Yöntem makalesi

Klinik Uygulama

DOI:

10.3791/50070

⸱

1 Şubat 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatrics, U.T. MD Anderson Cancer Center, 2Department of Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy, U.T. MD Anderson Cancer Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir CD19 özgü kimerik antijen reseptör (SYR) eksprese eden T hücrelerinin ilk-in-insan gen tedavi denemelerinde B-hücreli kanserlerin araştırılan tedavi olarak infüze edilir. Bu kullanılarak T hücre genetik modifikasyonu tanımlamak Sleeping Beauty (SB) sistemi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik düzeyde T hücrelerinin potens tümör ilişkili antijenler üstün (i) tanıma (TAAS), infüzyon sonrası (ii) sebat, (iii) için potansiyele sahip bir biyolojik ürün mühendisi immünoterapi ile gen tedavisi birleştirerek geliştirilebilir tümör alanlarına göç ve tümör mikro içinde efektör fonksiyonları geri dönüşüm (iv) yeteneği için potansiyel. İnsan uygulama için tasarlanmış T hücrelerinin genetik manipülasyonu En yaklaşımlar CAR 1-3 istikrarlı ifade retrovirüs ve lentivirüs kullandık. Bu üretim tesislerinin sınırlı sayıda klinik düzeyde rekombinant virüs üretimi ve salınımı üzerine dayanır Bu yaklaşım, ancak güncel iyi üretim uygulamaları (GMP) ile uyumlu, pahalı olabilir. DNA türün 1/10 th recombin maliyeti yaklaşık klinik grade üretilebilir beri viral olmayan plazmid elektro-transfer transdüksiyon için cazip bir alternatif olduğunukarınca GMP dereceli virüs. Biz insan uygulama 4-8 Güzellik (SB) transpozon ve transposase Sleeping adapte entegrasyon verimliliği artırmak için. Bizim SB sistemi ilgi bir gen (CD19RCD28 belirlenmiş örneğin 2. nesil CD19-spesifik CAR transgen,) ve TA dinükleotid içine transgen 9-11 tekrarlar ekler transposase (örn. SB11) kodlayan bir transpozon oluşan iki DNA plazmit kullanır . Bir TAA (örneğin, CD19) ve T-hücresi kostimülatör moleküller CD86, CD137L, ifade etmek için modifiye K562-türevli suni antijen sunan hücreler (AAPC) (klon # 4) kullanmak genetik olarak modifiye edilmiş T-hücrelerinde, klinik olarak yeterli bir sayı üretmek için bir Monoklonal antikorların yüklenmesi için interlökin (IL) -15 (peptid modifiye IgG4 Fc bölgesi ile birleşir) ve CD64 (FC-γ reseptör 1) zar bağlı versiyon (mAb) 12. Bu yazıda, complia üstlendiği edilebilir prosedürleri göstermeknce ile CD19-özgü CAR + insan uygulaması için uygun T-hücreleri üretmek için cGMP. Bu γ-ışınlanmış AAPC arasında her-7-günlük eklemeler (stimülasyon döngüsü) ile stabil integrants alınmasını takiben iki DNA plazmit, bir SB transpozon (CD19RCD28) ve SB transposase (SB11) elektro-transferi senkron sağlandı (klon # 4) çözünür rekombinant insan IL-2 ve IL-21 13 varlığında. Genellikle 4 kür (sürekli kültürün 28 gün) stabil CAR ifade T hücrelerinin klinik-çekici sayılar üretmek için yapılmaktadır. Imalat klinik düzeyde CD19-spesifik T hücrelerinin Bu metodoloji, periferik kan (PK) ve göbek kordonu kanı (KK) elde edilen T hücreleri için de uygulanabilir. Ayrıca, bu yaklaşım AAPC üzerinde SYR tarafından tanınan TAA, ifadesi ile tanıttı CAR özgüllüğü eşleştirme tarafından farklı tümör tiplerine T hücreleri oluşturmak için harnessed olabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gün 0 veya önce

