Etiketleme tarafından superecliptic pHluorin membran reseptörlerinin ekstraselüler domain ve görüntüleme kültürlü fare nöronları bu füzyon reseptörleri, biz doğrudan plazma membran reseptörlerinin bireysel veziküler ekleme olayları oluşturulabiliyor. Bu teknik, plazma membran reseptör ekleme düzenleyen moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına vesile olacaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli
Bu makalede
Özet
Özet
Plazma membranı (PM) ve hücre içi bölmeleri arasındaki reseptör ticareti düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması, mükemmel uzaysal ve zamansal çözünürlükle deneysel bir yaklaşım gerektirir. Dahası, böyle bir yaklaşım, aynı zamanda hücre içi bölmelerde olanlardan ÖS lokalize reseptörler ayırt etmek yeteneğine sahip olmalıdır. Her bir vesikül reseptörlerinin sadece küçük bir bölümü taşıyan beri En önemlisi, tek bir vesikül reseptörleri tespit olağanüstü saptama hassasiyet gerektirir. Ve hücrelerin kimyasal sabitleme gerektirir immunolabeled yüzey reseptörleri, floresan mikroskop incelemesi ve bu nedenle yeterli zamansal çözünürlük 1-6 yoksun; reseptör ticareti incelemek için standart yaklaşımlar gerekli mekansal ve zamansal çözünürlükleri de yoksun biyokimyasal algılama, ardından yüzey biyotinilasyon içerir. Bu sınırlamaları aşmak için, biz ve diğerleri geliştirdi ve yeni bir stra istihdam var7-17 mükemmel uzaysal ve zamansal çözünürlükle PM içine reseptörlerinin dinamik ekleme görselleştirme sağlayan tegy olduğunu. Yaklaşım reseptörlerinin N-terminal hücre dışı etki alanına bir pH-duyarlı GFP, superecliptic pHluorin 18, bir etiketleme içerir. Superecliptic pHluorin asidik pH nötr pH ve floresan olmayan (pH <6.0) Flüoresan olmanın kendine has bir özelliği vardır. Bu nedenle, etiketli reseptör olmayan floresan zaman hücre içi veziküller ticareti ya da endozomal bölmelere bir asidik lümen içinde ve bunlar PM dış yüzeyi üzerinde, hücre dışı nötr pH ortamına maruz yalnızca kolaylıkla görselleştirilebilir hale gelir. Bizim stratejimiz dolayısıyla bize intraselüler kaçakçılığı veziküller içinde olanlardan PM yüzey reseptörleri ayırt etmenizi sağlar. Yeterli uzamsal ve zamansal çözünürlükleri, hem de reseptör dinamik çalışma ticareti için gerekli olan duyarlılık elde etmek için, kullanılan yansıtmak iç toplamBizi optik görüntüleme (~ 170 nm) iyi uzaysal çözünürlüğü elde etmek için etkin iyon floresan mikroskobu (TIRFM), video-oranı mikroskobu (30 kare / sn) ve duyarlılık zamansal çözünürlük tek GFP floresan tespit etmek molekülü. Görüntüleme By TIRFM altında reseptörleri, biz doğrudan bireysel reseptör ekleme olayların kültürü nöronlarında PM içine görselleştirmek başardık pHluorin etiketli. Bu görüntüleme yaklaşımı potansiyel superecliptic pHluorin ile etiketlenmiş edilebilir bir hücre dışı alanı ile herhangi bir zar proteini için uygulanabilir, ve farklı zar proteinleri (reseptörler, iyon kanalları, vs) yerleştirilmesi için yöneten kilit mekanizmasının detaylı bir teşrih izin verecektir PM.
Protokol
1. Nöronal Kültür İklimlendirme için Fare Glia Kültür hazırlanması
- T75 şişeler kolajen çözeltisi (GKD 2 O Purecol arasında 1:03 seyreltme) ile kaplanır. Şişeleri dik ayarlanır ve bir doku kültürü kaputu gecede kurumaya bırakılır.
- Diseksiyon tamponu (aCSF: 119 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 30 mM glukoz, 25 mM HEPES, kalsiyum olmadan pH 7.4) ve glia ortamı (DMEM% 10 FBS, 10 birim / ml penisilin, 10 ile desteklenmiş ug / ml streptomisin, ve Glutamax) ° C Kullanım için hazır olana kadar hazırlanmış ve 4 depolanır.
- Glia kültür gününde, glia medya fare beyin teşrih önce 37 ° C su banyosu içinde en az 30 dakika için ısıt....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bilinmeyen nedenlerden ötürü, fare nöronları zaman sıçan nöronlar daha kültürünün daha zordur. Bizim tecrübelerimize göre, nöronlar ve glia karışık kültürü birincil kültürlü fare nöronları için iyi çalışır. Nöronal somata ve TIRF mikroskopi ulaşamayacağımız dendritik süreçleri diyorum, glia hücreleri üstüne büyürler kültürü nöronlar ve bunların süreçleri bu tür Ancak, böyle bir karma kültür, TIRF görüntüleme deneyler için uygun değildir. Bu nedenle, lamel az glia ile daha düşük bir yoğunlukta kültür nöronal TIRF görüntü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu eser Jackson Laboratory başlangıç fonları tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
deoksiribonükleaz I (DNaz I)
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| İsim Şirket Katalog Numarası Yorumlar | |||
| Saflaştırılmış sığır kollajen çözüm (Purecol) | Gelişmiş Biyo | 5005-B | |
| Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| Penisilin streptomisin (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| Sodyum piruvat | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM Yüksek Glikoz | GIBCO | 10313-021 | |
| Fetal bovin serumu (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| Papain | Worthington Biyokimyasal Corp | LS003126 | |
| SIGMA | DN25-10MG | ||
| Dulbecco Fosfat (DPBS) Tamponlu Salin | GIBCO | 14190-144 | |
| % 0.05 tripsin | GIBCO | 25300-054 | |
| Poli-L-lisin hidrobromür | SIGMA | P2636-1G | |
| Borik asit | Fisher-Bilimsel | BP 168-500 | |
| Neurobasal Orta | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Ek | GIBCO | 17504-044 | |
| Isı inaktif at serumu | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofektamin 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-Bilimsel | BP310-500 | |
| Kültür Ekle | Millipore | PICM03050 |
Kaynaklar
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and syn....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
