Yöntem makalesi

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

26.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50088

⸱

24 Mart 2013

 ,  , 
1Watson School of Biological Sciences, 2Cold Spring Harbor Laboratory, 3Departments of Medical Genetics, University of Oslo and Oslo University Hospital

Bu makalede

Özet

Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem açıklanmaktadır In vivo Ve tek hücreli çözünürlükte.

Özet

Tümör mikro tümör gelişimini, ilerlemesini metastazı, ve anti-kanser tedavileri için yanıt olarak önemli bir rol oynar. Üç boyutlu ko-kültür sistemleri sık sık ilaç etkileşimleri rolleri içeren tümör-stroma etkileşimleri açıklamak için kullanılır. Bununla birlikte, bozulmamış mikroçevresindeki in vivo olarak meydana gelen etkileşimlere bir çok in vitro tamamen ortamlarda bu da taklit edilemeyen. Böylece, gerçek zamanlı olarak bu süreçlerin doğrudan görselleştirme tedavilere tümör tepkilerinin anlaşılması ve kanser hücreleri ve bu yanıtları etkileyebilir stroma arasındaki etkileşimleri tespit edilmesinde önemli bir araç haline gelmiştir. Burada direkt olarak ilaç dağılımı, kanser hücresi yanıtlarını ve meme kanseri modelinde sistemik tedavi uygulanmasından sonra tümör-stroma etkileşimleri değişiklikleri gözlemlemek için, canlı farelerde anestezi dönen disk konfokal mikroskopi kullanılarak için bir yöntem sağlar. Biz labeli prosedürleri tarifng farklı tümör parçaları, terapötik cevapları gözlemlemek için hayvanların tedavisi ve 40 saat görüntüleme ve tümör dokuları sergilemek için cerrahi işlem. Bu protokol elde edilen sonuçlar ilaç infiltrasyon, kanser hücre ölümü ve stromal hücre göçü gibi süreçler görüntü analiz yazılımı kullanılarak değerlendirilebilir hangi time-lapse film vardır.

Giriş

Tümör büyüme 1 için uygun bir ortam sağlamaya yardımcı kanser hücreleri ve stromal bileşenlerin (hücresel ve hücresel olmayan her ikisi): Solid tümörler iki ana bölmeden oluşmaktadır. Bunlar stromal bileşenlerin meme 2-5 de dahil olmak üzere kanser birçok türleri, gelişimi, ilerlemesi ve yayılımında önemli rol oynamaktadır. Stromal ortam da terapötik cevapları 2,4,5 etkiler. Böylece kanser hücreleri sağlam mikroçevresinin kapsamında geleneksel ve yeni tedavilere yanıt belirleyen kanser biyolojisi hakkındaki bilgilerimizi geliştirerek ve güncel tedavi stratejileri geliştirmek için önemlidir. Ayrıca, kanser hücre-stroma etkileşim tedavi uygulamasını takiben nasıl değiştiğini tanımlayan tümör nüks biyolojisi anlamak için önemlidir.

Organik tip eş-kültür sistemleri tümör-stroma etkileşimleri incelemek için yararlı olmuştur kadar, ancak şu anda mevcut yöntemlerin başarılı bir bağışıklık hücrelerinin vasküler fonksiyon ve yerleştirme açısından özellikle in vitro tümör mikro bozulmamış, tekrarlamak edilemez olduğu aşikardır. Gerçekten de, in vitro olarak görülmektedir tedavileri, kanser hücresi yanıtlarını sık sık mikroçevrede 5 bozulmamış in vivo, gözlenen önemli ölçüde farklı. Böylece, terapötik yanıta tümör-stroma etkileşim ve bunların etkilerini incelemek için in vivo modeller daha iyi klinik mekanizmalar 7 yansıtıyor olabilir.

In vivo anti-kanser tedaviye yanıtları okuyan birincil yolu tümör büyüklüğü ve işlenmiş hayvan veya hastalardan elde edilen dokuların histolojik değerlendirme ölçümleri yoluyla olmuştur. Ancak, son yirmi yılda mikroskopi ve floresan gazetecilere gelişmeler arası ve hücre içi süreçlerin görselleştirme sağlamıştırcanlı, anestezi altındaki hayvanlarda yüksek çözünürlüklü (intravital görüntüleme) 8. Bu intravital mikroskopi teknolojiler ve mekansal hücresel ve hücre altı çözünürlükte 8,9 tümör-stroma etkileşim vivo dinamiği diseksiyon için özellikle değerli olduğu kanıtlanmıştır.

Intravital görüntüleme ile çözülememiştir oylandı Süreçleri anti-tümör T hücre sitotoksik 10,11, T hücreleri ve miyeloid hücreler 12 arasındaki etkileşimleri, terapötik tedavi 13, makrofaj-bağımlı kanser hücresi intravazasyon ve metastaz sonrası kollajen oluşumu ve organizasyon değişiklikleri dinamikleri 14 ve vasküler permeabilite 15.