1. PB ve UCB gelen Mononükleer Hücreleri İzolasyon (ÇUŞ)

  1. Eşit hacimde PB ve PBS-EDTA dört ciltlik UCB seyreltin.
  2. 40 dk (hiç fren) - 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne (ler) ve 30 için 400 x g'da santrifüj Ficoll üzerine yavaşça tabakası, seyreltik kan (25 mi) (12 ml) eklenmiştir.
  3. Taze bir 50 ml santrifüj tüpüne bir transfer pipet kullanarak mononükleer hücre fraksiyonu (arayüz) toplayın ve aktarmak.
  4. PBS-EDTA ile 50 ml hacim getirin ve 10 dakika için 450 xg santrifüj.
  5. Komple Kültür ortamı (CCM) ile, 10 dakika için 400 x g'da santrifüj 50 ml süpernatant, nazikçe tekrar askıya hücre peleti (ler) aspire.
  6. Nazikçe yeniden askıya ve havuz CCM hücre pelet ve Tripan mavi dışlama yöntemi (Cellometer, PBMC programı) kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek.
  7. MNC şimdi elektroporasyon (Nucleofection) için kullanılan veya ileride kullanılmak üzere kriyoprezerve edilebilir.
Gün 0 üzerine Elektroporasyon için T hücreleri başlığı "> 2. Hazırlık

  1. Kriyoprezerve MNC kullanıyorsanız, hızlı bir şekilde tam ölçekli elektroporasyon (2 x 10 8 santrifüj ve 2 saat inkübasyon esnasında hücre kaybı hesaba ~% 20 ekleyerek) 37 ° C su banyosu için yeterli hücre eritin. Taze izole kullanıyorsanız MNC 2.3 adıma geçin.
  2. Nazikçe yeniden askıya ve önceden ısıtılmış Komple Fenol-Alerjik RPMI kültür ortamı (PF-RPMI) ve 10 dakika (hiçbir fren), aspirat süpernatant için 200 xg'de santrifüj bulunan uygun boyutta bir santrifüj tüpüne (ler) için hücreleri aktarmak.
  3. PF-RPMI içinde tekrar askıya MNC, bir hücre sayımı (Cellometer) gerçekleştirmek ve 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda uygun boyutlu bir hücre kültür kap (lar) ile hücre transfer edin.
  4. Nemli 37 içinde inkübe ° 2 saat süreyle C /% 5 CO2 kuluçka makinesi ± 30 dak.
  5. Steril bir santrifüj tüpüne (ler) i, 5 dak (hiçbir fren) için 200 x g'da spin MNC aktarın yavaşça süpernatan ve r aspireE-askıya ve PF-RPMI hücre pelet (ler) birleştirir.
  6. Bir hücre sayımı (Cellometer) gerçekleştirin ve (2 x 10 8 MNC) gerekli hücre süspansiyonu hacmi hesaplamak.
  7. Steril bir 50 ml santrifüj tüp ve 10 dakika (hiçbir fren) için 200 xg'de spin hesaplanan hacim aktarın.
  8. Kalıntı medya kalır ve hafifçe tüpün yan dokunarak yeniden askıya böylece süpernatant aspire.

