In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Özet

Bir burada tarif edilmekte In vivo tekniktir. Bu yöntem basit ve deneysel parametreleri ve model sistemleri çeşitli uyacak kadar esnek.

Özet

Caenorhabdits elegans yetişkin ve embriyo aşamalarında şeffaflık yanı sıra füzyon proteinleri ^1-4 sayısız ifade genetik mutantlar ve transgenik suşların durumu kolaylaştırılır strese dayanıklılığı çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, hücre bölünmesi gibi dinamik süreçleri floresan etiketli muhabiri proteinleri kullanılarak izlenebilir. Mitoz çalışma dokunulmamış organizmalar dahil olmak üzere çok çeşitli sistemler de hızlandırılmış deneylerinin kullanılmasıyla kolaylaştırılabilir ve böylece ilk C. elegans embriyo de bu çalışma için uygundur. Yüksek güçlü bir mikroskop kurulum ile basit bir gaz akışı kullanarak stres mümkündür; Sunan burada anoksik yanıt (<2 ppm O _2% 99.999 N ₂₎ alt hücresel yapıların in vivo görüntüleme hangi bir tekniktir. Bir microincubation odasından geçen azot gazı akışı ve dönen bir disk konfokal mikroskop ile birlikte kullanılırhayvanlarda in vivo yansıması hangi kontrollü bir ortam oluşturmak için. Kullanma GFP etiketli gama tübülin ve histon, dinamikleri ve hücre bölünmesi tutuklama sırasında ve bir oksijen-yoksun ortama maruz kaldıktan sonra, önce izlenebilir. Bu tekniğin sonuçları oksijen yoksunluğu maruz embriyoların blastomer içinde yüksek çözünürlüklü, ayrıntılı video ve hücresel yapıların görüntülerdir.

Protokol

1. Örnek Hazırlanması

1. Uygun transgenik C. üretin ya da elde elegans transgenik metodolojiler kullanarak faiz veya Caenorhabditis Genetik Stok Merkezi (CGC) veya iş arkadaşından süzün. Hücre bölünmesi için belirteç olarak kromozomlar ve sentrozomlarda görselleştirmek için ^5; Bu durumda biz (pasta-1 :: GFP :: H2B pasta-1 :: TBG-1 :: GFP) suşu TH32 kullanıyorsunuz.
2. Üç yöntemden birini kullanarak senkronize bir nüfus oluşturun: 1) hipoklorit solüsyonu içinde gebe yetişkin parçalanır ve bir numaralı seribaşı tabağa gravid yetişkin almak ve onları 1-2 saat süreyle embriyolar bırakmanı kalan embriyoların ^6, 2) kullanmak, veya 3) L4 almak Yeni bir numaralı seribaşı plaka karışık bir nüfus ve hareketten larva.
3. 20 nematod büyümek ° C L1 larvaları veya 24 saat sonrası L4 dökücü gelen, kuluçkalık 72 saat yaklaşık 96 saat sürecektir gravid genç yetişkinlik, için. Utero Embriyolar (2-20 hücre) imag için optimum olan büyük blastomer ve çekirdekler içerening alt hücresel ve alt nükleer değişiklikler, sırasıyla. Bu metodoloji erken embriyo bol sayıda içerebilir genç yetişkinden oluşan bir popülasyon oluşturmak için bir araç sağlar.

