Gibi nöromüsküler kavşaklar (NMJs) terminal Schwann hücreleri (SC'ler) gibi sık donatılı dokularda, tek tek hücrelerin Görselleştirme zordur. "Ardışık fotoğraf beyazlatma" bleaching sıralı time-lapse görüntüleme ile kombine edilebilir triangularis sternumun kas eksplant, elverişli bir sinir-kas preparatı,, örneğin tek bir terminal SC'ler, tasvir verir ve Post-hoc Immunostainings.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sıralı Nöromusküler Kavşağı'nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma
Bu makalede
Özet
Özet
Foto-ağartma Sıralı NMJ tek tek SC'ler etiketlemek için bir non-invaziv bir yol sağlar. NMJ memeli sinir sisteminin büyük sinaps ve sinaptik yapısı ve fonksiyonunu araştırmaya modeli yol gösterici olarak görev yapmıştır. Fare NMJs Motor akson terminalleri olarak kas lifleri ile simit benzeri iletişim siteleri oluşturur. Motor akson ve terminali SC'ler tarafından kılıflı edilir. Geçtiğimiz on yıl içinde, çok sayıda transgenik farelerin sırasıyla Thy1-XFP 1 ve Plp-GFP fareler 2 örneğin, motor nöronlar ve SC'ler görselleştirmek için üretilmedi.
Motor akson boyunca myelinating aksonal SCs sıçrayabilen aksiyon potansiyelinin yayılmasını sağlamak için, Ranvier düğümler yoluyla ayrılmış ve çakışma internod düzenlenmiştir. Buna karşılık, sinaps terminal SC'ler izlemek ve nörotransmisyon teşvik, enkaz ve kılavuz rejenere aksonların sindirmek özelleşmiş glia hücreleri vardır. NMJs sıkıca yarım düzine olmayan myel kadar kapsamındadırTerminal SC'ler inating - onlar doğrudan membran temas 3'te olduğu gibi bu, ancak, ayrı ayrı, ışık mikroskobu ile çözülemez.
Çeşitli yaklaşımlar bireysel terminali SC'ler görselleştirmek için var. Bunların hiçbiri olsa, kusursuz vardır. Örneğin, tek hücreler bir boya ile doldurulmuş bir mikroelektrot kazığa olan boya dolgu, ikinci bir doldurma önce bir etiketli hücre tahrip gerektirir. Bu sonraki time-lapse kayıt 3 ile uyumlu değildir. SC'ler Çok-spektral "Brainbow" etiketleme floresan proteinlerinin kombinatoryal ifadesi 4 kullanılarak elde edilmiştir. Ancak bu teknik, çeşitli transgenlerin bileşiminden oluşur ve ikinci promoterlerin salgılama modeli ile sınırlıdır. Gelecekte, SCs içinde "foto-değiştirilebilir 'proteinlerin ekspresyonu daha başka bir alternatif 5 olabilir. Burada ardışık fotoğraf beyazlatma tek hücre ağartılmış, nerede ve çıkarılması ile elde ettikleri görüntüyü sunmak. İnanıyoruzBu yaklaşım - kolaylığı ve çok yönlülük nedeniyle - in vivo kullanılan ve diğerleri hücre tipleri, anatomik siteleri veya türlerin 6 transfer edilebilir özellikle sinirbilimci teknoloji paletine kalıcı yanı, temsil eder.
Triangularis sternumun kas eksplantlar terminali SC'ler için ağartma sıralı ve sonraki konfokal time-lapse mikroskopi aşağıdaki protokol, biz detaylı uygulama. Bu, ince yüzeysel ve kolayca diseke sinir-kas hazırlık 7,8 NMJ gelişimi, fizyolojisi ve patolojisi 9 çalışmalar için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Nihayet, biz fiksasyon yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme, immünohistokimya veya ultrastrüktürel incelemeler korelasyon gerçekleştirmek için sonra triangularis sternumun kası nasıl hazırlanır açıklamak.
Protokol
1. Triangularis sternumun Eksplantasyon (Şekil 1)
Zamanlama: 15 dk.
- Forseps 2 çift, 1 adet makas, makas 1 adet makas, 1 doku kültür kaplarına (10-cm): cerrahi aletler hazırlayın. (15 dakika için asgari) önceden soğutulmuş kabarcıklandırılmış (4 ° C),% 5 CO2 /% 95 O ile 2 arasında Ringer çözeltisi. Buz ile 15-cm doku kültürü çanak doldurun ve metal plaka ile örtün. Diseksiyon mikroskobu hazırlayın ve diseksiyon sırasında eksplant soğutmak için diseksiyon kapsamında buz ile 15 cm çanak yerleştirin.