3. Gün 0 üzerine MNC (10 Küvetleri kullanma Tam Ölçekli Süreç) arasında Elektroporasyon (Nucleofection)

  1. Nemli 37 ° C /% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde sıcak PF-RPMI 4 ml içeren 10 kuyucuklu bir steril 12 oyuklu plaka ön-inkübe edilir.
  2. Hazırlayın ve önceden sıcak Lonza Nucleofector Çözüm İnsan T hücre kiti (, üreticinin talimatlarına göre kurulur www.lonza.com ) Biyogüvenlik Kabini (BSC) ortam sıcaklığına.
  3. Eklenti tarafından Nucleofector çözüm / DNA ana karışımı hazırlayınilave Nucleofector çözelti g 100 ul, transposon 15 mg (CD19RCD28/pSBSO olarak belirlenmiş, süper plazmid DNA) ve tepkime / küvet başına transposase 5 mikrogram (pCMV-SB11 olarak tanımlanan plazmid DNA, süper).
  4. Hafifçe santrifüj tüpünün yan dokunarak hücre pelet (adım 2.8 'dan itibaren) Dispers ve Nucleofection çözüm / DNA master miks (Final hücre konsantrasyonu: 2 x 10 7 cells/100 ul) yeniden askıya.
  5. Dikkatle kabarcıkları önlemek için dikkatli olmak, on (10) Lonza Nucleofection küvetlerin her hücre süspansiyonu (adım 3.4 'dan itibaren) 100 ul aktarın.
  6. Kez küvet dokunun ve program U-014 (uyarılmamış T hücreleri için) kullanarak elektroporasyonu.
  7. BSC küvetler ve 12-plaka (Adım 3.1) aktarın.
  8. Iyi, karşılık gelen ikinci önceden ısıtılmış kültür ortamı ~ 500 ul ekleme (Ste içinde hazırlanmış 12-kuyu plakası ile bir Amaxa ince uç transfer pipeti kullanarak, her bir küvet dan electroporated hücreler hasatp 3.1) ile nemlendirilmiş 37 ° plaka dönüş 2 saat süreyle C /% 5 CO2 kuluçka makinesi ± 30 dak.
  9. 2-hr inkübasyon, hasat sonrasında ve tüm kuyulardan steril bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak.
  10. 8 dakika, çevre sıcaklığı, herhangi bir fren ve kalıntı orta hücre peleti kaplayacak şekilde süpernatan aspire ve atmak için 140 x g'de santrifüj ile hücreler yıkanır.
  11. Nazikçe santrifüj tüpünün yan dokunarak hücre peleti Disperse ve yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için CCM yeniden askıya.
  12. Hücre sayımı gerçekleştirin ve 10 6 hücre / CCM ml hücre konsantrasyonu ayarlayın.
  13. Gecede kuluçka hücre kültürü şişesi (lar) ve yere hücre süspansiyonu aktarın.
  14. EGFP transfekte hücreler (Amaxa kontrolü EGFP plazmid, süper 5 mikrogram ile 5 x 10 6 hücre / küvet, pmaxGFP): Süreç adımları 2,1-3,8 kontrolü için tekrarlandı.

1. Gün 1 st ve SonrakiUyarım Çevrimleri

4. Gün 1 Flow Sitometri CAR İfade Analizi

  1. Electroporated hücreleri Harvest ve Tripan mavi dışlama yöntemi (hemasitometre) kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek.
  2. CD3, CD4, CD8, ve insan IgG Fcγ (CAR ifade ölçümü olarak) için spesifik antikor ile Leke hücreleri (1-2 x 10 6).
  3. FACS Calibur hücreler Edinme ve CAR ifade hesaplamak için FCS Express yazılımını kullanarak verileri analiz.
    1. Formülü ile kültür CAR + hücreleri hesaplayın:
      (Toplam canlı hücre sayısı) x (% CAR + hücreler) CAR = Hayır + hücrelerin

5. 1. Gününde AAPC hazırlanması (klon # 4). AAPC (klon # 4) Eş-express İstenilen T Hücre Co-uyarıcı Molekülü için K562 hücreleri (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan Elde Edilen Ebeveyn Hattı) türetilen edildi

  1. 37 dondurulmuş 100 Gy ışınlanmış AAPC bir kısım çözülme °; C su banyosu.
  2. Hücreleri 400 xg, CCM 10 dk santrifüj ile iki kez yıkanmış ve Cellometer (Tripan mavi dışlama) kullanılarak sayılır.
  3. Uyarılması için gerekli canlı AAPC sayısı hesaplayın:
    (CAR + hücre sayısı) x 2 ışınlanmış AAPC arasında = No gerekli

