Görselleştirilmesi ve fare hepatik ven veya intrahepatik safra kanalı 3-boyutlu yapısının nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu reçine döküm yöntemiyle aynı zamanda diğer duktal ya da damar sistemlerine uygulanabilir ve olanak edilebilir In situ Bir sistemin sağlam iletişim mimarisinin görselleştirme veya miktar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
3-Boyutlu Reçine Döküm ve Fare Portal Ven veya intrahepatik safra Sisteminin Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Organlarda, vasküler ve duktal yapıların doğru mimarisi düzgün fizyolojik fonksiyonu için vazgeçilmez olduğunu ve bu yapıların oluşumu ve bakımı son derece düzenlenir süreçtir. Bu kompleks, 3-boyutlu yapıların analiz çok bölüm halinde ya da enjeksiyon boya çalışmalar, hem 2-boyutlu inceleme bağlı gelmiştir. Bu teknikler, ancak onlar aydınlatmak amaçlanmıştır duktal veya vasküler yapıların tam ve ölçülebilir temsilini sağlamak mümkün değildir. Alternatif olarak, 3-boyutlu plastik reçine kalıplara doğası sisteminin bir sürekli anlık oluşturur ve 3-boyutlu yapı ve ağ görselleştirilmesi ve hesaplamak için bir yeni ve çok kullanışlı bir yöntemdir.
Reçine döküm sisteminin çok önemli bir avantajı bir kan damarı ya da kanal intakt ve bağlı veya iletişim, yapısını belirlemek için yeteneğidir. Damar ve duc yapısıtal ağlar organ fonksiyonları için çok önemlidir ve bu tekniğin çeşitli şekillerde vasküler ve duktal ağların çalışma yardımcı olma potansiyeline sahiptir. Reçine döküm, bir lümen yapı normal morfoloji ve fonksiyonel mimari analiz gelişimsel morfogenetik değişiklikleri tespit etmek ve normal ve hastalık durumları arasında doku mimari içinde morfolojik farklılıklar ortaya çıkarmak için de kullanılabilir. Önceki çalışmalar, örneğin çalışma döküm reçine kullanmıştır, yapının 1,2 2 boyutlu analiz yansıtılmamıştır fare intrahepatik safra sistemi içerisinde mimari ve işlevsel kusurları, bir Alzheimer hastalığı fare modelinde 3 beyin damarlarında değişiklikler , portal hipertansif ve sirotik fare 4, olgunlaşmamış ve yetişkin akciğerler arasındaki sıçan lenf olgunlaşma gelişim basamaklarına 5, kimyasal yaralanma için yanıt sıçan karaciğer, pankreas, böbrek ve hemen mikrovasküler değişiklikler portal ven anormallikleri6.
Burada portal ven ve intrahepatik safra odaklanıyor, bir fare vasküler veya duktal ağının bir 3 boyutlu reçine döküm üreten bir yöntem sunmaktır. Bu yayınları doku temizleyerek veya macerating ile görülmesi ve daha sonra analiz edilebilir. Bu teknik hemen her vasküler veya duktal sistemin uygulanabilir ve 3 boyutlu duktal veya vasküler yapısının gelişimi, fonksiyonu, bakım, ya da yaralanma sorguladıktan herhangi bir çalışmaya doğrudan uygulanabilir olacaktır.
Protokol
1. Kanül hazırlayın
- Parmak uçlarınızla PE10 boru, 1 inç uzunluğunda bölüm Isınma ve tüp ince olur böylece germek.
Not: kanül için gemi veya kanalının boyutu gerekli germe derecesini belirlemektedir. Kanül koledok atmalarını için iyi gerilmiş olması gerekir ama sadece orta büyük portal ven sığacak şekilde uzatılır gerekebilir. - Eğimli bir uç oluşturmak için bir çapraz de uzatılmış tüp kesin.
- 5-6 inç segment yaratmak için Tüpün diğer kenarını kesin.
- Boru olmayan eğimli kenar içine ½ inç derialtı iğne 32 göstergesi takın.
2. PBS ile Şırınga hazırlayın
- PBS ile 3 ml şırınga doldurun.
