Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Özet

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi kullanır In situ Memeli kromozom çoğaltma zamanlamasını değerlendirmek için hibridizasyon (FISH). Bu teknik aynı hücre içinde yeniden ve un-yeniden düzenlenmiş kromozomun doğrudan karşılaştırma olanağını sağlamaktadır.

Özet

Memeli DNA replikasyonu zamansal bir çoğaltma programı sonrasında, S fazında farklı zamanlarda kromozomlar boyunca birçok bölgeden başlatır. Çoğaltma zamanlaması özellikleri epigenetik değişikliklere duyarlı doku-spesifik ve gelişimsel ipuçları tarafından düzenlenen dinamik bir süreç olduğu düşünülmektedir. Ancak, nerede ve DNA replikasyonu kromozomlar boyunca başlattığında düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Homolog kromozomlar genellikle ancak bu kuralın önemli istisnalar vardır, eşzamanlı çoğaltırlar. Örneğin, dişi memeli hücrelerinde iki X kromozomu X inaktivasyonu ¹ olarak bilinen bir süreç yoluyla geç kopyalayan olur. 2-3 saat olarak tahmin çoğaltma zamanlaması, bu gecikme ile birlikte, genlerin çoğunluğu transkripsiyonel bir X kromozomu üzerinde susturdu olur. Buna ek olarak, X inaktivasyonu merkezi olarak bilinen bir ayrık cis-hareket eden odağı, th dahil olmak üzere, bu X inaktivasyonu işlem düzenlertüm inaktif X kromozomu üzerinde gecikmiş çoğaltma zamanlaması e indüksiyonu. Buna ek olarak, kanser hücreleri ve hücreler bulunan bazı kromozom tüm kromozom ^2,3 etkilemektedir> 3 saat bunun çoğaltma zamanlaması önemli bir gecikme görüntülemek iyonizan radyasyona maruz. Bizim laboratuvar son çalışmaları ayrık olduğunu bozulması cis-oyunculuk tüm kromozom ⁴ etkileyen bir çok geç kopyalayan fenotipe otozomal lokus sonucu gösterir. Ek 'kromozom mühendislik' çalışmaları tüm memeli kromozomları bireyin kromozom Uygun çoğaltma zamanlaması ⁵ kontrol ayrık cis-etkili lokus içeren düşündüren, bu anormal çoğaltma zamanlaması fenotipe birçok farklı kromozom sonucu etkileyen bazı kromozom göstermektedir.

Burada, floresan in situ hibridizasyon ile kombine kromozom çoğaltma zamanlaması kantitatif analizi için bir yöntem mevcut. Buyöntem, aynı hücre içinde Homolog kromozomlar arasındaki çoğaltma zamanlaması doğrudan bir karşılaştırma sağlar, ve ⁶ uyarlanmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem tam kromozom replikasyonu zamanlama etkileyen değişiklikler ile ilişkili kromozomal düzenlenmesinde çok kesin tanımlanması için olanak sağlar. Bu yöntem son yıllarda geliştirilen yüksek kapasiteli mikro-dizi üzerinde veya yeniden düzenlenmiş ve kromozomlar un düzenlenmeyecek üzerinde sunmaktan homolog allelleri arasındaki farkı ayırt edemez protokolleri sıralama avantajları vardır. Burada açıklanan yöntem tek hücreler değerlendirir Buna ek olarak, bu bir nüfus içinde hücrelerin sadece küçük bir bölümü içinde mevcut olan kromozom üzerinde çevrilme kromozom replikasyonu zamanlama değişiklikleri tespit eder.

Protokol

1. BrdU Ortaklığın (Terminal Etiketleme)

1. Önceki BrdU ilavesi ile 150 mm doku kültürü çanağı 24 saat içinde yaklaşık% 70 birleştiği yere Plaka hücreleri.
2. Hasattan önce uygun zaman noktalarında 20 ug / ml BrdU (Sigma) içeren tam kültür ortamı, taze ortam ile değiştirin. Zaman hücrelerin BrdU uzunluğu tipik olarak G2 fazında saat (Şekil 1) 2 ile 5 arasında sürer, hücre tipi ve türler ile değişecektir ile ortam içinde kültürlenmiştir.