6. CAR AAPC-aracılı Stimülasyon + Gündüz T Hücreleri 1 1. başlangıcı ve sonraki Uyarım Çevrimleri

  1. CCM: 1:2 oranında (canlı AAPC CAR + hücre) steril bir kap içinde electroporated hücreleri (SYR ifade) ve γ-ışınlanmış AAPC (klon # 4) karıştırın.
    1. AAPC oranı flow sitometri elektroporasyon gün sonra esas CAR ifadesi için ayarlanır unutmayın.
  2. Hücre süspansiyonu ile IL-21 (30 ng / ml) ilave edilir.
  3. Tablet içinde T-75 cm2 şişeye (ler) ve / veya 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda Vue kültür torbaları ve incubat dönmekya da.

Gün 3, 5

7. CAR Devamı Kültür + T hücreleri

  1. Bir yarı-ortam değiştirme işlemini, IL-21, doldur ve 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda T hücreleri korumak.

7. Gün

8. İlk AAPC aracılı Uyarım Çevrim sonu

  1. Hasat hücreleri saymak ve leke CD3, CD4, CD8, ve Fcγ (SYR) ve 10.1 adıma geçin.

9. CD56 + hücreler (Genellikle 7 ile 14 gün arasında elektroporasyon sonra) tükenmesi

  1. Paramanyetik boncuklar kullanarak CD56 tükenmesi gerçekleştirin eğer CD56 + CD3 neg lenfositler ≥ 10%.

Uyarım döngüleri # 2, # 3, Gün 8 → 14 & # 4. Sorumlu, gün 15 → 21, & Gün 22 → 28

10. Klinik olarak yeterli Numaraları T hücreleri yayma için AAPC özyinelemeli eklenmesi

  1. Stimulatio tekrarlayınn süreci (4 kez) gibi adımlar 4,3-8,1 tarif.
  2. Ve sonra her ortam değişimi (haftada üç kez, Pazartesi-Çarşamba-Cuma zamanlama) at Gün 7, 14 ve 21. sayfada başlayan kültürleri, IL-2 (50U/ml) ekleyin.
  3. Cryopreserve (arşiv) aşırı T hücreleri gerektiği gibi.
    1. T hücreleri kontrollü oranı dondurucu kullanılarak dondurulduğu.

