Yöntem makalesi

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı C. elegans

DOI:

10.3791/4373

⸱

13 Şubat 2013

 ,  , 
1Department of Science, Borough of Manhattan Community College, City Universtiy of New York (CUNY), 2Department of Biology, Queens College, The City University of New York (CUNY), 3Biochemistry Program, The Graduate Center, Queens College, The City University of New York (CUNY)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz hedef genler ve skoru vücut büyüklüğüne fenotipi yıkmak için RNAi besleme tekniği nasıl kullanılacağını göstermektedir C. elegans. Bu yöntem, bu tür DBL-1/TGF-β sinyalleme yoluyla vücut boyutu düzenlenmesinde yer alan bu gibi muhtemel ilgi genetik bileşenler, belirlemek için büyük ölçekli bir ekran için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çift iplikli RNA-aracılı girişim (RNAi) hedef gen ekspresyonu 1-3 yıkmak için etkili bir stratejidir. Bu bitkiler, omurgasızlar ve omurgalılar dahil birçok model sistemler uygulanmıştır. Vivo 4,5 RNAi ulaşmak için çeşitli yöntemler vardır. Örneğin, hedef gen, bir RNAi vektörü haline dönüştürülmesi ve daha sonra da sürekli veya geçici olarak hücre soyları ya da gen devirme etkileri elde etmek için birincil hücrelerine transforme edilebilir veya belirli bir hedef genin (RNAi Oligolar) için çift iplikli oligonükleotidler sentezlenebilir geçici olabilir hedef genleri susturmak için hücre hatları veya primer hücre dönüştürülmüştür; veya sentezlenen çift iplikli RNA molekülleri bir organizmanın içine mikroenjeksiyon yoluyla olabilir. Nematod C. yana elegans bakterileri hedef genlerin karşı çift iplikli RNA ifade ile hayvan besleme, bir gıda kaynağı olarak bakterileri kullanan uygun bir strateji 6. sağlar. Burada bir RNAi besleme sunmakyöntem vücut büyüklüğü fenotipi puan. C. Gövde boyutu elegans öncelikle TGF-β düzenlenir - gibi bir ligand DBL-1, böylece bu tahlil TGF-β sinyal bileşenleri 7 belirlenmesi için uygundur. Biz RNAi beslenme deneyleri tekrarlamak için iki RNAi duyarlı suşlar dahil farklı suşları kullanılmıştır. Bizim sonuçlarımız rrf-3 suşu bize en iyi beklenen RNAi fenotip verdiğini gösterdi. Yöntem, uygulanması kolay bir tekrarlanabilir ve kolayca ölçülür. Ayrıca, protokol özel ekipman kullanımını en aza indirir, bu nedenle daha küçük laboratuar ya da ağırlıklı olarak lisans kurumları da uygundur.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hedef Gen Dizi Defter RNAi Besleme Tabaklar hazırlanması

  1. Piyasada bulunan RNAi kütüphanelerin (örn. Kaynak BioScience Doğal Bilimler itibaren) kullanıyorsanız, 1.4 adıma geçin. Alternatif olarak, standart klonlama protokolü tarafından, vektör L4440, 8 RNAi plazmid yaygın olarak kullanılan bir solucan içine hedef gen dizileri klonu.
  2. Bakterinin HT115 (DE3), 25 mcg / ml karbenisilin ile LB agar plaklarına kültürü onları ve 12.5 mcg / ml tetrasiklin içine rekombinant plazmid Transform, ve gelecekte kullanılmak üzere tek bir klon almak.
  3. Bununla birlikte, deneyler için bir kontrol olarak kullanmak için bakteri suşu HT115 içine boş vektör L4440 dönüşümü.
  4. 37 gece boyunca 100 ug / ml ampisilin ile 1 ml LB et suyu ° C. Kültür rekombinant ve boş hem de L4440 taşıyan bakteriler Tetrasiklin o RNAi randıman düşer olmasından dolayı eklenir.
  5. Gecede cultu içine 100 mg / ml ampisilin ile başka bir 5 ml LB suyu ekleyinre, 37 başka bir 4-6 saat süreyle inkübe ° C
  6. Tohum 0.5 ml rekombinant veya boş L4440 taşıyan RNAi solucanı plakalar üzerine bakteri kültürü. Klon adı ile tüm plakaları etiketleyin.
  7. Plakaları işaretleyin ve 37 gece inkübe ° C bakteriyel çim büyümeye; Bu hedef gen sekansı olan veya olmayan RNAi levhalar vardır. En az 2 tabak, her durum için hazırlıklı olmalıdır.