Intravital görüntüleme için üç önemli gereksinimleri vardır. Bunlar uygun hazırlama ve pozlama dokuların görüntüleme, ilgi doku bileşenlerinin floresan etiketleme ve eşleştirilmiş bir mikroskop kamera s dahilgörüntüleri 16 edinme yeteneğine istem. Bu gereksinimleri gidermek için kullanılan en yaygın stratejiler şunlardır: 1) heterotopik preparatları (örn., kulak veya göz orbita inokülasyonu), kalıcı görüntüleme pencereleri veya dışarıya preparatları (örn., dorsal deri flebi); 2) transgenik floresan gazetecilere ve.. floresan enjektabl doku parçaları etiketlemek için, ve 3) multiphoton veya konfokal mikroskopi sistemleri sırasıyla 9 fotoçoğaltıcı tüpler veya şarj bağlı cihaz (CCD) kameralar ile eşleştirilmiş. Biz floresan gazetecilere kodlayan transgenlerin ifade anestezi altındaki hayvanlarda görüntüleme için inguinal meme bezi göstermek için bir cerrahi hazırlanan flep modeli kullanın. Görüntüler dört lazer iplik diske konfokal mikroskop sistemi 17 ile eşleştirilmiş bir yoğunlaştıkça CCD (ICCD) kamera kullanarak 12 ila 40 saat arasında bir süre içinde alınır. Bu şekilde Görüntüleme bize vivo ilaç dağıtım, evre bağımlı ch gibi süreçleri incelemek için izin verdiemotherapeutic yanıtları, kemoterapiye bağlı hücre ölümü ve miyeloid hücre davranışlarını 5 türü.

Bu anti-kanser terapisi ve meme kanseri fare modellerinde tümör-stroma etkileşimleri için kanser hücresi yanıtı intravital görüntüleme için bir protokol sağlar. Bu protokol, bir tek görüntü oturumda, 40 saate kadar olan süreler için transgenik ve transplantasyon modellerinde hem transjenik ve enjekte edilen floresan etiketler çok çeşitli kanser hücreleri, stromal iki bileşenin davranışı ve ölüm izlemek için kullanılabilir.

Protokol

Anlatılan tüm işlemler yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından önceden onay içeren omurgalı hayvanların kullanımı için kurallar ve düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır.

1. Görüntüleme (Transgenik ya Ortotopik) için Fare Meme Tümörleri oluşturuluyor

  1. GDO'lu fare modelleri kullanarak görüntüleme için meme tümörleri Üret (örn. fare meme tümör virüs uzun terminali tekrar [MMTV]-Polyoma ortasında T antijeni [PyMT] veya SV40 ve sıçan C3 (1) promotor tahrik büyük T antijeni (Tag) [C3 ( 1)-Etiket] modellerde) veya ortotopik nakli modelleri (singenik, allojenik veya Ksenogenik).
  2. Transgenik muhabiri çizgiler (örn. ACTB-ECFP) veya primer kanser hücreleri veya nakli ardından hücre hatları (örn. transdüksiyon) ex vivo manipülasyon kullanımı ile genetik modeller geçerek Etiket kanser hücreleri. Ortotopik nakli, s için bir örnek protokol içinee 18.

2. Tümör Mikroçevre veya Alt-hücresel bileşenleri görselleştirme Bileşenleri

  1. Transgenik etiketleri kullanılarak tümör parçaları görselleştirme. Transgenik muhabiri fareler (örneğin c-FMS-EGFP çekirdeklerinin miyeloid hücreler veya ACTB-H2B-EGFP için) veya nakledilen, etiketli dokuların alıcıları gibi fare kullanımı ile genetik tümör modelleri Crossbreed. Bu, sırasıyla, terapi ya da hücre ölümü ile ilişkili nükleer değişikliklere yanıt olarak kanser hücre-hücre etkileşimleri stromal görüntüleri sağlar.
  2. Enjektabl kullanarak mikroçevrede görselleştirme. Ajanları çok çeşitli (örneğin, fluoresan işaretli antikorlar veya kimyasal boyalar) tümör çeşitli bileşenleri etiketlemek için de kullanılabilir. Boya yarı ömrü ve bir izleme ile ilgilenmektedir yanıt bağlı olarak, enjekte edilebilir görüntüleme başlamasından önce tatbik edilebilir ya da görüntüleme oturumu sırasında intravenöz (iv). Veya int ya daraperitoneally (ip., Şekil 1).

3. Mikroskoplar ve Görüntüleme Yazılımı

  1. Mikroskop. Mikroskop sistemleri ve yazılım çeşitli canlı farelerde görüntüleme için de kullanılabilir. En yaygın olarak kullanılan sistem konfokal mikroskop ya da multiphoton vardır. Biz bir ICCD kamera (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Fotonik, Palo Alto, CA) ile bir mikro-mercekli iplik diski konfokal mikroskop (Solamere Teknolojileri, Salt Lake City, UT) kullanın.
  2. Görüntüleme yazılımı. Biz açık kaynak yazılım μManager (Vale Lab, University of California, San Francisco [UCSF]) kullanın.
  3. Görüntü analizi. Biz görüntü analizi için Imaris (Bitplane), Volocity (Perkin Elmer) ve ImageJ (Sağlık [NIH] Ulusal Enstitüsü) kullanın.

