Yöntem makalesi

Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

11.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4276

⸱

18 Aralık 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Saint Louis University

Bu makalede

Özet

Herpetik kornea hastalığı çalışmaların çoğu birincil enfeksiyon modeli kullanın. Ancak, HSV-1 ile birincil infeksiyon genellikle insan hastalığına yol açmaz. Burada daha yakından insan hastalığı taklit herpetik kornea hastalığı, tekrarlayan modeli açıklamak.

Özet

Herpetik göz hastalığı, adlandırdığı herpetik stromal keratit (HSK), korneanın bir potansiyel olarak kör edici enfeksiyonu olduğunu tedavisi için 300.000 'den fazla klinik ziyaretleri her yıl sonuçları. Klinik hastalığı olanlarda 1 ila 2 oranında enfekte kornea görme kaybı yaşayacaksınız. Bu olguların büyük çoğunluğu herpes latent enfeksiyonun reaktivasyonu sonucu akut hastalık nedeniyle değil ben virüsü yazın ve simpleks. İlginç bir şekilde, akut enfeksiyon, genellikle bu hastalık incelemek için kullanılan bir modeldir. Ancak, HSK tekrarlayan modeli klinik hastalık sırasında ortaya ne daha yansıtıcı olacağını hissettim. HSK için tekrarlayan hayvan modellerinde tavşan ve fareler hem istihdam var. Tavşanların avantajı, ikinci gecikme reaktivasyon, bilinen herhangi bir uyarıcı yokluğunun ortaya çıkmasıdır. O tavşan modelinde immün yok çünkü birçok immünolojik faktörler tekrarlayan HSK oynadığı rol keşfetmek için zor olduğunu söylediFarenin sahip olduğu fizyolojik ve genetik kaynaklar. Reaktivasyonu UV-B ışığa maruz kalma ile tetiklenen çünkü biz orada pek çok kaynak mevcuttur olmanın avantajına sahiptir ve aynı zamanda reaktivasyonu ne zaman ortaya çıkacağını biliyoruz çünkü tekrarlayan HSK için fare modeli kullanmayı seçti. Bugüne kadar, bu model bu hastalık için önemli olan çeşitli immünolojik faktörlerin belirlenmesi amacıyla kullananlar laboratuarlar sağladı. Bu da bize tedavi ve aşı etkinliği hem sınamak için izin verdi.

Protokol

Hayvan Bakımı Not: anti-enflamatuar ve böylece örnek kılacak şekilde Analjezikler Bu modelde kullanılan değildir.

1. Virüs hazırlanması

  1. 3-4 gün için enfeksiyon, 0.01 çokluğu bir başlangıç ​​dilüsyonu (T-150 şişesi içinde, yaklaşık 5 x 10 5 plak oluşturan birim) kullanılarak Vero hücreleri (% 80 confluent) üzerinde, HSV-1 büyümek bütün hücre kadar yuvarlanır-up ve kolay bir şişeye isabet dışarı çıkarılması edilir.
  2. 4 steril santrifüj tüplerine ve Sorvall Legend RT santrifüj ortamı çıkarın ° C ve 15 dakika için 3.500 rpm. Ortam toplam 5 ml her biri 50 ml tüp supernatant (1.3) tekrar süspansiyon büyük pelet çıkarıldıktan sonra. İki 30 sn patlamaları 1 dakika sonikasyon.
  3. 4, bir Beckman ° C J2-21 santrifüjü, 1 saat boyunca, süpernatan ve 9000 rpm'de 50 ml steril Oak Ridge, tüpler ve santrifüj içine koymak çıkarın. Bu küçük bir viral pelet üretmektir. Süpernatantı atın.
  4. 1.2 zekâ gelen sonikasyon birleştirinh 1.3 pelet ve 45 saniye için tekrar sonikasyon. 4, 5 dakika için 1500 rpm'de Sorvall RT Legend, Santrifüj ° C. Süpernatant kaydedin. Bu, -70 bölünüp depolanan virüs stoku ° C. teşkil
  5. Vero hücreleri üzerinde titresi virüs. Üzerinden 10 -8 seyreltme (her 10 kat seyreltme olmak üzere) 2 ayrı seyreltme kümelerinden 2x Ben genelde plakalı 10 0. Virüs titrasyonu, 12-kuyu steril plakalar üzerinde gerçekleştirilir.