2. RNAi Besleme Tabaklar Kültür Worms

  1. Alev bir platin tel solucan pick ucu sterilize. 6-10 dördüncü dönem larvaları (L4) ya rekombinant veya boş L4440 içeren her RNAi plakasına Hermafroditler almak almak solucan kullanın; hayvanların besin kaynağı olarak bakterileri kullanır.
  2. Çift cinsiyetli 20 ° C (C. elegans için standart bir kültür koşulu) gecede büyümek edelim, onlar ertesi gün genç yetişkinler olacak.
  3. Yeni buna etiketli ve hazırlanan RNAi plaka içine 6-10 genç yetişkinler aktarın.
  4. Letyetişkinlerin 4-6 saat için yumurtalarını bıraktıkları, ardından plakası tüm yetişkinlerin kaldırmak; bu adımı döl senkronize etmektir. Anneler yok olduktan sonra, zaman saymaya başlar. Bu sefer sıfırdır.
  5. 20 plakalar inkübe ° C hayvanların belirli bir gelişim evresine büyümesine izin vermek, bu protokolde, biz fenotipik analiz için genç yetişkinler seçin. Normal bir hızda gelişir hakemin için 72 saat inkübasyon genç yetişkinler haline hayvanlar için yeterlidir. Ancak, çeşitli genlerin farklı hayvan gelişimini etkileyebilir. RNAi farklı bir hızda büyümeye hayvanlar neden olursa, genç erişkinlerde rahim içinde tamamlanmış vulval geliştirme ve 2-6 embriyolar (fertil varsa) L4 geçmiş olanlar en fazla 24 saat olarak tespit edilebilir. Diğer gelişimsel aşamaları belirlemek için, araştırmacı bir rehber olarak gonadal ve vulval gelişimi kullanmalısınız.

3. RNAi Puan Vücut büyüklüğü Fenotiplerinin Worms Tedavi

  1. Bir cam slayt üzerine renkli etiket şeritleri iki kat yerleştirin. Of Make ikise cam slaytlar. Sonra, bant ile iki slayt arasına yeni bir cam slayt yerleştirin. Su içinde% 2 agaroz Melt yeni bir cam slayt merkezine bir damla uygulanır; sonra agaroz önceden 9 açıklanan% 2 ince bir katman yapmak için üstüne ikinci bir cam slayt basın.
  2. Agaroz katılaşmış sonra, üst cam slayt kaldırmak; agaroz pad ile slayt solucanlar yüklemek için hazır. Klon adla Etiket slayt.
  3. Agaroz pad 10 ul 25 mM NaN 3 ekleyin; onları hareketsiz NaN 3 solüsyon içine 30-40 hayvanları almak, sonra üstüne lamel koymak; rekombinant ve boş hem RNAi tedavi edilen hayvanlar L4440-taşıma için tekrar.
  4. Görüntü 2.5x objektif lens kullanarak diseksiyon mikroskobu altında solucanlar; burada yazılım Qcapture destekleyen Leica dijital kamera kullanın.
  5. Kalibrasyonu için, önce standart bir mikrometre cetvel bir görüntü yakalayabilirsiniz. Sonra Image-Pro yazılımı görüntüyü açmak seçin ve "ölçü" üzerine tıklayın ve "kalibrasyon" i seçin"Mekansal kalibrasyon sihirbazı". Seçilen "aktif görüntüyü kalibre" ile "gelecek" üzerine tıklayın. Girdi kalibrasyon için isim ve mekansal referans birimleri mikrometre ayarlandığından emin olun. Sonra, "oluşturmak için bir referans kalibrasyon" düğmesini işaretleyin ve "next" butonuna tıklayınız. Tıklayın "beraberlik referans çizgisi." Bir referans ölçek çubuğu görünecektir. Mikrometre ucuna uygun ölçek çubuğu yeniden konumlandırma, daha sonra 1000 adet referans gösterdiğini göstermektedir. , "Tamam", "Next" ve "Finish" tıklayınız.
  6. Yazılım kalibre edildikten sonra, bir solucan görüntüyü açmak. Sonra, "select mekansal" tıklayın sonra "kalibrasyon" seçin, "tedbir" menüsünün altında seçin. Açılan menüden ise, mikrometre kalibrasyonu için oluşturulan dosya adını seçin. Sonra, "tedbir" menüsü altında, "ölçüm" seçeneğini seçin. Açılan pencerede, serbest çizim aracını seçin ve bilgisayar faresi (Şekil 1) ile kuyruk baş hayvan vücudunun ortasından geçen bir çizgi izlemesi. Uzunluk pencere içinde rapor edilir. ŞimdiHedef gen RNAi L4440 ve boş vektör ile tedavi edilen kontrol hayvanları ile muamele edilen hayvanların vücut süresi: iki veri gruplarına sahiptir.
  7. Microsoft Excel dosyası veya başka uygun istatistik yazılım uzunluk ölçümleri aktarın. Her numune için ortalama ve standart sapma hesaplanarak verileri analiz. Sonra Student t-testi kullanılarak örnekleri karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırmamızda, biz DBL-1/TGF-β yolu ile vücut büyüklüğü düzenleme odaklanmak. Yabani tip hayvanlarda 7,10,11 ile karşılaştırıldığında daha kısa bir gövde uzunluk dahil olmak üzere küçük vücut boyutu DBL-1 yolunun sonuçları, fonksiyon kaybı. C. için Böylece, ekranlar elegans vücut büyüklüğü mutantlar TGF-β sinyal bileşenleri ve düzenleyici belirleme yeteneğine sahiptirler. DBL-1, sinyal hücre yüzey reseptörleri ve hücre içi sinyal dönüştürücüleri Smad 12 içeren bir korunmuş bir TG...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, biz C. vücut büyüklüğü kusurlu mutantların belirlenmesi için yöntem tarif RNAi besleme ile elegans. Bu yöntem, TGF-β sinyal bileşenlerin tanımlanması için de geçerlidir. Gibi bileşenler yüksek evrim 15 yoluyla korunmuş olduğundan, bu ekranlar, tüm Metazoan'da TGF-β sinyal moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına alakalı. Böyle bir ekran tasarımında önemli bir göz başlayarak suşudur. Lin-15b ve rrf-3 önceki çalışmalar 12,13 ile tutarlı kontrolü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz çeşitli gelişimsel zaman noktalarında hayvan figürleri sağlamak için James Clark ederim. C. Bu çalışmada elegans suşları Araştırma Kaynakları için NIH Ulusal Merkezi (NCRR) tarafından desteklenen Caenorhabditis Genetik Merkezi, elde edilmiştir. Bu çalışma CUNY gelen JL ve CSD CIRG 1817 tarafından desteklenen ve NIH 1R15GM073678-01 ve CSD 1R15GM097692-01 tarafından Biz yazması üzerine yorumlar için Dr William J Rice, Dr Nathalia Holtzman ve Melissa Silvestrini ederim. Bu çalışmaları, New York Şehir Üniversitesi (S. Xiong) ve Graduate Center'da bir doktora derecesi için gereksinimleri kısmen yerine getirilmesi yürütülmüştür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RNAi solucan plakaları
17.7 g Worm Orta Mix
60 g Agar
3 litre H 2 O ekleyin. Otoklavlayınız.
3 ml 1M IPTG (steril) ve 3 ml 25 mg / ml carbenicillin (steril) ekleyin ve sonra 60 mm Petri kapları içine dökün.