4. Görüntüleme için Hayvan (Ön) tedavi

  1. Kasık meme tümörlerinde uzun çap pergeli kuv tarafından yaklaşık 8 mm veya daha az ölçer zaman bizim protokolünü kullanarak görüntüleme için optimum olanement.
  2. Deney için gerekli olan küçük bir moleküldür inhibitörü, terapötik antikor veya kemoterapötik ilaçla tedavi görüntüleme hayvanlar için, görüntüleme sırasında öncesinde veya tedavi başlar. Görüntüleme (Film 1 ve 2) başlatıldıktan sonra kemoterapötik madde doksorubisin ile indüklenen hücre ölümünün en görüntüleme (Filmler 3 görüntüleme 24 saat sonra başlayarak, ya da ilaç tedavisinden sonra çekilir Örneğin, ilaç ekstravazasyon ve dağıtım görüntüleme, uygulama gerektirir ve 4).

5. Görüntüleme sırasında Hayvan hidratasyonu ve Kan Ozmolarite bakımı için Saline hazırlanması

  1. Bir 1 ml enjektöre 1x PBS yaklaşık 1 ml çizin. Propidium iyodür (PI, Invitrogen, 1 mg / ml seyreltilmiş 1:15) periyodik olarak görüntüleme oturum sırasında (ip). Tatbik edilecektir bu çözeltiye ilave edilebilir. Bu geçirgen hücre zarları vardır ölü veya ölmekte hücrelerin çekirdekleri görüntüleme için izin verir. PI çok kısa bir hal varVaskülatürde f-ömür ve bu nedenle görüntüleme oturum boyunca tekrar uygulanmalıdır.
  2. Bu şırıngaya kanatlı infüzyon seti (23 gauge, ¾ inç iğne, 12 inç boru) takın ve salin solüsyonu çıkar bir damla kadar tüp yoluyla çözümü itin hortumun ucunda iğne ucu.
  3. Infüzyon seti ve uygun tuz solüsyonu ile doldurun ondan şırıngayı çıkartın.
  4. Hattına kabarcıkları tanıtmak için özen, infüzyon seti için şırınga yeniden takın.

6. İzofluran Anestezi Sistemi Hazırlanması

  1. Nebulizer kadar su ekleyin ve yerine vidalayın. Bu, hayvan için verilen gazların nemlendirmek akciğer tahriş olmasını önler ve uzun süreli anestezi altında hayvanların hayatta kalma uzatır.
  2. Üst satırına izofluran deposunu doldurun. DİKKAT: İzofluran yine araştırmacı etkileyebilir güçlü bir anestezik. Uygun vakum sistemleri b gerektiğifazla gazların alan kaldırılır sağlamak için yerinde e.
  3. Oksijen tankı ve nitrojen tankları hem açın ve akışını ayarlamak. Oksijen 0.2 L / dakika (~% 21) etrafında olmalıdır iken azot, yaklaşık 1.0 L / dakika olmalıdır.
  4. (In-house) vakum açın. Vakum 1.2 L / dak ilgili olmalıdır.
  5. Indüksiyon odasına anestezi hattı açık olduğunu onaylayın ve cerrahi alan hatları ve mikroskop kapalıdır.
  6. Anestezi sisteme bağlı lateks solunum torbası şişirilmiş olduğundan emin olun. Torba şişirmek değilse, değiştirin.
  7. Mikroskop sahne ve cerrahi platforma anestezi teslim burun konileri her birinde kauçuk diyafram kontrol edin. Kauçuk ince başlıyor, değiştirin.

7. Cerrahi Aletler ve Cerrahi Platformu hazırlanması

  1. Sıcak boncuk sterilizatör açın ve> 200 ° C ulaşmak izin
  2. Sabun ve su ile yıkanır cerrahi aletler(Bir forseps çifti [tercihen dişleri] ve hayvan deri yoluyla kesmek için makas, forseps bir çift [tercihen tırtıklı] ve tümörün daha fazla maruz kalma makas).
  3. Sıcak boncuk sterilizatör (alternatif olarak, cerrahi aletler önceden otoklava sokulabilir) kullanarak en az 30 sn için cerrahi aletler sterilize.
  4. Sterilize aletler kontamine olmasını önlemek için emin yaparken cerrahi aletler serinlemek edelim.
  5. Strafor nakliye soğutucusu için kapağı toplayın. Bu cerrahi platform olacak.
  6. Strafor kapağın üst (yeterince kapsayacak şekilde) bir laboratuvar Sağanak bir parça yerleştirin.
  7. Eke dayalı laboratuvar bant ile laboratuar Sağanak (1 anestezi sistemindeki bir çizgi ile burun konisi "teyp iyi burada çalışıyor). Bir 18 G x1 ½ takın" tutmak için burun konisi her iki tarafında strafor kapak içine bant yoluyla iğne burun konisi yerine sabitlenmiş.
  8. Betadin, steril gazlı bez, iki% 70 izopropanol mendil, bir mikroskop kenaralaboratuvar bant slayt, Krazy Glue ve 4 adet (½ "width).