2. Monolayer Hücre Kültürleri Kromozom Hasat

1. Plaka kültür ortamı çıkarın ve 15 ml konik santrifüj tüpüne 10 ml toplamak. Kalan ortamı atın.
2. 10 ml Versine [veya HBSS (Sigma)] ile bir kez yıkayın hücrelerini.
3. Plakasına Versine (ya da HBSS) içinde 5 ml% 0.25 tripsin ekleyin. Hücreler plaka ayrılmış kadar oda sıcaklığında inkübe edin.
4. Adım 2.1, ortam 10 ml'lik tüp tripsinize hücre süspansiyonu ekleyin.
5. Pelet hücreler 10 dakika için 400 x g'da santrifüj yapılır. 0.5 ml ortam artı hücre peleti bırakarak, süpernatan aspire.
6. Pasteur pipeti ile pipetleme tarafından iyice hücreler süspanse edin.
7. Hipotonik çözelti 3 damla ekleme (0.075 M KCl (Sigma), 37 ° C'a ısıtılmış); bir Pasteur pipeti ile hücre süspansiyonu ilave edilir. 0.5 ml hipotonik solüsyonu eklenir ve bir Pasteur pipeti ile tekrar karıştırın. 5 ml hipotonik çözeltinin hacmi getirin ve tekrar karıştırın. Hücre tipine bağlı olarak 20-45 dakika, 37 ° C'de inkübe edin.
8. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. 0.5 ml ortam artı hücre peleti bırakarak, süpernatan aspire.
9. Tüpü yavaşça getirerek hücre pelet yeniden süspanse edin. Ozmotik şişmiş hücreleri bu noktada kırılgan olacak, bu nedenle bakım sitoplazmik membran bozmayacak şekilde alınmalıdır.
10. Hafifçe Pasteur pipett ile pipetleme karışımı;: Carnoy en fiksatif (Metanol 01:03 Buzul Asetik Asit) 3 damla ekleyine. Yavaşça Pasteur pipeti ile pipetleme 0.5 ml fiksatif ekleyin ve karıştırın. Sabitleştirici hacmi 5 ml getirin ve yavaşça Pasteur pipeti ile pipetleme tarafından tekrar karıştırınız. Sabit hücreleri birkaç ay boyunca -20 ° C'de karanlıkta saklanabilir.
11. Santrifüj ve adım 2.8 olarak aspire.
12. Taze fiksatif içinde hücre pelletini tekrar; pelet ve eklenti ~ 10x Carnoy en fiksatif hacminin hacminin hesaplanabilmesi.
13. Hücre süspansiyonu ıslak, buz mikroskop lamı üzerine açılan akıllıca ekleyin; bir ~ 45 ° açıyla tutun ve slayt slayt yüzeyi üzerinde akmaya hücre süspansiyonu sağlar. Kağıt havlu üzerinde düz kaydırak ve sel fiksatif ile slayt Lay ve kurumaya bırakın. Ters bir mikroskop kullanılarak mitotik yayılır varlığı için slaytlar edin.

3. RNase Tedavisi ve Etanol Dehidrasyon

1. 10 mikrogram / ​​her slayt için 2x SSC ml RNaz A (Sigma) Yeri 200 ul; 37 & de inkübeg; C, 1 saat boyunca.
2. Yıkama 2x SSC, 3 dakika her biri için, oda sıcaklığında, pH 7.0 ile 3 kez kayar.
3. 3 dakika her biri için ve oda sıcaklığında bir EtOH (Sigma) serisi (% 70,% 90 ve% 100) slaytlar kurutmak.
4. Hava oda sıcaklığında slaytları kurulayın.

4. In situ Hibridizasyon BAC Artı Kromozom-spesifik Sentromer Numaralama Sondası (CEP) veya Tüm Kromozom Boyalar için prob Kokteyller hazırlanması

1. BAC / CEP eşzamanlı hibridizasyon için, ön-hibridizasyon için iki ayrı probu kokteyller hazırlamak. Bu daha az ve daha büyük bir arka plan sinyal yoğunlukları farklı sıkıntıları sonuçlar altında ayrı ayrı BAC ve CEP problar ön-melezleştirici olduğunu bulduk. Ayrıca bireysel Fosmids BAC klonları yerine de kullanılabilir olduğunu bulduk. Aşağıda açıklanan kokteyl formülasyon için tek bir slayt birimleri temsil etmektedir. Aynı problar kullanılarak birden çok slayt işleme, basitçe hacimleri appropr artırmak Vakit.