- Ekli ile derialtı iğne üzerine şırınga vidalayın PE10 boru önceden hazırlanmış çekti.
- Bu PBS sağlamak için Flick şırınga ve şırınga itme pistonu iğne ve tüp ve doldurduşırınga içinde hava kabarcıkları vardır.
- Kil modelleme üzerinden şekillenen bir şırınga tutucu içine PBS ile hazırlanmış şırınga yerleştirin. Boru, kanal içine yerleştirilir iken bu tutucu şırınga sabit tutacak.
3. Diğer Set-up
- Küçük bir kap, örneğin, bir 24 oyuklu plaka arasında iyi bir katalizör 0.1 g tartılır.
- 3 ml şırınga içine 1 ml reçine çekin.
Not: katalizör ve reçine nispi miktarları sertleşme süresi değiştirmek için ayarlanabilir. Katalizör mayıs miktarını azaltmak, ancak, çekme döküm ve daha az arzu döküm yol artar.
Not: reçine tutarken, reçine duman reçine veya inhalasyon ile temas önlemek için gerekli tedbirleri almak. Her zaman eldiven giymek ve böyle bir kimyasal davlumbaz gibi iyi havalandırılan bir alanda reçine içeren adımları gerçekleştirin - Bir bağ olarak kullanılmak üzere yaklaşık olarak 5 inç 5.0 ipek dikiş bir parça keser.
4. Fare hazırlayın
- Yetişkin fare Kurban. Sırtında fare yatırın ve karın boşluğunun açılması.
- Kapsamı platformu diseksiyon fare yatırın. Karaciğer görünürlük ve erişilebilirliği arttırmak için fare altında dik bir 15 ml konik tüp yerleştirin.
- PBS ile bir pamuklu çubukla ıslatın ve yukarı doğru ve sizden uzağa ekstrahepatik portal ven veya koledok ile birlikte karaciğerin dorsal görünümü ortaya çıkarmak için karaciğer çevirmek için kullanabilirsiniz.
- Portal ven atmalarını için, oda sıcaklığında PBS ile ven kızarma kanın pıhtılaşmasını önleyebilir. PBS ile dolu bir 3 ml şırınga bir iğne takınız ve kadarıyla yapabilirsiniz gibi karaciğer ekstrahepatik portal ven içine iğne takın. Yavaşça portal ven içine aracılığıyla PBS itin. Kan akıtmak için ortak kardinal ven bir nick olun. Kan drenaj artırılması, masaj karaciğer için ıslak bir pamuklu çubuk kullanın. Bu adım, safra kanalı için tavsiye edilmez ve tüm vasküler sistemler için gerekli olmayabilir.
Not: Bu adım aynı zamanda perfo olabiliryerine PBS% 4 paraformaldehid rmed. % 4 paraformaldehid kullanımı, özellikle daha küçük vasküler yapı, daha kesin bir döküm damar bütünlüğünün ve sonuç artırabilir.
5. Ekstrahepatik Portal ven veya Koledok kanüle
- Karaciğer yaklaşık ¼ inç, portal ven veya safra kanalı altında cerrahi sütür geçmesine kavisli bir forseps kullanın.
- Gevşek bir ortak düğüm haline dikiş bağla. Düğüm SIKMAYIN.
- Eğer açık uçlu bir sistem ile çalışıyorsanız, bu sistemin diğer ucunda bir bağ bağlayıp sıkın yardımcı olabilir. Eğer portal ven kanı boşaltmak için ortak kardinal ven açtıysanız, portal ven içindeki basıncı artırır ve santral hepatik vene reçine sızmasını önlemek için etrafında bir bağ kravat.
- Yaklaşık ¼ inç dikiş düğüm aşağıdaki portal ven ya da safra kanalı küçük bir kesi yapmak için makas makas kullanın. Bu cut yarıya portal ven ya da koledok çapı sayesinde daha fazla nüfuz etmelidir.
- # 5 forseps kullanarak, kesme site portal ven ya da safra yolları tutun ve safra kanalı içine Hortumun ucunu eğimli.
- Öncesi gibi duran ligatür geçmiş ve karaciğer doğru hortumun ucu itin.