8. Mikroskop hazırlanması

  1. Mikroskop, kamera ve mikroskop çalıştıran bilgisayarı açın.
  2. Isıtma battaniye açın.
  3. Bir inverted mikroskop kullanılacak ise, ısmarlama bir sahne eklemek inguinal meme bezlerinin konumuna karşılık görüntüleme port ile dizayn edilmelidir. Aşamasında sabun ve su ve kuru ile iyice yerleştirin temizleyin. Görüntüleme portları üzerinden cam kapak (# 1.5 kalınlık) sabitleyin ve% 70 izopropanol ile tüm yüzeyi temizlemek için (½ "iyi çalışır) laboratuar bandı kullanın. Kirlenmeye karşı korumak için steril gazlı bez ile sahne örtün. Aşamasında sahne koyunuz ve havayla kurumaya olanak tanır.
  4. Laboratuvar bant 4 ila 6 adet (1 "width) Tear, yaklaşık 6 santim uzunluğunda ve mikroskop tarafına ekleyebilirsiniz. Bandı Bu parçalar hayvana burun konisi teslim anestezi konumlandırmak için kullanılacak bird, yerine sabitleyin.
  5. Uzunluğunda bir inç hakkında olan bant iki adet (½ inç genişlik) Tear. Bunlar, fare ve yerinde tümör ortaya çıkarmak için kullanılan mikroskop slaydı için PBS teslim kelebek iğne tutmak için kullanılır.

9. Görüntüleme için Kasık Meme Bezi merceğin

  1. Taşıyıcı gaz olarak% 21 oksijen ve denge azot (yaklaşık 1.0 L / dk akış hızı) ile izofluran% 4 kullanılarak indüksiyon odasında hayvan uyutmak. Bu 2-4 dakika sürer.
  2. Yukarı bakacak ventral yüzeyi, derin ve yavaş nefes kez cerrahi platformuna fare aktarın. Cerrahi platforma anestezi satırı açın ve sonra anestezi sisteminde çok yüksek basıncı önlemek için bu sıraya göre indüksiyon odasına anestezi hattı kapatın. Şu anda 4% 2,5 'den% izofluran konsantrasyonu azaltın.
  3. Hayvan yeterince Anes olduğunu onaylamak için refleks pedalı geri çekme kontrolbir haydut tutam gerçekleştirerek cerrahi prosedür için thetized. Bu haydut tutam (örn. seğirme veya kuyruk kıvırmak) tepki vermezse hayvan yeterince anestezi olduğunu. Hayvan haydut tutam tepki vermezse, izofluran konsantrasyonu artırır.
  4. Laboratuvar bant ile cerrahi platformu (½ "teyp bunun için iyi çalışır) fare uzuvlar sabitleyin.
  5. Hayvan cerrahi platformu için güvenli olunca (isteğe bağlı), bir saç elektronik makinesini kullanarak, ventral yüzeyi çıkarılabilir. Kimyasal epilasyon tercih edilirse, bu cerrahi öncesinde 24-48 saat yapılmalıdır. Sokak kıllar güçlü ve akut immün yanıtları uyardığı gibi ameliyat öncesi saç çıkarma, görüntüleme sitenin kirlenmesini önlemek için yardımcı olur.
  6. % 70 izopropanol mendil ve betadin ile hayvanın ventral yüzeyi dezenfekte.
  7. Steril makas ve forseps (diş ile) ilk çifti kullanarak, subkutan ventral orta hat kesi yapmakki yukarıdaki üretra ~ 3 mm kılıç şeklinde olan işlem ile çalışır. Delinme veya periton yoluyla kesilmesini önlemek için dikkatli olun.
  8. Steril makas ve forseps ikinci çifti kullanma (tırtıklı), yavaşça periton boşluğundan, ekli inguinal meme bezi ile deri ayırın.
  9. Bir cam mikroskop slayt atın ve önceki adımda oluşturulan flep karşı konumlandırmak. Fare sahne üzerine yerleştirilir sonra tümör hacim düz oturacak ve arka bacak hareketlilik ile girişimi olmayan bir şekilde kayar yerleştirin.
  10. Mikroskop slaydı uygun bir şekilde yerleştirildikten sonra, yapıştırıcı (örn., Krazy Tutkal) kullanarak derinin dış yüzeyine kayar ekleyin.