Gün 28

11. Son AAPC aracılı Uyarım Döngüsünün Sonu: Hasat T hücreleri

  1. Sürümü test ve infüzyon için T hücreleri Cryopreserve.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu plazmid DNA ve γ-ışınlanmış AAPC T hücrelerinin çoğalma elektro-transferi insan uygulamalar için PB ve UCB elde edilen T-hücrelerinde, klinik olarak-çekici sayı üretmek için kullanılabilir olduğunu bildirmektedir. Bu genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin MHC kompleksi bağımsız TAA CD19, tanıdığı bir tanıttı CAR ifade. SB-kaynaklı DNA plazmid CD28 ve CD3-ε 14 üzerinden sinyalleri, ve (ii) transposase, SB11 15, 13 önceden tarif edilmiştir ki, (i) transpozon, bir 2. kuşak CAR (CD19RCD28), 16,17 ifade etmek için . Mevcut çalışmada kullanılan plasmidlerin Waisman Klinik Biomanufacturing Tesis (Madison, WI) tarafından ticari olarak üretilen edildi. K562 hücreleri (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan elde edilen parental çizgi), co-ekspres arzu edilen T-hücresi birlikte-uyarıcı moleküller (AAPC bir hücre yüzeyi üzerinde 3% 90 her bir molekül ortaya elde edilmiştir) AAPC (klon # 4),daha önce 12 tarif. Burada, CD19-spesifik T hücrelerinin PB veya UCB sayısal bir araba-bağımlı bir şekilde T-hücrelerinde (Şekiller 1 genişletmek için AAPC eklenmesi ile takiben araç tanıtmak için SB aktarılması ile elde edilen mononükleer hücreleri (MNC) elde edilebileceğini göstermek , 4) 13,18. On küvetler (2x10 7 MNC / küvet) transpozon (SYR) için kodlama plazmid DNA 15 mikrogram (CD19RCD28/pSBSO) ve transposase (SB11) için kodlama plazmid DNA 5 mikrogram (pCMV-SB11) kullanarak her alıcı için electroporated edilir. MNC sınırlayıcı veya laboratuvar çalışmaları için geri ölçekli eğer küvetlerin sayısı azaltılabilir. Elektroporasyonun gün uyarılması döngüsü 1. "Gün 0" olarak tanımlanır. Flow sitometri ve kültür koşulları için denetimleri gibi, otolog T hücreleri sahte electroporated vardır (DNA plazmid olmadan) ve sayısal çapraz bağlantı CD3'e T hücre sürdürmek OKT3 yüklenmi olmuştu γ-ışınlanmış AAPC (klon # 4) genişletilmiş çoğalması. Biz routinely electrotransfer ve elektroporasyon gün sonra T-hücrelerinde (Şekil 2B) canlılığı etkinliğini değerlendirmek. Bu ilk kez noktada kontrol DNA plazmid (pmaxGFP belirlenmiş) ve CAR'dan EGFP ifadesi entegre ve episomal plazmid protein ekspresyonu yansıtır. Genellikle, günlük elektroporasyon sonra biz% 40-50 arasında T hücre canlılığı ile ~% 40 (Şekil 2A) az ~ 60% ve ARAÇ ifadeye EGFP ifade ölçün. Çözünür rekombinant insan IL-2 ve IL-21 varlığında γ-ışınlanmış AAPC Yinelemeli ilave stabil bir şekilde CAR (CD19RCD28) eksprese eden T hücreleri alır. CD3 neg CD56 + NK hücrelerinin bu NK hücre yüzdesi T hücreleri üzerinde eksprese CAR yüzdesi düşük, özellikle ≥% 10 ise ve CD56-spesifik paramanyetik boncuklar kullanarak kültürü tükenmiş. Bu tükenmesi proliferatio sürdürmek için AAPC yeteneğini engelleyen NK hücrelerinin hızlı büyümesi engellerARAÇ n + T hücreleridir. Vesilesiyle, CAR + T hücreleri NK hücrelerinin tükenmesi son iki stimülasyon döngüleri sırasında üstlenilen, ama bu bazı CAR + T hücreleri CD56 arasında ortak ifadesi nedeniyle istenen hücre kaybı tanıtmaktadır. T-hücreleri 14. gün geçmiş Vue kültür torba kullanılarak, bir işlevsel olarak kapalı bir sistem içinde büyütülmüştür. Genetiği değiştirilmiş ve yayılan T hücrelerinin bir alt kümesi genellikle gelecekteki analizler için arşiv malzemesi kaynağı olarak hizmet etmek ve olmak AAPC üzerine ko-kültür Günü 14 veya 21. Gün (Uyarım döngülerinin sonuna # 2 veya # 3) kriyoprezerve edilir beklenmeyen problemler sonradan üretim süreci sırasında oluşursa çözülmüş. T hücreleri tipik olarak (Şekil 3) veya kültür Günü yaklaşık 28 hasat olduğunu rutin ekspres>% 90 CAR ve vardır>% 80 uygulanabilir (Şekil 2C, D). Biz daha önce AAPC üzerine ko-kültür dört hafta sonra CD3 ortalama kat genişleme + T hücreleri 19.800 olduğunu göstermiştir ± CA ile 11.313 R + ifadesi% 90 olmak ± 7.5 13. Bu T hücreleri dondurulan ve in-proses ve güvenlik ve üretilen ürünün terapötik potansiyeli üzerine bilgilendirir serbest bırakma testi geçmiştir. Film test öncesinde klinik çalışmalara alıcılara içine infüzyon için analiz sertifikası oluşturmak için klinik laboratuvar iyileşme değişiklikler (CLIA) uygun olarak yapılmaktadır.