- Kanül aracılığı ile PBS enjekte ederek ve portal ven ya da safra kanalı girerse görmek için izliyor tarafından kanülasyon doğruluğunu test edin.
- Yerinde tutmak için kanül bağ sıkıştırın.
6. Reçine Portal Ven veya intrahepatik safra Cast
- Önceden ölçülmüş 0,1 g katalizör öncesi ölçülen 1 ml reçine ekleyin ve iyice karıştırın. Hava kabarcıkları oluşmasını önleyin.
- 3 ml şırınga içine geri reçine katalizör karışımı çizin. Yavaşça şırınga Flicking ve kabarcıklar kovma tarafından herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın.
Not: küçük yapılar döküm için, bu inci çok küçük hava kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum odasında kullanmak faydalı olabilirE reçine ve döküm kalitesini artırmak. Bu adımı gerçekleştirmek için zaman izin vermek için, bu reçine kür yavaşlatmak için yukarıda önerilen bundan katalizör / reçine oranı azaltmak için gerekli olacaktır. - Dikkatle kanül bağlı 32 gauge iğne bırakarak, reçine içeren şırınga ile PBS içeren şırınga değiştirin.
- Direnci artar ve karaciğer dolana kadar yavaşça ve nazikçe portal ven ya da safra yolları içine reçine itin.
- Hafifçe karaciğer masaj ve hatta dolgu teşvik ıslak pamuklu bir bez kullanın.
- Yapısından kanülü çıkarın ve hızlı reçine sızmasını önlemek için bağ yeniden sıkın.
- Reçine tedavileri, daha sonra karaciğer kaldırmak iken farenin 20 dakika için oda sıcaklığında düz bırakmaya izin verir.
- Ya karaciğer temizledikten ya macerating ile devam edin.
7. In situ Görselleştirme için Clear Karaciğer
- 4 ° C, sallanan bir gece boyunca% 4 paraformaldehit içinde karaciğer düzeltildi.
- Karaciğer yıkayınen az dört saat, sallanan için PBS içinde. İsterseniz bu noktada, karaciğer lobları ayrışabilir.
- Oda sıcaklığında sallanan, en azından dört saat her biri için en az% 50 metanol ve daha sonra da% 100 metanol içinde kurutmak.
- En az 24 saat, sallanan için benzil alkol ve benzil benzoat (Babb) ve 1:2 çözelti içinde karaciğer temizleyin. Daha uzun yıkama kez gerekli olabilir. Karaciğer tamamen 2-3 gün sonra belli değilse, geri 24 saat süreyle% 100 metanol taşımak ve Babb takas tekrarlayın.
- In situ görüntüleme için bir cam Petri kabındaki Babb batığın karaciğer.
8. Karaciğer Doku ıslatarak yumuşatmak
- Fare karaciğer çıkarın ve 50 ml konik tüp su ile konur. Tam reçine kür için 1 saat bekleyin. Eğer ayrı karaciğer lobları istenen.
- Kapalı su dökün ve bir cam şişe karaciğer taşıyın. % 15 KOH kaba daldırın. Gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. Sallamayın.
- Dikkatlice KOH kapalı dökün ve distile su dökme yıkayın. Not: döküm ver olduğuy kırılgan ve son derece dikkatli ele alınmalıdır. Tüpünden sıvı ekleyerek veya çıkartırken döküm kesintiye kaçının.
- Reçine döküm temiz olduğunda, yavaşça kurulayın bir Kimwipe üzerinde yatıyordu, sonra depolanmak üzere bir kaba aktarınız.
9. Temsilcisi Sonuçlar
Portal ven ve safra kanalının başarılı bir döküm hilusu gelen karaciğer perifere uzanan giderek küçük şube sürekli ağ gösterecektir.
Şekil 1 bir portal ven Babb takas. Şekil 1A tüm karaciğer sol lob döküm ve döküm şeklini ve boyutunu gösterir sonra da in situ görüntülenmiştir olarak döküm. Şekil 1B aynı döküm bir yakın görünümünü gösterir gösteren göstermektedir Karaciğer periferinde küçük portal ven dalları içine reçine penetrasyonu.