10. Sahne Alanı'nda Fare konumlandırılması

  1. Cerrahi platformuna hayvanın uzuvları güvence laboratuar bandı çıkarın.
  2. Mikroskop sahne anestezi satırı açın ve anestezi kapatınbu sırada cerrahi platformu sia hattı.
  3. Hızla mikroskop sahne hayvan aktarın.
  4. Hayvan, pozisyon aktarılır ve anestezi hattı ve fare anestezi kalır ve rahat bir konumda olmasını sağlamak için düzgün bir burun konisi (örn. Laboratuar bandı kullanarak) sabitleyin edildikten sonra.
  5. Bu üst ve mikroskop aşamasında, cam kaplı görüntüleme bağlantı noktalarından birinin merkezine yerleştirilmiştir ki böylece tümör Açığa.
  6. Göz mercekleri kullanarak tümörün doğru konumlandırılmış, ve yavaşça bandı mikroskop slayt aşağı olduğunu doğrulayın. Dokuya kan akımı engellenmeyecek şekilde slayt gevşek emniyete alınması gerekir. Mikroskop slayt aşağı Bantlama hayvanın nefes tarafından tanıtıldı görüntüleme eserler en aza indirmek için yardımcı olur.
  7. Kanatlı infüzyon 5. altında hazırlanan steril salin ya da 1 x PBS, (isteğe bağlı olarak örneğin PI gibi bir boyasını içeren) içeren 1 ml'lik şırınga ile eklenmiş seti ile kalıcı intraperitoneal çizgi yerleştirin. Enj100 ul ip ile hayvan ect. satırı eklenir. Bu kez noktadan görüntüleme oturumun sonuna kadar, 1 saat aralıklarla (ya da PI ile salin 25 ul her 30 dk) salin 50 ul hayvan enjekte.
  8. Hayvanın hayati işaretleri takip etmek, (Starr Yaşam Bilimleri, Inc örneğin MouseOx sistemi) 19 oksimetre prob ekleyin.
  9. Hipotermi önlemek için ısıtma battaniye ile fare örtün.

11. Görüntüler Edinimi

Açık kaynak yazılım μManager (Vale Lab, UCSF) time-lapse görüntüler elde etmek için kullanılır. Ham veri Imaris (Bitplane) yazılım derlenmiş, ve (örneğin Volocity [PerkinElmer] veya ImageJ [NIH]) bağımsız gözlemci tarafından el attı, ya da Imaris veya diğer görüntü analiz yazılımı analiz edilebilir.

12. Ötanazi

Görüntü oturum (1-4 sonunda0 saat), analiz süreci türüne bağlı olarak, hayvan ötenazi edilir.

  1. Isofluorane konsantrasyonu% 4'e yükselmiştir.
  2. Nefes yakalar ve sonra sahneden kaldırıldıktan sonra hayvan 30 sn kadar görülmektedir.
  3. Servikal dislokasyon hayvan ötenazi yapılmış olmasını sağlamak için yapılır.

13. Temsilcisi Sonuçlar

Bu tümör terapötik tedaviyi takiben hücre ölümü ve hücre ölümüne 5 yanıt olarak tümör-stroma etkileşimleri ulaştıktan sonra bu yöntem kullanılarak intravital görüntüleme tümörler, ekstravazasyon ve ilaç dağıtımı için ilaç taşıyıcı da dahil olmak üzere çeşitli süreçleri, doğrudan görüntüleme için olanak sağlar. Görüntüleri elde edilirken tümör dokularına ekstravazasyon ardından tümörü ve dağıtım için bir ilacın varış gözlemlemek için, hayvan enjekte edilir. Rağmen ch çeşitli sınıflaremotherapeutics (örneğin, doksorubisin gibi) zayıf bir şekilde floresan, pek çok değildir. Fluoresan ile konjuge dekstranlar dokulara ilaç dağıtım ve yayılması için taşıyıcı belirteç olarak da kullanılabilir. Şekil 2 ve Film 1 bir floresein-izotiyosiyanat (FITC)-konjuge iv enjekte 2 AD dekstran (Invitrogen, 1 mg / ml 1xPBS) gelişini göstermektedir. ACTB-ECFP fare; bir MMTV-PyMT bir tümör içine.

Tümör içine ilacın gelmesini takiben, dokular arasında ekstravazasyon ve difüzyon bir ilaç ve ilaç dağıtım 5 her iki damar içi yarı-ömrü açısından görüntülenebilir. Film 2 iv enjekte Alexa Fluor-647-konjuge 10 kD dekstran (Invitrogen, 1 x PBS içinde 1 mg / ml) ve ekstravazasyonu dağılımını göstermektedir. ACTB-ECFP;; görüntüleme sırasında c-FMS-EGFP fare C3 (1)-Tag içine. Imaris (Bitplane) in time-lapse film Derleme sonra, intravasküler yarılanma ömrü ve ilaç dağılımı ölçülür. Damar içi yarı-ömrü ölçmek için,, Her zaman bir noktada tümör kan damarlarında ortalama floresan yoğunluğu hesaplanmış ve zamana karşı çizilmiştir. İlaç dağıtım ilaç için pozitif total tümör alan başına yüzde alanı olarak ölçülür.

Tümörler için ilaç teslim kinetiğini takip ek olarak, tümör tedavisine tepkiye belirlemek için sık sık önemlidir. Anti-kanser tedavileri hücre ölümünü teşvik etmek için beklendiği gibi, propidyum iyodür (PI), boyama ya da nükleer yapısal değişiklikler ilaç kaynaklı hücre ölümü 5 bir işaretleyici olarak kullanılabilir. Şekil 3, bir MMTV içinde sitotoksik kemoterapötik doksorubisin tümör cevabını göstermektedir -PyMT; ACTB-ECFP, c-FMS-EGFP fare. Bu üçlü transgenik MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-FMS-EGFP hayvan ECFP etiketler meme kanseri hücreleri (mavi) ve EGFP etiketler miyeloid hücreler (yeşil). Görüntüleme başladı ve PI t boyunca ip teslim edilmeden önce bu oturum sırasında görüntülü hayvan doksorubisin 18 saat verildio yukarıda anlatıldığı gibi görüntüleme oturumu. Kanser hücreleri (ACTB-ECFP etiketleme) gibi mavi görünür, ve ölü veya ölmekte olan hücreler kırmızı (PI boyama) olarak görünür. Burada sunulan zaman zaman boyunca seri doksorubisin-bağımlı hücre ölümü endüklenmesini gösterir. Tümörlerde hücre ölümü indüksiyon ölçmek için, ilaç dağılımını belirlemek için kullanılan analiz ile aynı tip kantitatif çıktı PI için pozitif olan toplam tümör alanı başına yüzde alandır kullanılır.