figure-results-1
Şekil 1. CAR + PB ve UCB alınan T hücreleri elektroporasyonu ve yaymak için süreci özetleyen Adımlar. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

upload/50070/50070fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg "/>
Şekil 2. PB gelen genetik olarak değiştirilmiş T-hücreleri karakterizasyonu. Gen transferi verimini değerlendirmek için ilk uyarım döngüsünün 0. günde EGFP (A) ifade. CD19-spesifik CAR Expression (CD19RCD28) gibi +, CD8 + ve CD4 + elektroporasyon sonra (B) yaklaşık 24 saat ve (C) 28 gün AAPC üzerine ko-kültür sonra T hücreleri CD3 flow sitometri ile değerlendirildi. ARAÇ Benzer ifade UCB alınan T-hücrelerinde gözlenmiştir. (D) CAR ifade kinetiği. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-results-2
Şekil 3,. PB-türetilmiş CAR YayılmasıCD3 + ve CAR + rekombinant insan IL-2 ve IL-çözünür 21. varlığında, γ-ışınlanmış AAPC üzerinde tekrarlanan ko-kültür tarafından PB elde edilen T-hücrelerinde, sayısal genleşme + T hücreleridir. Oranı. Yukarı okları her Uyarım döngüsünün başlangıcı olduğunu γ-ışınlanmış AAPC ve eklemeler göstermektedir. UCB-türetilmiş CAR + T hücreleri sayısal genişleme benzer oranları sergilerler.

figure-results-3
Şekil 4. Genetik olarak ARAÇ değiştirmek ve yaymak için SB ve AAPC sistemleri kullanılarak üretim sürecinin şematik + Pb ve UCB alınan T-hücreleri. CD19-spesifik CAR + T hücreleri SB-türetilmiş plazmit DNA, süper ve ko-kültür sonraki elektro-transfer tarafından oluşturulan varlığında o içinde K562-türevli AAPC (klon # 4)f rekombinant insan çözünür IL-2 ve IL-21. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

T hücre kaynağı Transposon * Transposase T hücre infüzyonu IRB # NIH-OBA # IND #
Otolog (hastanın türetilen) ** CD19RCD28 SB11 Otolog hematopoetik kök hücre nakli sonrası 2007-0635 0804-922 14193
Allojenik (donör kaynaklı) CD19RCD28 SB11 Allojenik hematopoetik kök hücre nakli sonrası 2009-0525 0910-1003 14577
Allojenik (donör kaynaklı) CD19RCD28 SB11 Allojenik göbek kordon kanı nakli sonra 2010-0835 1001-1022 14739