Solucan plakaları
17.7 g Worm Orta Mix
0.6 g Streptomisin Sülfat
60 g Agar
3 litre H 2 O ekleyin. Otoklavlayınız. 60 mm Petri kapları içine dökün.

Worm Orta Mix
55 g Tris-Cl,
24 g Tris-OH
310 g Bacto Peptonlu
800 mg Kolesterol
200 g NaCl
İyice karıştırın ve topakları önlemek için emin olun, bu toz karışımı kullanmadan önce aylarca saklanabilir.

% 2 agaroz
0.5 g Agaroz
Iland 25 ml dH 2 O Mikrodalga Isı eriyene kadar.

1M izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)
2 g IPTG
In10 ml dH 2 O eritilir

1M NaN 3
6.5 g NaN3
100 ml dH 2 O ekleyin

25 mM NaN3
2.5 ml 1M NaN 3
100 ml dH 2 O ekleyin

Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden Caenorhabditis elegans
Plazmid L4440 (ampisilin direnç geni taşıyan)
16; Bakteri HT115 (DE3) (ayrıca tetrasiklin direnç geni taşıyan RNAse III geni (a dsRNAse) için eksik IPTG indüklenebilir T7 polimeraz içerir) zorlanma
60 mm Petri kapları
100 mm Petri kapları
14 ml'lik yuvarlak tabanlı Falcon kültür tüpleri
cam slaytlar
cam lameller
1-20 ul pipet
20-200 ul pipet
200-1000 ulpipet
1-200 ul pipet ipuçları
200-1000 ul pipet ipuçları
1.5 ml Eppendorf tüpleri
platin tel solucan almak

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
  2. Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
  3. Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
  4. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
  5. Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
  6. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
  7. Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
  8. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  9. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
  10. Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
  11. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
  12. Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
  13. Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
  15. De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
  16. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RNA InterferenceRNAi FeedingGene KnockdownTGF beta SignalingMicroscopic ImagingLength MeasurementStudent s T testWorm Strains

İlgili makaleler