Yüksek büyütme Görüntüleme kanser hücreleri 5 geçmesi hücre ölümü tipine ilişkin bilgiler sağlayabilir. Film 3 doksorubisin sistemik tedavisi için yanıt olarak apoptotik hücre ölümü tipik nükleer değişiklikleri izlemek için bir görüntüleme deneyin sonuçlarını gösterir. Çekirdekler görselleştirmek için, bu oturum sırasında görüntülü hayvan yerine c-FMS-EGFP muhabiri ACTB-H2B-EGFP muhabiri barındırır, kanser hücrelerinin çekirdekleri yeşil etiketli böylece. Bu MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP hayvan adm olduinistered doksorubisin (8 1 mg / kg x PBS) önceki filmin başlangıç ​​ve PI (Invitrogen, 1 mg / ml solüsyon 1:15 seyreltilmiş) içeren 1 x PBS saatlik enjeksiyonu ip 24 saat. Kanser hücrelerinin çekirdeklerinde yapısal değişiklikler nekroz (nükleer morfoloji minimal değişiklikleri görüntülemek PI-pozitif hücreler) geçirmiş hücreleri yanında bir apoptotik hücre görülebilir. Apoptotik hücre Çekirdekler sonunda PI alımı boyanması (gösterilmemektedir) bağlı olarak kırmızıya dönüştü. Nekrotik ve apoptotik olayların sayısı PI-pozitifliği ve nükleer morfoloji dayalı her zaman noktası için elle ölçülür.

Kanser kemoterapi ile indüklenen hücre ölümü sık sık tümörler 2,4,5 içine bağışıklık hücrelerinin bir reaktif alımı ile sonuçlanır. Şekil 4 ve doksorubisin akut tedavisi için bu stromal cevap bir örneğini göstermektedir. MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP hayvan burada görüntülenmiştir doksorubisin (8 1 x PBS içinde mg / kg) ip enjekte edilmiştir . yaklaşık 20 saat önce görüntüleme başlangıç ​​ve saatlik PI enjeksiyonları ip aldı için. hücre ölümüne görselleştirmek için deney süresince. Kez doksorubisin tedavisinden sonra saat sayısını temsil belirtilir ve ölçek çubuğu 100 mikron temsil eder. Bu deneyde, miyeloid hücreler hücre ölümü alanları içine sızmakta gibi beyaz oklar ile gösterilir. Doksorubisin yönetimi, kantitatif çıkış EGFP için olumlu total tümör alanı başına yüzde alandır ilaç dağıtım ve kemoterapi tümör yanıtı belirleyen, kullanılan kullanılan analiz aynı tip izleyerek tümörlerinde miyeloid hücre infiltrasyonu ölçmek için.

Kemoterapi için genel stromal yanıt görüntülemeye ek olarak, özel stromal yanıtları da 5 görselleştirilebilir. Film 4 komşu bir hücre tarafından nekrotik hücre malzemenin fagositozu göstermektedir. Kırmızı nükleer madde bir larg olan bir hücre tarafından yutulur edilen görülebilirmakrofajlar tipik olan e bozulmamış yeşil çekirdek. MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, bu oturum sırasında görüntülenmiştir ACTB-H2B-EGFP hayvan doksorubisin (1 x PBS içinde 8 mg / kg) ip enjekte edilmiştir. Film başlamadan önce 24 saat. Hayvan 1 x PBS içeren PI (Invitrogen, 1 mg / ml solüsyon 1:15 seyreltilmiş) saatlik enjeksiyonu uygulandı. Çekirdekler (ACTB-EGFP etiketleme) yeşil olarak görünür, ancak hücre nekrozu geçmesi gibi kızarır.

figure-protocol-1
Şekil 1. Transgenik ve enjektabl etiketleri kullanarak farklı tümör bileşenlerinin örnek etiketleme Bu üçlü-transgenik MMTV-PyMT olduğunu;. ACTB-ECFP, c-FMS-EGFP hayvan kanser hücrelerinin ECFP ve miyeloid hücrelerin ifade ile mavi etiketli olduğu etiketlenmektedir miyeloid özgü promotörü EGFP ifade ile yeşil. Hayvan sırasında (PI, kırmızı, 1x PBS ~ 0.07 mg / ml) propidium iyodür ile enjekte edildigörüntüleme oturumu hücre ölümü görselleştirmek için. PI etiketler DNA ancak ölü veya ölmekte hücrelerin hücre zarının geçer. Ölçek bar = 100 mikron.