2. Slayt Hazırlama ve Oksijen yetersizliği Odası Kurma

1. Yeterli büyüklükte bir kapak ile örtülen geniş bir Petri kabı veya bölme içinde nemli bir kağıt havlu koyarak hazırlanan slaytlar tutmak için nemli odasına olun.
2. Mikrodalga veya su banyosu yoluyla cam içinde karışımın ısıtılması ile deiyonize H ₂ O erimiş% 2'lik agaroz hazırlayın.
3. Temiz bir cam mikroskop lamı üzerine sıcak agaroz 1-3 damla yerleştirin. Hemen agaroz damla (lar) üstüne dik ters ikinci bir slayt yerleştirin çıkan pad ince ve hava kabarcıkları serbest olacak, biraz böylece basın.
4. Serin ve yavaş slaytlar birinde agaroz ped zedelemeden iki mikroskop slaytlar parçalara ayırmak için zaman tanıyınız. Bu agaroz ped etkileşimler için yeterli değildir ince olmasını sağlamak için önemlidirDaha sonra mikroskop odaklanma yeteneği ile yeniden. Örnek görselleştirmek becerisi de mikroskoplar arasında değişebilir kullanımda hedefi özel optik mesafe bağlıdır.
5. Küçük bir kare içine agaroz pedi şekillendirmek için temiz bir jilet kullanın. Kullanıma hazır olana kadar hazırlanan nemli odasında saklayın.
6. Dikkatle, aynı temiz jilet kullanarak, agaroz altlığın kenarına almak ve yuvarlak bir 25 mm mikro coverglass üzerine slayt aktarmanızı, ped altında hava kabarcıkları birikimi kaçınarak. Kullanmak üzere seçilen yuvarlak coverglass microincubator uygun şekilde uyuyor.
7. Bir anestetik olarak kullanım için agaroz ped üzerine anestetik (% 0.5 tricaine, M9 tamponu içinde% 0,05 Tetramisole), bir damla ekleme. Anestezik damla içine 5-10 solucanlar ve yeri seçin. Hareketi durdurma solucanlar için 1-3 dk bekleyin.
8. , Yetişkin rahim içinde embriyoların gözlemleyerek, yerine disseke embriyoların gerekçesi embriyo desicca potansiyelini en aza indirmek içintion ve embriyo üzerinde azot gazı akışına bağlı hareket.
9. Hemen gaz odasına akardı olarak dehidratasyon solucanları önlemek için solucanlar üstüne Halokarbon bir damla yağ ekleyin. Halokarbon yağ viskoz olduğu tek solucanlar üzerine yağ ve damla toplamak için almak bir solucanın bir pipet ucu veya ipucu kullanabilirsiniz.
10. Solucanlar içeren dairesel coverglass hazırlandıktan sonra, Leiden iki yarısı microincubator ayrılır perfüzyon kapalı ve coverglass sonra dikkatlice alt halkaya dik yerleştirilir. Odanın iki tarafı da birbirine sıkıca kapatılır.
11. Oda sonra esnek plastik borular vasıtasıyla nitrojen gazı tanka bağlanmış ve mikroskop aşamada (Şekil 1C) üzerinde uygun noktaya yerleştirilir. Şu anda tüp ve microincubator dikkatle tüp ve odanın yan tarafındaki bağlantı fişleri güvenli bağlanma sağlayarak herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edilmelidir. Bir al edebilirsinizbu yüzden hafif bir sızıntı varsa oluşturacak kabarcıklar, aramak için tüp üzerinde sabun ve su küçük bir miktar yayılır.