2. Fare Enfeksiyon

  1. Anestetik cocktail/20 g fare vücut ağırlığı için 0.1 ml ile her bir fare enjekte edilir (Ketamin, 60 mg / kg + Xylazine 5 mg / HBSS içinde seyreltilmiş kg). Bunu uygun dozlarda kullanılan ve bu ilacın etkileri çok kısa ömürlü vardır anestezinin en güvenli araçlardan biridir çünkü bu kokteyli kullanılır.
  2. Fareler anestezi olduğunda kornea delikli olmadığından emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak bir 30 gauge iğne ile sağ gözün kornea çizmeyin.
  3. Her fare receBirincil enfeksiyonu esnasında hasara karşı korneanın korunması için, toplanmış insan serumu (1:800 arasında en az% 50 viral nötralizasyon için etkili bir doz ile anti-HSV tepkime Sigma, Temecula, California) 1 ml arasında bir intraperitoneal IVED.
  4. Kulak klipleri ile veya kulak yumruk sayısı fareler.
  5. Tüm fareler sayılı edildikten sonra, bir 20 ul pipet kullanılarak, 10 6 PFU (5 ul) ile her bir göz enfekte. Biz sadece bir göz ve genellikle sağ göz bulaştırmak. Biz de onlar anestezi iken nemli tutmak için diğer gözlerine HBSS 5 ul yerleştirin. 5 ul prosedürler az 10 dakika içinde gerçekleştirilir ve hayvanlara göre anestetik ile dozlanan çünkü gözlerin hidrasyon korumak için yeterlidir. Enfeksiyon Vero medya 1 ml sulu bir steril pamuk aplikatör ile farelerde 3 gün sonrası enfeksiyon sürüntü ile doğrulanır. Sonra, 100 ul 48 oyuklu plakalar içinde yetiştirilen Vero hücrelerine ilave edilir. Bu plakalar sitopatik etkilerini günlük izliyor (CPE).

3. Gecikme gelen Mice reaktivasyonu

  1. Fare primer enfeksiyonu takiben en az 5 hafta anestezi uygulanmıştır. Biz bir yıl aşağıdaki birincil enfeksiyona fareler kadar yeniden ve yanıt olarak anlamlı farklılıklar gözlenmiştir bulunmadığına dikkat edilmelidir.
  2. Bir kez anestezi sadece tek bir göz UV-B ışık maruz kaldığı bu gibi 302 nm bir dalga boyunda bir tepe UV-B yayar TM20 Chromato-Vu transilluminator, yerleştirilir. Her bir fare 250 UV-B ışık mJ cm 2 maruz kalmaktadır.
  3. Aktifleştirdiğinizde ilk 1-7 sonrası UV-B ışınlaması gün sonra 0. günde Vero medya 1 ml yerleştirilir (kendiliğinden shedders kontrol etmek için UV-B maruz kalmadan önce) ve bir steril pamuklu aplikatör ile gözler swabbing ile tespit edilir. 2.5 de tarif edildiği gibi bez malzeme) değerlendirilir. Bulaşıcı virüsün sahip olan çubuklar için, virüs miktarı 12 oyuklu plakalar kullanılarak, standart bir plak deneyi ile tittered edilir.
ove_title "> 4. Klinik Değerlendirme

  1. Fare bir binoküler mikroskop kullanarak maskeli bir gözlemci tarafından klinik göz hastalığı için değerlendirilir.
  2. Korneal matlık 0 net stromada belirten 0 4 bir ölçekte, puan, 1 hafif stromal opasite gösteren, 2 ayırt iris özellikleri ile orta opaklık gösterir, 3 gösteren öğrenci marjları ve 4 hariç tanımlanan iris ayrıntı kaybı ile yoğun opaklık gösterir posterior manzaralı toplam opaklık.
  3. Neovaskülarizasyonunda 4 eşit parçaya bölünür kornea bölünmesi ve bu kadranın her birinde vaskülarizasyonu ölçüde belirleyerek 1 ila 8 arasında bir ölçekte derecelendirilmiştir.
  4. Blefarit şöyle ölçülür: 0, hiçbir lezyonlar; 1, minimal kapak şişme; 2, orta derecede şişkinlik ve huysuz çapaklanma, 3, şiddetli şişlik, orta perioküler saç dökülmesi ve cilt lezyonları ve 4, gözler kabuklu kapalı şiddetli şişlik, Şiddetli perioküler saç dökülmesi ve cilt lezyonları.
  5. Ensefalit inclu Kanıtded, geri karıştırdı saç ve belirgin nörolojik anormallikler hunched. Onlar ensefalit önemli belirtileri görüntülediğinizde Fare ötenazi vardır.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen tekrarlayan model birinci Shimeld, et al tarafından yayınlanmıştır. 1-3. Onlar test ve laboratuvar yıl 4-15 boyunca birçok el yazmaları yayımlamak için bu modelin değiştirilmiş bir sürümü kullanıyor. Modeli rolü tanımlamak için kullanılmış olduğunu yineleyen HSV-1 hastalığı 10 sitokin interferon-γ çalış. Şekil 3'te gösterildiği gibi, daha IFNγ kötü gösterilir kornea hastalığı eksik fareler vahşi-tip fareler 14 mi. Aynı zamanda birçok farklı aşı 6,10,11 oluşturur ve tedavi değeri tanımlamak için başarıyla kullanılmıştır. Bir olguda test aşı profilaktik iyi çalıştı ama 6 terapötik açıdan etkili olduğu ispat etmedi unutmayın. Bununla birlikte,Bir çoğaltma-beceriksiz viral aşı test edildiğinde, bu profilaktik olarak sadece etkili değil, ama terapötik zamanda 10,11 çok etkili oldu, referans 10 Şekil 5'e bakınız. Daha yakın bir zamanda cinsiyet farklılıkları tekrarlayan HSK geçiren farelerde tespit edilebilmesine edildi olmadığını belirlemek için bu modeli kullanmışlardır. Şekil 1 görüldüğü gibi, erkek C57BL / 6 fareler dişi C57BL / 6 fareler mutlaka önemli ölçüde daha az korneal opasite gösterilecek. Aynı şekilde, korneal neovaskülarizasyon değerlendirildiğinde, erkek farelerin dişi farelerde (Şekil 2) yaptım daha korneada daha az yeni damar büyüme göstermiştir. Şu anda bu fenotipin farelerin diğer suşları benzer analizler yaparak belirli gerginlik olup olmadığı test edilir. Ayrıca, fark testosteron eksikliği ya da östrojen varlığı yüzünden olup olmadığını belirler.