- Öldürücü izofluran aşırı dozu (ya da kurban herhangi bir başka uygun yöntem) ile far....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Görüntüleme yemek için hazır bir triangularis sternumun eksplant bir örneği Şekil 1G 'de gösterilmiştir. Triangularis kas kas liflerinin birkaç katmandan oluşur ancak bu gibi eksplant NMJs ex vivo görüntüleme için özellikle uygundur. Bu, transgenik fare hatları elde edilen eksplantlarından yüksek çözünürlükte görüntü elde sağlayan vurgulamak SCs (PLP-GFP 2) ve / veya akson (Thy1 XFP-1) ya da. Yüksek kaliteli görüntüleme için kritik faktörler şunlardır.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan SC beyazlatma yöntemi, basit, hızlı ve çok yönlüdür: (i) tek bir transgen esas konfokal mikroskopi ile tek SC morfolojisi ve dinamikleri açığa sağlar - Ek allelleri gerektiren hastalık modelleri ile yaklaşım örneğin birleştirerek zaman önemli bir avantaj . Diseksiyon dan tespit için yarım gün içinde gerçekleştirilebilir (ii) 'deki metod olup, hızlıdır. Bu tür hücre ablasyon, görüntüleme organeller, elektrofizyoloji veya immünohistokimya gibi başka yöntemler ile de kombine edilebilir (iii) bun.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz mükemmel teknik yardım için Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi ve Kristina Wullimann teşekkür etmek istiyorum. Biz Plp-GFP fareler sağlamak için W. Macklin ederim. Alexander-von-Humboldt Vakfı tarafından ve ulusal fon ajansı ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" tarafından; TM Deutsche Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG) tarafından İleri Araştırmalar Enstitüsü (Technische Universität München), tarafından desteklenmektedir ) ERA-Net neuron "iPSoALS" ve "2-foton görüntü" çerçevesinde. TM ve MB Entegre Protein Bilim (Münih) Merkezi tarafından desteklenmektedir. PM Technische Universität München (TUM-GS) Enstitüsü tarafından ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirketi (örnek) | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| % 70 (hacim / hacim) etanol | Roth | T913.1 | sprey şişesinde |
| izofluran | Forene, Abbott | Başka onaylı anestetik öldürücü anestezi için kullanılabilir | |
| transgenik fareler (Plp-GFP) | anılan kaynaklardan elde edilecek | ||
| soğuk ışık aydınlatması ile diseksiyon mikroskobu | Olympus SZ51 | Schott KL 1500 LCD ile donatılmıştır | |
| forseps #2 | Güzel Bilim Araçları | 11233-20 | |
| forseps # 5 | Güzel Bilim Araçları | 11295-00 | |
| makas, büyük bir tıp | Güzel Bilim Araçları | 14108-09 | |
| makas, küçük açılı bahar | Güzel Bilim Araçları | 15033-09 | |
| in-line ısıtıcı | Warner Instruments | SF-28 | |
| 3,5 cm yemekleri için halka ısıtma | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| İki kanallı sıcaklık kontrol sistemi | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pompa sistemi | sipariş üzerine yapılmış | ||
| 15-cm doku kültürü çanak | Sarstedt | 83.1803.003 | buz ile dolar ve metal plaka ile kaplı |
| 10-cm doku kültürü çanak | Sarstedt | 83.1802.003 | Oksijenli Ringer solüsyonu ile |
| 3,5 cm doku kültürü çanak | Sarstedt | 83.1800.003 | Sylgard polimer ile dolu |
| Sylgard polimer | Dow Corning | Sylgard 184 Silikon Elastomer Takımı | |
| konfokal mikroskop | Olimpos | FV1000 | argon laser |
| 50 ml reaksiyon tüpü | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| PBS içinde% 4 PFA | Sigma | P6148 | |
| Kanül 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| 1 ml şırınga | Neolab | E-1496 | |
| sinaptofizin antikor | Invitrogen | 18-0130 | tavşan |
| sekonder antikor | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-kuyulu plakalı | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| PBS içinde 0.1 M glisin | Roth | 3790.1 | |
| lamelleri | Neolab | E-4132 | |
| slaytlar | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vektör laboratuvarları | H-1000 | |
| minutien işaretçilerine × 10 | Güzel Bilim Araçları | 26002-20 | <4 mm kısaltılmış |
| α-Bungarotoxin Alexa 594 akuple | Invitrogen (Moleküler Sondalar) | B-13423 | |
| Çözüm Engelleme | |||
| 0.01 M PBS | |||
| % 0.2 Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Keçi Serum | Abcam | ab7481 | |
| % 1 sığır serum albümini | Sigma | A7030 | |
| Ringer % 95 O2 /% 5 CO2 ile kabarcıklandırılmış | |||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCI | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH 2 PO 4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO 3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glikoz | Sigma | G7528 | |
Tablo 1. Özgül reaktifleri ve ekipmanları. |
Kaynaklar
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid pro....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