3. Oksijen yetersizliği yılında Mikroskopi

1. Alt büyütmede hayvanlar bulun, sonra, görüntü doku ya da bu gibi yetişkin embriyonik blastomerlerin veya oosit olarak ilgi hücreleri için uygun daha yüksek bir büyütmede (bu uygulama için 64x) getirin. GFP sinyali görüntülemek ve faiz hücre (ler) GFP füzyon proteini bulmak için 488 nm lazer açın.
2. Hücre döngüsü tutuklama belirli aşamasında tutuklama görselleştirmek için (örn. geç profaz) hücre bölünmesi önceki bir aşamada (örneğin geç interfaz ya da erken profaz) bir blastomer tanımlamak. Böyle sentriol konumu, kromozom kondensasyonu başlaması, kromozom konumu ve nükleer zarfın varlığı veya yokluğu gibi Hücresel belirteçler hücre döngüsü aşamada (Şekil 2A) belirlemenize yardımcı olacaktır.
3. Kamara, nitrojen gazı (% 99.999 ile perfüze edilmiştirN _2; <2 ppm O _2). Biz 6 psi arasında bir basınç kullanımı bu durumda, ancak basınç ayarlanmış ve her bir microincubator boyutu ve kullanım boru çapına bağlı olarak, optimize edilmesi gerekebilir. Azot gerekli odak düzlemi ayarlayarak, kamara doldurur gibi blastomer (ler) izlemek için devam edin.
4. Bu noktada, time-lapse görüntüleme başladı. Görüntüleme iç nükleer membran kromozomların bu durumda profaz tutuklama ve yerleştirme yılında, faiz olgusu yakalamak için gerektiği kadar için yapılır. Görüntü 30 dakika daha uzun süreyle her 10 saniyede bir alınır. Görüntü yakalama ve bu kazanç ve lazer güç gibi ayarları Frekanslar gerektiğinde ayarlanmalıdır.
5. Embriyoların anoksik ortamda yanıt hangi zaman anoksi maruz kalan hücre döngüsü evresine göre değişebilir. Genellikle anoksi indüklenen profaz tutuklama azot gazı akışı başladıktan 20-30 dakika içinde oluşur. Biz anoksi indüklenen hücre döngüsü tutuklama occu gözlemledik<20 dk içinde rring. Resimler bu süre esnasında elde edilebilir, ya da belirli görüntü daha sonra bir zaman ayarlı seri izole edilebilir. Ek bir seçenek embriyo alt hücresel yapılar görselleştirmek için video mikroskopi kullanmaktır.
6. Anoksi bağlı tutuklandı devleti kurtarma belgelemek için, gaz kapalı ve odasına bir time-lapse serisi kaydederken difüzyon ile normoksi dönmek için izin verilir. Kromozomların hücre siklus progresyonu ve undocking Sürmesine genellikle azot gazı kapatarak 5-20 dakika içinde gerçekleşir.
7. Ayrı deneylerde bir anoksi göstergesi resazurin, flow-through microchamber yerleştirildi unutmayın; bunun azot gazı akışı başladıktan sonra odasına yaklaşık 19 dakika ortalama anoksik hale belirlenmiştir.
8. Görüntüler ve videolar Imaris, Görüntü J veya Photoshop kullanarak işlenir ve görüntüleme için QuickTime alınır.

Sonuçlar

Ciddi oksijen yoksunluğu (anoksi) maruz C. elegans embriyo gelişimi ve hücre bölünmesi ⁷ dahil biyolojik süreçleri tutuklayarak hayatta edebiliyoruz. Hücre bölünmesi anoksi indüklenen tutuklama hayvanlarda in vivo yansıması hangi kontrollü bir ortam yaratmak yoluyla azot gazı akışı ve dönen bir disk konfokal mikroskop ile birlikte bir microincubation odası kullanarak, bir alt-hücresel düzeyde, izlenebilir (Şekil 1). Ilgi Hücresel yapıları çeşitli gaz ortamlara maruz kalan em...

Tartışma

Oksijen Yoksunluğu ve Asma Animasyon

Ciddi oksijen yoksunluğu maruz bazı organizmalar için ölümcül olabilir rağmen, bazı organizmalar anoksi maruz hayatta edebiliyoruz. C. halinde elegans, anoksi maruziyet sağkalım gelişim safhasına ve anoksi yanıtın bağlıdır girişi gözlemlenebilir biyolojik süreçlerin bir dizi tutuklandı edildiği askıya animasyon bir tersinir durum içine. Oksijen ortamında ^7,9 tekrar geri kadar Hücre bölünmesi, gelişme, hareket, beslenme ve üreme s...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifler / Ekipman			Kompozisyon
Hipoklorit solüsyonu			0.7 g KOH, 12 ml% 5 NaOCİ, GKD 2 0 ile 50 ml'ye getirmek
M9 tampon			3 g KH 2 PO 4, 11 gr Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 L GKD 2 O başına 1 ml (1 M) MgSO4
Cam mikroskop slaytlar	Fisher Scientific	12-550-343	3 "x1" x1.0 mm
Yuvarlak mikro coverglass	Elektron Mikroskopi Bilimleri	72223-01	25 mm Çap
Halokarbon yağı 700	Sigma	H8898-100ml
Anestetik			% 0.5 gastrikaine,% 0.05 Tetramisole
Leiden Kapalı Perfüzyon Microincubator	Harvard Apparatus	650041
UHP Azot	Calgaz (Air Liquide)		> 99,9990% N 2 <2 ppm O 2
Plastik boru	VWR	89068-468	0.062 "ID x 0.125" OD
Disk Konfokal Mikroskop Spinning	McBain Sistemleri		Zeiss optik mikroskop, Epifloresans aydınlatma sistemi, CSU-10 Yokogawa konfokal tarayıcı, Hamamatsu elektron çoğaltıcı CCD kamera ters.