   * BAC DNA prob kokteyli:

   11.5 ul hibridizasyon tamponu (% 50 Formamid (Sigma) / 2 x SSC / dekstran sülfat (Sigma)) 2 ul dH ₂ O

   DH ₂ O 2.5 ul BAC/Cot1 DNA (protokol etiketleme için aşağıya bakınız) 15 ul toplam hacmi

   * CEP prob kokteyli:

   7 ul CEP hibridizasyon tamponu (% 65 Formamide/2x SSC / Dekstran Sülfat) 2 ul dH ₂ O

   1 ul CEP/Cot1 DNA (Spektrum Orange/Cy3/Texas Kırmızı ile prelabeled satın) 10 ul toplam hacmi

   * 3:2 oranı 25 ul / slayt ve mix prob kokteyller CEP prob ile karıştırın BAC prob denatüre ve ön hibridizasyon (adım 5.1) sonra.

   VEYA

2. Tablet 20 ul / tüp içerisine Tüm Kromozom Boya prob (Cy3/Texas Kırmızı) arasında slayt. Denatürasyon ve ön hibridizasyon adıma geçin.

"> 5. Slayt ve Probe denatürasyonu ve in situ Hibridizasyon

1. 75 doğasını sonda kokteyl (ler) ° C de 10 dakika. Cot1 tekrarlayan DNA sekansları ile melezleşme ve kromozomların metafaz takiben melezleştirme önlemek için izin vermek için 30 dakika boyunca 37 ° C'de ön-melezleşir.
2. 3 dakika boyunca 72% 70 Formamide/2x SSC, pH 7.0 ° C Coplin kavanoz içinde denatüre kayar.
3. Hemen 3 dakika her biri için 4 de Coplin kavanozlara bir EtOH serisi (% 70,% 90 ve% 100) ° C slaytlar kurutmak.
4. Slaytları oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
5. 45 Pre-sıcak slaytlar ° C probu ön hybridzation (adım 5.1) son 10 dakika süreyle sıcak slayt üzerinde. Gerekirse ön melezleştirilmiş prob kokteyl karıştırın ve her slayt için 25 ul ekleyin; hafifçe kauçuk çimento ile tüm kenarları boyunca her slayt ve mühür üzerine bir lamel yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C de bir gece boyunca inkübe edin.

6. Mesaj Hibridizasyon yıkar

1. 3 dk için her 38-40 ° C 'de en az% 50 formamide/2x SSC, pH 7.0 içinde 3 kez Coplin kavanoz içinde slaytlar yıkayın. Yıkama sıcaklık probları arasında değişebilir. Yüksek arkaplan hibridizasyon varsa size yıkama sıcaklığını artırabilir. Sinyal soluk ve hiçbir arka plan varsa Tersine, o zaman bu yıkama sıcaklığını düşürebilir.
2. Yıkama oda sıcaklığında PN tampon içinde 1 saat slaytlar 3 dakika ve BrdU algılama adıma geçin.

7. BrdU Algılama

1. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika (200 ul / dia) için PNM tampon ile blok kayar.
2. Bir kağıt havlu üzerine kenarında açarak slaytlar boşaltın. 37 30 dakika için PNM tampon içinde anti-BrdU-FITC (50 ug / ml Roche veya Millipore) 100 ul ekle ° C.
3. 3 dakika her biri için oda sıcaklığında PN tampon slaytlar 3 kez yıka.
4. Boşaltmaküzerine aşırı PN tampon bir kağıt havlu üzerine kenarında açarak birer birer kayar. 20 ul DAPI / antifade montaj çözüm (Invitrogen) ekleyin. Bir kağıt havlu ile slayt örtün ve hava kabarcıklarını ve fazla montaj çözümü zorlamak için lamel üzerine bastırın. Görüntü analizi ile devam edin.

