kullanılabilmektedir. Canlı görüntüleme deneyler için, eksplantlar Dii ile etiketlenmiş olabilir veya paraxial mezoderm, ROSA-YFP gelen nöral krest göç ayırt etmek; Mesp1-CRE veya ROSA-YFP; Wnt1-CRE veya diğer transgenik hatları kullanılabilir. Kraniyal mezenşimi-ECM etkileşimleri de bu eksplant tahlil kullanılarak incelenebilir. İşte biz bu hücrelerin farklı derecelerde bunlar üzerinde göç ve ECM hücrelerinin morfolojisini etkilediğini göstermek için kranial mezenşimi mevcut olan farklı ECM yüzeylerde plaka eksplantlar. Ayrıca, eksplant cel davranışlarını erişmek için üç boyutlu bir matriks içinde gömülü olabilirBu bağlamda ls. Bu eksplant tahlil göç düzenleyen ve değiştirebilirsiniz içsel ve dışsal ipuçlarını analiz kraniyal mezenşimi davranışları üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyonlar etkisinin analizine iyileştirilebilir. Örneğin, biz Hectd1 mutant kranial mezenşimi ¹⁵ anormal hücre davranışlarını aşırı hsp90 salgı rolü ayırt etmek bizim çalışmalarda bu testte kullanılmıştır. Bu deneylerde, bu Hectd1 mutant hücrelerin anormal davranışları fazla hücre dışı HSP90 ¹⁵ bağlı olduğunu göstermek için HSP90 salgılanmasını engellemek için anti-HSP90 antikor ile eksplantlar, HSP90 proteini, geldanamycin ve DMA (dimetil amelioride) tedavi edildi. Benzer yaklaşımlar farmakolojik kraniyal mezenşimi normal veya anormal morfolojilerinden altta yatan ek yolları kesmek için kullanılan olabilir. Tahlil tamamlandıktan sonra, eksplantlar ve göç eden hücrelerin yöntemler bir dizi ile analiz edilebilir. Örneğin, immünohistokimyasal analizler cBir hücre hareketleri için kritik proteinlerin yerelleştirme incelemek için istihdam edilecek. Transcriptome analizleri de tedaviler gen ekspresyonu nasıl etkilediğini belirlemek için istihdam edilebilir.

Bu tekniğin bir önemli sınırlama onlar in vivo olarak ortaya çıkıyordu üç boyutlu modeli davranışları değil olmasıdır. Eksplantlar floresan protein-işaretli hücresel bölümlerin ifadesi ile birlikte, üç boyutlu bir matris (örneğin, Matrigel) gömülü olan protokol Modifikasyonu Bu sorunu çözmek için gerekli kullanılabilirdi. Bu değişiklikler yapılmıştır bile, in vivo olarak, bu, bu ex vivo deneyi de görülen davranış ilişkilendirmek için başka deneyler gerekli olacaktır. Diğer sınırlamalar istatistiksel olarak anlamlı verileri oluşturmak için yeterli sayıda üretmek için gerekli embriyoların çok sayıda bulunmaktadır. En önemlisi, diseksiyon nispeten basit, o ana uygulama gerektirir.