* Tablo 1. MDACC de FDA himayesinde Klinik çalışmalarda CD19-spesifik CAR demlenmeye + T hücreleri AAPC üzerine yayılır. T hücreleri SB transpozon bir 2. nesil CAR için kodlama zorlanan ifadesi, belirlenen CD19RCD28, CD28 ve CD3-ε yoluyla sinyalleri aracılığıyla CD19 için belirli işlenir. ** Deneme referans 5'te açıklanan.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transposon ve böyle piggyBac 12,19 ve SB 18,20-22 itibaren transposase sistemleri, klinik grade CAR viral-aracılı transdüksiyon + T hücreleri için bir alternatif olan gen tedavisi olmayan viral yaklaşımlardır. SB insan gen terapisi için potansiyel 1,6,23 dayalı gen aktarım sistemi olarak seçilmiştir. Biz, SB transpozisyon (bir araç tanıtmak için) ve uygun bir TAA-spesifik T hücrelerinin üretiminde platform teknolojileri olarak hizmet etmek için γ-ışınlanmış AAPC arasında yinelemeli eklenmesi (stabil bir şekilde eksprese eden bir ARAÇ genetik olarak modifiye edilmiş T hücreleri almak için) bir çift teknolojiler geliştikçe Faz I / II çalışmaları için cGMP (Şekil 4). Γ-ışınlanmış AAPC üzerine ko-kültür 28 gün (dört adet 7 günlük stimülasyon siklus) sonra, genellikle insan uygulamaları için en az ~ 10 10 genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin uygun oluşturmak edebiliyoruz. Gerektiğinde, yeni stimülasyon çevrimleri t yapılabiliro genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin büyük sayılar üretmek. Daha az CAR + T hücreleri ihtiyaç vardır Bundan başka, eğer, elektroporasyon ve yayılma için geri yaklaşım daha az sayıda ve her bir küvet kullanılarak başlangıcında ileri AAPC üzerinde proliferasyon sonraki tur için sayısal olarak genişletilmiş T hücrelerinin sadece bir alt grubu taşıyan ölçeklendirilebilir Uyarım çevrimi. Çoğunluğu electroporated ve infüzyon stabil CAR ifade için hasat T hücreleri yayılır. CD4 + akıbet ve 2. nesil CAR ifade CD8 + T hücreleri, bellek / naif fenotipe sahip hücreleri içerir ve yeniden yönlendirilen özgüllük üç diğerlerinden ayıran sergilerler. Öncelikle, genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin özellikle ikincisi, CD19 + hedefler lyse CD19 + stimülatör hücreleri yanıt olarak IFN-γ üreten ve üçüncüsü, CD19 yanıt olarak prolifere + besleyici hücreler, bir CAR-bağımlı bir şekilde 13,18 tüm. Integr yaklaşımımızSB sistemi non-viral DNA plazmit elektro transferi ile bir ARAÇ transgen yedi PB ve UCB elde edilen hareketsiz birincil T-hücrelerinde de yapılabilir. Biz ve diğerleri genetik AAPC verimli infüzyon 24,25 T hücrelerinin klinik-yeterli sayıda yayılmasına olarak hizmet K562 hücrelerinde değiştirdiniz. AAPC ve doku kültürü ortamında (örneğin IL-21 ilave) üretmek için modifiye edilmiştir oylandı hasta ve hematopoetik kök hücre nakli sonrası infüzyon için CD19-spesifik T hücreleri (Tablo 1) 13,18 donör kaynaklı. Biz CAR üretebilir + PB alınan T hücreleri sadece maliyet, rahatsızlık, ve aferez ile PB adlı MNC elde rahatsızlıktan önler hangi Damara elde. CAR sayıda + MNC az sayıda alınan T hücreleri türetmek yeteneği özellikle allojenik UCB nakli sonrası T hücreleri kaynaştırmak için itiraz ediyor. Yenidoğan vericinin küçük boyutu ve anonimlik yeniden engeller-Erişen daha sonraki bir zaman noktasında bu bireysel ve hasat MNC sadece sınırlı sayıda hematopoez engellemesini önlemek için, T-hücresi üretimi için başlangıç ​​maddesi olarak kullanılabilir. Üretim sürecine daha fazla gelişmeler de henüz işlemeyi en aza indirmek için tamamen kapalı DALGA biyoreaktör ile birleştiğinde yüksek verimlilik elektroporasyon cihazı yönelik çalışmalara devam edilmektedir. Toplamda, SB ve AAPC platformlar CD19-özgü CAR + cGMP ile uygun olarak alternatif bir hücre-yüzey TAAS tanıyabilir genetik olarak modifiye edilmiş T hücrelerinin büyük bir sayı üretmek için adapte edilebilir T-hücreleri oluşturmak hitap etmektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar yardım SB sistemi ile yardım için AAPC klon # 4 ve Dr Perry Hackett (Minnesota Üniversitesi) üretme ve sağlama Dr Carl Haziran (Pennsylvania Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum.