figure-protocol-1
Şekil 1. UV-B ile indüklenen reaktivasyon aşağıdaki erkek ve dişi C57BL / 6 fare suşu içinde kornea hastalığı. Latent enfekte farelerde UV-B radyasyon ve fareler 35 gün boyunca korneal opasite için izlenmiştir ile etkinleştirmek için oluşturuldu. Aşağıdaki gibi bu çalışmalar için kullanılan fareler numaraları vardı: erkek, n = 15; kadın, n = 15. Sonuçlar ortalama ± SEM göstermektedir. * Anlamlı olarak daha fazla virüs kaynaklı hastalık 14-35 gün (P = 0,001 ila 0,01) için dişi C57BL / 6 fareleri içinde yapıldı.

figure-protocol-2
Şekil 2. UV-B ile indüklenen reaktivasyon aşağıdaki erkek ve dişi C57BL / 6 fare suşu içinde kornea hastalığı. Latent enfekte farelerde UV-B radyasyon ve fareler 35 gün boyunca korneal neovaskülarizasyon için izlenmiştir ile etkinleştirmek için oluşturuldu. Erkeklerde, n: bu çalışmalar için kullanılan farelerin sayısı aşağıdaki gibidir= 15; kadın, n = 15. Sonuçlar ortalama ± SEM göstermektedir. * Anlamlı olarak daha fazla virüs kaynaklı hastalık 14-28 gün (P = 0,001 ila 0,01) için dişi C57BL / 6 fareleri içinde yapıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Herpetik stromal keratit tekrarlayan modeli (HSK) burada açıklanan araştırmacı insan hastalık sırasında gözlenen edildiği şey ile daha tutarlı bir model insan HSK çalışma sağlar. Böylece, model güçlü hastalığı primer hastalık sırasında uyarılan tarafından zaten bir bağışıklık sistemi bağlamında oluşur vardır. Bu fareler zaten HSV-1 için bir immün yanıt olduğu için, bu bağışıklık yanıtını yeniden faktörler başlangıçta oluşturulan bu olanlardan büyük olasılıkla farklıdır. Bu nedenle, birincil HSK önlemek için tedavi müdah...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Yazarlar bize modeli öğretmek yardımcı olmak için Dr Jay Pepose teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Hibeler EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) ve Göz Hastalıkları Anabilim Körlük Engellenir Araştırma sınırsız ödenekle Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMSigmaD5796
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS11150
İnsan SerumuSigmaS7023
L-GlutaminCellgro25-005-C1
Pen/ StrepSigmaP4333
FungizoneInvitrogen15290018
SantrifüjSorvallLegend RT
SantrifüjBeckman52-21
TransillüminatörUVP95-0452-02
SonikatörBransonSonifier 450
Oak Ridge TüpleriNalgeneZ 720410
Flasklar- 7150Corning430823
Plakalar- 12 kuyucukluCorningCLS 3513
Plakalar- 48 kuyucukluCorningCLS 3548
Steril Konik Tüpler- 30 mlCorningCLS 430828
Steril Pamuk Uçlu UygulayıcılarFisher23-400-125
30G İğnelerBecton-Dickinson305106
25G İğnelerBD305122
10 ml ŞırıngaBD309602
10 ml ŞırıngaBD309604

Kaynaklar

  1. Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
  2. Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice. J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).
  3. Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system. J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).
  4. Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).
  5. Keadle, T. L., Stuart, P. M. IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis. Microbial Path. 38, 13-21 (2005).
  6. Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice. J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).
  7. Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).
  8. Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis. Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).
  9. Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. Microbial Path. 32, 255-262 (2002).
  10. Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection. J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).
  11. Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).
  12. Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection. Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).
  13. Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection. Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).
  14. Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis. Virology. 380, 46-51 (2008).
  15. Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways. J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

HSV Enfeksiyon ModeliFare ModeliUVB ReaktivasyonuKornea Opasite SkorlamasNeovask larizasyon De erlendirmesiViral At l m TespitiLatent Enfeksiyon Olu turmaPlak Olu turan BirimlerTitrasyon Plak Analizi

İlgili makaleler