Şekil 2 KOH ma geçirmiş olan bir portal ven dökme gösterirceration. Şekil 2A tüm sol karaciğer lob ve Şekil 2B küçük periferik dallarının kadar yakın olduğunu gösterir.
Bu teknik aynı zamanda başarılı bir intrahepatik safra uygulanan ve Babb takas ve KOH maserasyon teknikleri 1,2,7 kullanarak hem yayımlanmıştır.
Genel sorunlar dolgular eksik içerir, çevreleyen sistemleri ya da doku içine reçine, ve taşma halinde kabarcıklar. Şekil 3 için portal damar arasından, tamamlanmamış bir dolgu (Şekil 3A), kabarcıklar (Şekil 3A), ve reçine bir taşma tanımak için gösterilmiştir santral ven (Şekil 3B).
Tüm resimler Leica MZ 16 FA stereoskop kullanarak ve RETIGA 4000R kamera QImaging alınır.
Şekil 1Hepatik. Babb-temizlenmiş reçine döküm lob portal ven bıraktı. A. Reçine döküm hilusu dan karaciğer çevresine kadar uzanan bir dallanma hiyerarşik yapısını göstermektedir. Reçine döküm mavi renkli karaciğer lob içinde sarı renkte görünür. B. kadar yakın reçine dolgu karaciğer periferinde küçük dallar uzanır göstermektedir. Reçine temizlenir karaciğer yoluyla beyazımsı. Ölçek bar = 1 mm.
Şekil 2. Hepatik doku-macerated reçine döküm lob portal ven bıraktı. Bütün karaciğerin ise dökme A. Reçine büyüklü küçüklü birçok dalları gösterir. B. Close-up karaciğer periferinde küçük dalları gösterir. Küçük şube görünümünü Feathering sinüzoidal boşluk doldurma reçine temsil ve veya reçine görünür olmayabilir atmalarını ve eğer varsa görünür şube yoğunluğu artacaktır. Reçine beyaz renklidir. Ölçek bar = 1 mm.
Şekil 3. Reçine atmalarını ile ortak sorunlar. A. sol lob portal ven Tamamlanmamış bir dolgu karaciğer çevre genişletmek için başarısız bazı veya tüm döküm dalları ile belirgindir. Bu döküm, aynı zamanda sürekli döküm (ok) molaları gibi görünür, kabarcıklar görüntüler. Bazı yerlerde portal ven ve santral ven dallarının yakınlığı nedeniyle B., portal ven reçine genellikle girin ve santral ven dolduracaktır. Iki ayrı hiler dalları (oklar) ve farklı desen ve örtüşme sahip iki dallanma yapıları olduğunda bu kabul edilebilir. Teknik hatalar ve gerçek morfolojik değişiklikler arasında ayrım iki şekilde yapılabilir. İlk olarak, döküm yapı 2-boyutlu analiz ya da diğer metotlara göre beklenen yapı ile karşılaştırılması gerekmektedir. İkincisi, birkaç çoğaltır gerçekleştirmek için önemlidir ve mümkün olduğunda, struct ölçmekure ve uyarlık belirlemek için istatistiksel analizler gerçekleştirmek ve arasında ve farklı deney ve kontrol kolları içinde istatistiksel olarak anlamlı bir morfolojik değişiklik varsa.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz, portal damar ve karaciğer intrahepatik safra kanalı sistemlerinde döküm nasıl için belirli örnekler tarif, ancak bu teknik hafif adaptasyonlar ile hemen hemen herhangi bir başka duktal ya da damar sistemine uygulanabilir. Önceki iş 10,11 yavrusu fare 1,2,7-9 dahil çoklu türler, tavşan 12,13, köpek 14, ve domuz 15, ve burun bezi 14 dahil olmak üzere birçok organ, bu tekniğin fizibilite göstermiştir Kalp 16, mesane 12,13 ve karaci...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma tjw Moleküler Tıp HHMI / Vanderbilt Üniversitesi Sertifika Programı aracılığıyla Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) (GRDOT56006779), gelen SSH Sağlık (NIH) National Institutes hibe (R01-DK078640) tarafından desteklenmiştir Vanderbilt Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi (P30-DK020593) ve Vanderbilt Sindirim Hastalıkları Araştırma Merkezi (P30-DK058404) Çekirdek Hizmetleri sağlamak.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| PE10 polietilen boru | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 cerrahi siyah örgülü ipek | Roboz Cerrahi | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm iğne | Hava-tite | TSK3213 | |
| Bahar makas | Güzel Bilim Araçları | 15000-08 | |
| Sayı 5 forseps | Güzel Bilim Araçları | 91150-20 | |
| Mercox II kiti | Ladd Araştırma | 21247 | |
| Benzil alkol | Fisher Scientific | 1816-1804 | Only Babb temizleme için gerekli |
