RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

Summary

Bu protokol ile veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq, güçlü bir nesil DNA dizileme teknolojisi, uygulamak için tam ve ayrıntılı prosedür sunar. Bu protokol, farklı reaktifler veya hastalık durumlarında etkilenen çeşitli hücreleri veya dokulara genellenebilir olduğunu.

Abstract

MRNA seviyelerinin ölçümü yoluyla hücrelerinde gen ekspresyonu karakterizasyonu hücrenin transkripsiyonel makine harici sinyaller (örneğin uyuşturucu tedavisi), veya nasıl hücreler sağlıklı bir devlet ve bir hastalıklı durum arasındaki farklılıklar nasıl etkilendiğini belirlemede yararlı bir araçtır. Nesil DNA dizileme teknolojinin gelişi ve sürekli arıtma ile, RNA-sıralama (RNA-seq), transkript bütün türlerin kataloğa tüm ifade genlerin transkripsiyonel yapısını belirlemek ve ölçmek için transcriptome analiz giderek daha popüler bir yöntem haline gelmiştir belirli bir hücre, doku veya organizma ^1,2 transkript toplam grubu değişen ifade seviyeleri. RNA-seq kademeli olarak tam bir profil transcriptome avantajlara sahiptir çünkü, transcriptome analiz için tercih edilen bir yöntem olarak DNA mikroarrayleri yerine bir tür dijital veri (herhangi bir transkript kopya sayısı) sağlayan ve bilinen herhangi bir genomik istif güvenmek içince ^3.

Burada, biz veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq uygulamak için tam ve ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol başlıklı bizim son yayınlanan araştırmaya dayanmaktadır başarılı insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin ilk tam transcriptome analizi icra ettiği ⁴ "RNA-seq Trombin ile Tedavi İnsan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde Genlerin ve Bunların İzoformlar, Romanı transcriptome ortaya çıkarır" trombin RNA-seq kullanarak tedavi. Bu inflamatuvar koşulları, kanser, diyabet ve koroner kalp hastalığı patogenezinde trombin aracılı endotel disfonksiyonu moleküler mekanizmaları içgörüler kazanmak için daha sonraki denemeler için görülmemiş kaynaklar vermiştir ve bu hastalıklar için tedavi hedefleri için potansiyel yeni müşteriler sağlar.

Bu protokolün açıklayıcı metindört bölüme ayrılmıştır. Birinci bölüm trombin ve RNA izolasyonu, kalite ve miktar ile analiz insan akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinin tedavisi açıklanmaktadır. İkinci bölümde kütüphane oluşturma ve sıralama açıklar. Üçüncü kısım veri analizi açıklanmıştır. Dördüncü bölüm, bir RT-PCR testi doğrulama açıklanmaktadır. Birkaç kilit adımlar Temsilcisi sonuçları görüntülenir. Önemli adımlar başarı artırmak için Yararlı ipuçları veya önlem Tartışma bölümünde verilmiştir. Bu protokol trombin ile tedavi insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde kullanmasına rağmen, memeli ve non-memeli hücrelerinde hem de farklı uyaranlara veya inhibitörleri, ya da sağlıklı bir devlet arasındaki hücre veya dokularda transcriptomes karşılaştırmak ile tedavi dokularda profili transcriptomes jeneralize olabilir ve bir hastalık durumu.

Protocol

Bu protokol özetleyen bir akış şeması Şekil 1 'de gösterilir.

1. Trombin, RNA İzolasyonu, RNA Kalitesi Değerlendirme ve Ölçülmesi ile Hücre Tedavisi

1. % 5 FBS, büyüme faktörleri ve antibiyotik ile EGM-2 orta boy 6-kuyucuğu yılında% 90-100 izdiham Kültür İnsan Akciğer Mikrovasküler Endotel Hücreleri (HMVEC-LBL) (Lonza, cat # CC-3202).
2. Açlık medya (0% FBS) öncesinde trombin ile tedaviye 30 dakika ortam değiştirin.
3. 0.05 U / ml trombin ile hücrelerin tedavi ya da ° C ve% 5 _CO2 37, 6 saat süreyle, bir kontrol olarak tedavi bırakın.
4. Üreticinin talimatlarına uygun olarak A....

Results

Adım 1 için: 28s: 18s oranı geleneksel RNA bozulmanın bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. İdeal olarak, 28s tepe 18s bant (2 oranında) yaklaşık iki katı alan olmalıdır, ancak bu ideal oran genellikle uygulamada görülmemektedir. Ayrıca, 28s: spektrofotometrik yöntem ile elde edilen 18s oranları RNA bozulma miktarı göz ardı edebilir. Daha doğru bir şekilde parçalanması ve bu nedenle RNA örnek kalitesini ölçmek için, Experion sistem, bir RNA kalite göstergesi (RQI) sayısını hesaplar. RQI algoritması st.......

Discussion

Anahtar adımlar

RNA Elleçleme: RNaz, hatta en yüksek kalitede RNA düşer dolayısıyla bakım RNA ¹⁰ izolasyonu, depolanması ve kullanılması sırasında alınmalıdır. Eldiven her zaman insan elinde bulunan RNaz tarafından kirlenmesini önlemek için giyilir. Eldiven, özellikle dokunma deri, kapı kolu ya da başka ortak yüzeyleri sonra, sık sık değiştirilmesi gerekir. Pipetler bir dizi çalışma RNA sadece adanmıştır edilmeli ve tüm ipuçları ve tüpler RNaz arındırılmış olmalıdır........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifler ve Ekipmanları	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İnsan Akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinde	Lonza	CC-2815
Lonza, Bullet Takımı	Lonza	CC-3202	EGM-2, FBS, büyüme faktörleri ve antibiyotik içerir
Trombin	Sigma	T4393
Ambion mir Vana Kiti	Yaşam Teknolojileri	AM 1560
RNaz-Zap	Yaşam Teknolojileri	AM9782
Experion StdSens RNA	Bio-Rad	700-7103
TruSeq RNA HazırlıkTakımı	Illumina	FC-122-1001
AMPureXP Boncuk	Beckman Coulter	A63881
Üstsimge Ters transkriptaz II	Yaşam Teknolojileri	18064-014
Experion DNA 1K	Bio-Rad	700-7107
QuantiTect SyberGreen	Qiagen	204163
PE Küme Nesil Takımı	Illumina	PE-401-3001
Phix Kontrol Kiti	Illumina	FC110-301
200 Döngü SBS Takımı	Illumina	FC-401-3001
* HiScanSQ	Illumina	SY-103-2001
CBOT	Illumina	SY-301-2002
qPCR makinesi - Viia7	Yaşam Teknolojileri	Model # VIIA7 / Ekipman # 10631261	Veya eşdeğeri
Experion Sistemi	Bio Rad	7007001	Bioanalyzer alternatif bir sistemi
Spektrofotometre	Bio-Tek	Epoch Mikroplaka Spektrofotometre	Veya eşdeğeri
Santrıfüj - Sorvall Legend XTR	Thermo Scientific	75004521	Veya eşdeğeri
Manyetik standı	Yaşam Teknolojileri	AM10027
PCR 96-	Genel Lab Tedarikçi
			Anahtar Reaktifler ve Binbaşı E Tablo 3. Listequipment. *, Video, yerine HiScanSQ arasında HiSeq1000 gösterilmiştir.