8. Görüntü yakalama ve BrdU Ortaklığın nicel

1. Görüntüleri Olympus BX61 Floresan Mikroskop ve Olympus CCD Kamera, 100x objektif, otomatik filtre tekerleği ve Cytovision yazılım (Uygulamalı Imaging) ile yakalanır. BrdU bir FITC filtresi kullanılarak yakalanır; kromozom boyalar (Texas Red, Metasystems veya Cytocell), BAC nin (Cy3) ve CEP (Vysis Spektrum Turuncu) probları Texas Red veya Cy3 filtre kullanarak yakalanır; DAPI bir DAPI Filtresi (bkz. yakalanır Şekiller 2 ve 3).
2. Ilgi Bireysel kromozomları BAC / CEP veya kromozom özel boya problar (Şekil 2B ve 3B) ile tanımlanır. KullanılmasıCytovision yazılım, ilgi her kromozom bir bütün olarak metafaz yayılım "cut-out", bir çizgi uzun kol (Şekil 2C ve 3C) kısa kolundan kromozom uzunluğu boyunca çekilir. Cytovision yazılım her bir kromozom uzunluğu boyunca piksel yoğunluk profili ölçmek için kullanılır. Cytovision yazılım piksel tarafından işgal edilen alan hesaplar ve her bir izole kromozom üzerinde BrdU ya da DAPI sinyalleri tarafından temsil edilen piksel şiddeti miktarını belirler. Her bir kromozom tarafından temsil edilen ortalama piksel şiddeti sonra, piksel (Tablo 1 ve Şekil 4) toplam sayısını elde etmek için bu piksel işgal ettiği alan ile çarpılır. Buna ek olarak, bu protokol kromozom son kopyalayan bölgelerin görüntülenmesi için olanak sağlar. Buna göre, BrdU şirketleşme bantlı deseni kromozomların aktif kopyalayan bölgelerin tespiti için izin verir ve Chromos arasında çoğaltma zamanlama farklılıklarıome çiftleri bu bantlama modeli (Şekil 2 ve 3) farklılıklar olduğu görülmektedir. Son olarak, bağlayıcı desenler bu farklılıklar homolog kromozomlar veya kromozom kollarının ⁴ arasındaki çoğaltma zamanlama farkı bir tahmini için izin veren her kromozom ^6,7, bilinen çoğaltma zamanlaması haritalar mukayese edilebilir. Örneğin, iki kromozom 6 3A kromozom 6 ⁴ normal çoğaltma zamanlama kıyasla> 2 saat arasında model bantlama bir fark görüntü Şekil var.
   Buna ek olarak, burada tarif edilen bir benzer bir prosedür başarılı bir şekilde inaktif ve aktif X kromozomuna ^8,9 arasında uyumsuz çoğaltma zamanlama incelenmesi için kullanılmıştır. Aktif ve inaktif X kromozomu X kromozomundan boyalar kullanılarak tespit edilmiştir. Görüntü Quips mFISH yazılımı (Vysis) ve X kromozomuna tarafından işgal edilen piksel sayısı ve floresan la tarafından işgal edilen piksel sayısı kullanılarak elde edildiBeled BrdU sonra NIH Image (hesaplanmıştır http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).

9. Floresan Etiketleme için BAC DNA Nick yaptı (Vysis)

1. Bir mikrofuge'de tüp soğutulmuş için aşağıdaki prob karışımı ekleyin:
   DH ₂ O 70 ul (4 mg DNA)
   10 ul .2 mM dUTP-Turuncu veya Yeşil
   20 ul .1 mM dTTP
   20 ul 10x Nick yaptı Tampon
   40 ul NT dNTP nin (eksi dTTP)
   40 ul nick yaptı enzim
   200 ul toplam hacim
   @ 16 inkübe ° CO / N. 10 dk için 70 ısıtma ile reaksiyon ° C durdurun. 5 dakika buz üzerinde soğutun.
2. Sonda karışımı aşağıdaki ekleyerek etanol ile DNA çökelti:
   200 ul prob çözümü
   48 ul 3 M NaOAc
   160 ul Cot1DNA (.25 mg / ul)
   1.200 ul% 100 EtOH
3. O / N 10 dk için -80 ° C'de saklayın
4. I Spinn 20 dakika boyunca 12.000 xg'de soğuk. EtOH kapalı Durusu. % 70 EtOH ile 1 kez yıkayın. Daha önce olduğu gibi döndürün. EtOH kapalı Durusu. Hava sadece EtOH cekene kadar kurutun. 100 ng / BAC DNA ul'lik nihai konsantrasyon için 40 ul dH ₂ O de yeniden süspanse edin.