Hibe desteği: Kanser Merkezi Çekirdek Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward Vakfı; Burroughs Wellcome Fonu; Gillson Longenbaugh Vakfı; Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü; KLL Küresel Araştırma Vakfı; Savunma Bakanlığı; Noelan L. Bibler Estate; Harry T. Mangurian, Jr, Lösemi İmmünoterapi Fonu; Kişiselleştirilmiş Kanser Tedavi Enstitüsü, Lösemi ve Lenfoma Derneği; Lenfoma Araştırma Vakfı; MDACC Kardeş Kurum Ağı Fonu; Miller Vakfı; Sayın Herb Simons, Bay ve Bayan Joe H. Ölçekler; Bay Thomas Scott; Kanser Araştırma Ulusal Vakfı; Pediatrik Kanser Araştırma Vakfı; Üretim assistancWilliam Lawrence ve Blanche Hughes Çocuk Vakfı; Hücresel Tedaviler (PACT) e.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler Satıcı Katalog numarası
Reaktifler
DNA plazmid anlatımla GFP (pmaxGFP) Lonza VPA-1002 (kit)
PBS Sigma D8537
CliniMACS PBS-EDTA Miltenyi Biotec 70026
HyQ RPMI-1640 Thermo Scientific SH30096.01
Fenol Ücretsiz RPMI-1640 Thermo Scientific SH30605.01
Hyclone Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007003HI
GlutaMAX(100x) Gibco 3505-061
Ficoll-Paque GE Healthcare Biosciences 17-1440-02
Rekombinant insan IL-21 PeproTech AF-200-21
Rekombinan insan IL-2 (Proleukin) Novartis NDC 65483-116-07
İnsan T-hücresi Takımı (Nucleofector Çözümü) Lonza VPA-1002
CliniMACS CD56 Reaktif Miltenyi 70206
Insan CD3 için fare mAb için belirli FITC-konjuge BD Biosciences 349201
Insan CD4 için fare mAb spesifik APC-konjuge BD Biosciences 340443
PerCPCy5.5-konjugeİnsan CD8 için fare mAb spesifik BD Biosciences 341051
F (ab ') için spesifik keçi insan antikor 2 fragmanı için PE-konjuge Fcγ Invitrogen H10104
Sodyum Azid Sigma S2002
Sarf
12-plaka Corning 3513
T-75 cm2 şişeye Corning 430641
Kültür çanta Vue Yaşam 290C; 750C
50 ml'lik bir santrifüj tüpüne BD Biosciences 352098
Ekipman
Amaxa Nuceleofector II Lonza AAB-1001
Cellometer Bioscience Nexcelom Cellometer Vizyon
Sorvall Legend RT Santrifüj Sorvall 75004377
BD FACS Calibur BD Biosciences 342975
Kontrollü oranı dondurucu Planya Kryo 750
Işınlayıcının BDT biyo Uluslararası IBL-437 C # 09433
Moleküllerin Anlatım (Endojen ve tanıtılan)
Hücre Hattı Ortak Ad Hücre Tipi Moleküller ifade
CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 Clone 4 K562 CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP zar ile birlikte ifade edilen IL-15 bağlı

Komple Kültür Medya (CCM) (30 güne kadar 4 ° C'de saklanır)
HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640
% 10 FBS
% 1 GlutaMAX

Akım Sitometri Buffer (30 güne kadar 4 ° C'de saklanır)
PBS
% 2 FBS
% 0.1 Sodyum Azid

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood. 116, 1035-1044 (2010).
  2. Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held. Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).
  3. Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. CARs on track in the clinic. Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).
  4. Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).
  5. Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).
  6. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32, 756-767 (2010).
  7. Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies. Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).
  8. Williams, D. A. Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States. Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).
  9. Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes. Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).
  10. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
  11. Izsvak, Z., Ivics, Z. Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy. Mol Ther. 9, 147-156 (2004).
  12. Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).
  13. Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies. Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).
  14. Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).
  15. Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, 849-856 (2011).
  16. Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).
  17. Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity. Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).
  18. Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).
  19. Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).
  20. Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases. Cancer Res. 72, 271-281 (2012).
  21. Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies. Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).
  22. Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes. Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).
  23. Hackett, P. B. Jr, Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies. Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).
  24. Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).
  25. Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells. Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sleeping Beauty TranspozonuT H cresi Genetik ModifikasyonuAk Sitometrisi AnaliziElektroporasyon ProtokolPeriferik Kan T H creleriCAR Ekspresyon AnaliziSitokin Stim lasyon D ng leriGama I nl aAPC

İlgili makaleler