| Benzil benzoat | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Sadece Babb temizleme için gerekli |
| Fosfat tamponlu tuz (PBS) | |||
| Modelleme kil | |||
| Ölçek | |||
| Laboratuvar makası | |||
| 15 ml kap polipropilen tüpler | |||
| % 4 paraformaldahyde | |||
| % 15 potasyum hidroksit (KOH) | Sadece maserasyon için gereken | ||
| Jilet | |||
| % 100 metanol | |||
| 3 ml luer lock şırınga |
Kaynaklar
- Sparks, E. E., Perrien, D. S., Huppert, K. A., Peterson, T. E., Huppert, S. S. Defects in hepatic Notch signaling result in disruption of the communicating intrahepatic bile duct network in mice. Dis. Model Mech. 4, 359-367 (2011).
- Vanderpool, C. Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo. Hepatology. 55, 233-243 (2012).
- Meyer, E. P., Ulmann-Schuler, A., Staufenbiel, M., Krucker, T. Altered morphology and 3D architecture of brain vasculature in a mouse model for Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 3587-3592 (2008).
- Van Steenkiste, C. Vascular corrosion casting: analyzing wall shear stress in the portal vein and vascular abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic rodents. Lab Invest. 90, 1558-1572 (2010).
- Dickie, R., Cormack, M., Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Tsuda, A. Deep pulmonary lymphatics in immature lungs. Journal of Applied Physiology. 107, 859-863 (2009).
- Kelly, D. M., McEntee, G. P., McGeenery, K. F., Fitzpatrick, J. M. Microvasculature of the pancreas, liver, and kidney in cerulein-induced pancreatitis. Archives of Surgery. 128, 293-295 (1993).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Carlson, T. R. Endothelial expression of constitutively active Notch4 elicits reversible arteriovenous malformations in adult mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9884-9889 (2005).
- Hemmeryckx, B., Emmerechts, J., Bovill, E. G., Hoylaerts, M. F., Lijnen, H. R. Effect of ageing on the murine venous circulation. Histochem. Cell Biol. , (2012).
- Hossler, F. E., Olson, K. R. Microvasculature of the nasal salt gland of the duckling, Anas platyrhynchos: quantitative responses to osmotic adaptation and deadaptation studied with vascular corrosion casting. J. Exp. Zool. 254, 237-247 (1990).
- Hossler, F. E., West, R. F. Venous valve anatomy and morphometry: studies on the duckling using vascular corrosion casting. Am. J. Anat. 181, 425-432 (1988).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Structure and blood supply of intrinsic lymph nodes in the wall of the rabbit urinary bladder--studies with light microscopy, electron microscopy, and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 477-484 (1998).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Evidence for a unique elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit urinary bladder--studies of the microvasculature with microscopy and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 472-476 (1998).
- Hossler, F. E., Kao, R. L. Microvasculature of the urinary bladder of the dog: a study using vascular corrosion casting. Microsc. Microanal. 13, 220-227 (2007).
- Wischgoll, T., Choy, J. S., Kassab, G. S. Extraction of morphometry and branching angles of porcine coronary arterial tree from CT images. Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1949-H1955 (2009).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E., Douglas, L. E. Anatomy and morphometry of myocardial capillaries studied with vascular corrosion casting and scanning electron microscopy: a method for rat heart. Scan Electron Microsc. , 1469-1475 (1986).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E. Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods. Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).
- Mondy, W. L. Micro-CT of corrosion casts for use in the computer-aided design of microvasculature. Tissue Eng. Part C Methods. 15, 729-738 (2009).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction. The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation. The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