Sonuçlar

Insan kromozom 6 için çoğaltma zamanlama analizinin bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. 6q16.1 bulunan ASAR6 gen ^4, bir silme içeren hücreler, 5 saat boyunca BrdU maruz mitotik hücre için hasat edilmiş ve bir kromozom 6 boya probu (Vysis) ile FISH ve BrdU eklenmesi için işleme tabi tutulmuştur. İki 6'ın arasındaki BrdU bantlama modeli önemli bir fark olduğunu unutmayın, hangi öncesinde kromozom 6'nın [bkz ⁴ 6. kromozomun desen bantlama çoğaltma zamanlaması için biri ...

Tartışma

Kromozom yayılır hazırlanması burada açıklanan başarılı çoğaltma-zamanlama testi için kritik bir adımdır. Hipotonik tedavi öncesinde colcemid ön adım dahil sıklığı ve mitotik hücrelerin yayılmasını yardımcı olabilir. Bu tipik olarak hasat öncesi 1-3 saat için colcemdi hücrelerin ortaya çıkarmak, ve 10 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda colcemid kullanımı. Ancak, ön arıtma adımı colcemid dahil G2 uzunluğu değiştirebilir ve dolayısıyla kromozom ^3'ün yoğunlaşma belirgin çoğaltma zamanlama ve durum de...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 mikrogram / ul
Nick Çeviri Takımı	Abbott Moleküler (Vysis)	07J00-0001
Spectrum Orange dUTP	Abbott Moleküler (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Moleküler (Vysis)	Değişir
LSI / WCP hibridizasyon tamponu	Abbott Moleküler (Vysis)	06J67-011
CEP hibridizasyon tamponu	Abbott Moleküler (Vysis)	07J36-001
Kromozom paiNTS	MetaSystems Grubu	D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Floresan Mikroskop	Olimpos	BX61TRF-1-5
Mikroskop görüntüleme yazılımı sistemi	Uygulamalı Görüntüleme	Cytovision 3.93.1
Dijital Kamera	Olimpos	UCMAD3
			YERİNDE HİBRİTLEŞMEYLE TARİFLER IN Formamid Çözümleri 70% Formamide/2x SSC 35 ml Formamid * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 HCI ile pH 7.0 'a (Sigma) * Bu, -20 ° C'de depolanmış olan o formamid kullanılması önemlidir Uzun süreli depolama oda sıcaklığında formik asit ile pH w üretecektirhasta çok düşük. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamid (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O HCI ile pH 7.0 'a (Sigma) 20x SSC, 4 L' 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na Sitrat (Sigma) hacmi dH 2 O PN Tamponu [0,1 M NaP0 4% 0,1 NP_40 (Sigma)] 0.1 M çözelti sodyum fosfat her (Filtre sterilize ve 500 ml alikotları saklamak) olun. 0.1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13.8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): hacmi dH 2 O 0.1 M NaH 2 P0 4 1 M 14.2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) hacmi dH 2 O. PN:, 1 M NaH 2 P0 4 ile 2 HP0 4 pH 8.0 0.1 M Na pH ayarlama. Filtre sterilize ve NP-40 1 ml ekleyin. PNM 50 ml 1.25 gram yağsız kuru süt (Sigma) 25 ml PN tamponu (yukarıda tarifi) Sürekli karıştırarak, yaklaşık 15-20 dakika boyunca karıştırılır. 10 dakika için 400 x g'da 2 kez Spin. Süpernatant kullanın ve çöktürülmüş süt proteinleri rahatsız değil emin olun.