figure-protocol-2
Şekil 2. Tümörlerde İlaç ekstravazasyonu ve dağıtımı Bu çift transgenik MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP hayvan kanser hücrelerinin ECFP ifadesi ile mavi etiketli olduğu nasıl görselleştirmek için görüntüleme oturumu sırasında FITC-konjuge 2 MD dekstran (yeşil) enjekte edildi ilaçların iv enjeksiyonu (mavi) sonra tümörler ulaşır. Görüntüleme başlatıldı sonraki süre belirtilir. Ölçek bar = 100 mikron.

figure-protocol-3
Şekil 3,. Sistemik tedaviye Kanser hücre yanıtı. Bir MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-FMS-EGFP hayvan kemoterapötik ile tedaviönceden görüntüleme ilaç doksorubisin ve PI ile enjekte (kırmızı, 1x PBS ~ 0.07 mg / ml) hücre ölümünü etiketlemek için. Bu resim serisi hücre ölümü aşağıdaki Doksorubisin tedavisi indüksiyon temsil zamanla PI boyama (gibi beyaz oklarla gösterilen), birikimini göstermektedir. Doksorubisin tedavisinden sonra saati Saat endikedir. Görüntüler z ekseninde bir z-yığınını içeren üç görüntülük maksimum yoğunluğu projeksiyonları vardır. Ölçek bar = 100 mikron.

figure-protocol-4
Şekil 4'e. ACTB-ECFP;; bir MMTV-PyMT kemoterapiye Miyeloid hücre yanıtı. Önceden görüntüleme doksorubisin 20 saat yönetilen c-FMS-EGFP üçlü transgenik fare hayvan saatlik ip aldı. PI enjeksiyonları (kırmızı, ~ 1x PBS içinde 0.07 mg / ml) ölü hücrelerin etiketlemek için. Bu resim serisi doxorubi takiben zamanla EGFP pozitif myeloid hücrelerde (gibi beyaz oklarla gösterilen) birikimi gösterircin tedavi. Bu reaktif bağışıklık yanıtı 4,5 kemoterapiler çeşitli sınıflar için terapötik tepkiye engel olduğu gösterilmiştir. Doksorubisin tedavisinden sonra saati Saat endikedir. Görüntüler z ekseninde bir z-yığınını içeren üç görüntülük maksimum yoğunluğu projeksiyonları vardır. Ölçek bar = 100 mikron.

Film 1. . Kanser hücrelerinin ECFP ifadesi ile mavi etiketli olduğu ACTB-ECFP hayvan; tümör şeklinde İlaç dağıtım Bu bir çift transgenik MMTV-PyMT olduğunu. Hayvan ilaç iv enjeksiyondan sonra tümörleri nasıl ulaşacağını görselleştirmek için görüntüleme oturumu sırasında 2 MD FITC-konjuge dekstran (yeşil) enjekte edildi. Ölçek bar = 100 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın .

Film 2. Tümör doku içine ilaç sızma bir üçlü transgenik C3 (1)-Tag;. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP hayvan kanser hücreleri la olduğu,ECFP ve EGFP ifadesi ile yeşil etiketli miyeloid hücrelerin ifade ile mavi Beled Alexa Fluor 647-konjuge 10 kD dekstran (kırmızı) ile iv enjekte edildi. Görüş alanı derhal dekstran ile enjeksiyon sonrası gösterilir. Dekstran başlangıçta damarlar, hızla tümör dokusu içine ekstravaze, ve son olarak makrofajlar tarafından alınır etiketler. Ölçek bar = 100 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın .

Film 3. . ACTB-ECFP;; kemoterapiye bağlı hücre ölümü sonrasında nükleer değişiklikler Bu üçlü transgenik MMTV-PyMT görüntülenmesi H2B-EGFP hayvan görüntüleme öncesinde doksorubisin enjekte edildi. Olarak H2B-EGFP füzyon proteini ekspresyonu tarafından izlenen Nükleer morfolojisi (yeşil), sağ üst köşedeki hücreye görüldüğü gibi apoptoz tipik kemoterapi ile indüklenen nükleer yapısal değişiklikler direkt görüntülenmesini sağlar. Hayvan receyarım saatlik ip IVED. ölü ve ölmekte olan hücrelerin etiketlemek için görüntüleme oturumu süresince PI (kırmızı) enjeksiyonları. Zaman doksorubisin tedavisi +24 saat sonra zamanı olduğunu belirtti. Görüntüler yüksek büyütme objektif lens (40x, NA 1.1, su lens) kullanılarak elde edildi. Ölçek bar = 15 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın .

Film 4. Nükleer değişiklikler ve kemoterapiye bağlı hücre ölümü sonrası ölü hücre malzeme alımı Görüntüleme Bu üçlü transgenik MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP hayvan görüntüleme öncesinde doksorubisin enjekte edildi. Olarak H2B-EGFP füzyon proteini ekspresyonu tarafından izlenen Nükleer morfolojisi (yeşil), kemoterapi ile indüklenen nükleer yapısal değişiklikler direkt görüntülenmesini sağlar. Hayvan yarım saatlik ip aldı. ölü ve ölmekte olan hücrelerin etiketlemek için görüntüleme oturumu süresince PI (kırmızı) enjeksiyonları. Görüntüler elde edildiBir yüksek büyütme objektif lens (40 x, ​​NA 1.1, su lens) kullanarak. Öncesi PI ve GFP sinyali nükleer morfoloji ve kaybı değişikliği ile etiketleme için önemli yapısal değişikliklerin olmaması nekroz benzeri hücre ölümü göstergesidir. Ölü malzeme makrofajlar tipik büyük bir çekirdek, bir hücre tarafından götürülüyor görülmektedir. Zaman doksorubisin tedavisi +24 saat sonra zamanı olduğunu belirtti. Ölçek bar = 10 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın .

Tartışma

In vivo sistemik tedavilere tümörlerin yanıtları mikroçevrede akut yanıt ve nüks 5 hem etkiler olarak, in vitro kanser hücrelerinin olanlara ölçüde farklı olabilir. Vivo kemoterapi yolaklardaki açıkladıktan sonra büyük engellerden biri kanser hücreleri ve onların mikroçevrede arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı. Özellikle, katı tümörlerin ve kanser gibi anti-kanser tedavisi sırasında ortaya çıkan hücre ölümü olarak stromal hücreler, bir bileşenin bozulması arasında bir denge gelişmiş olduğundan, doku organizasyon üzerinde dramatik etkileri de neden olabilir.

Burada sağlanan intravital görüntüleme tekniği anti-kanser ilaçlar ile tedavi sırasında canlı, anestezi farelerin tümörleri içinde kanser hücre-stroma etkileşimlerinin doğrudan görselleştirme sağlar. Biz (17 bkz göreceli sınırlı penetrasyon derinliği vardır iplik Disk konfokal mikroskopi, kullanın sup, ancak ameliyat ve etiketleme teknikleri mikroskopi diğer türleri ile de kullanılabilir. Bu deneylerden elde Filmler floresans şiddetindeki değişiklikleri (örneğin hücre ölümü etiketli nüfusu veya indüksiyon infiltrasyonu nedeniyle), hücre hareketi, enjektabl dağılımı (vasküler sızıntı izlemek için örneğin), ve eş-dahil süreçleri izlemek için kullanılabilir floresan sinyalleri 5,12,17,20 lokalizasyonu.

Biz rutin görüntü 6 saatten fazla fareler ve 18 saat boyunca da yapılan görüntüleme. Bu bu uzun süreler için sürekli anestezi altında fareler bakımını gerektirir. Uygun anestezi ile, bizim hayvanların% 90 üzerinde 6 saat ayakta, ve yaklaşık% 80 18 saatten fazla yaşayamaz. Uzun süreli anestezi nasıl gerçekleştirileceği ile ilgili ayrıntılar daha önce 19 yayınlanmıştır. Bizim tecrübelerimize göre, beş faktör kritiktir: u, hipotermi kaçınarak dehidratasyon kaçınarak, fizyolojik kan oksijen doygunluk seviyelerini muhafazaizofluran için nemlendirilmiş taşıyıcı gaz şarkı, ve ağrı belirti görünmüyor hangi anestezinin en düşük düzeyde hayvanları tutmak. Vücut ısısını korumak için, biz (38 ° C'de) ısıtmalı battaniye altında fare tutmak. Dehidratasyon önlemek için, tüm görüntüleme işlemi boyunca salin ip küçük hacimleri enjekte. Fizyolojik kan oksijen doygunluğu seviyesini korumak için, taşıyıcı gaz (yerine yaygın olarak kullanılan% 100 fazla)% 21 oksijen ile başlar. Saat bir deneme içine - - Bu bize bir fare eğer inhale oksijen seviyelerini artırmak için sağlayan kan oksijen doygunluğu bir azalma gösterir. Bizim tecrübelerimize göre, bu zamana (% 30-40 gibi) de inhale oksijen düzeyini artırmanın hemen hemen her zaman ek görüntüleme saat için izin hayvan stabilize edecek. Anestezi optimal düzeyde 60-65/min ve 400-450/min nabız oranları nefes oranları% 1-1.5 izofluran ve sonuçları ile elde en fareler içindir. Bizim görüntüleme deneylerinde, öncelikle transgenik fare modeli kullanıns (MMTV-PyMT ve C3 [1]-Tag) hangi tümörlerin tek bir görüntüleme oturumu sırasında birden çok x, y pozisyonlarında paralel tümör progresyonu farklı aşamalarında birden fazla lezyon görüntüleme için izin multifokal vardır. Bu aşama bağımlı terapötik cevapları tespitine yönelik deneylere göre fare-to-fare varyasyon ilişkin kaygıların azaldığı ve görüntüleme için gerekli hayvan sayısını azaltır.

Intravital görüntüleme sırasında yapılabilir tümör lezyonlarının patolojik evreleme az detaylı farklıdır, ve her ne kadar MMTV-PyMT modeli (ve diğer spontan kanser modelleri) daha, intravital görüntüleme sırasında fark edilebilir ilerici histopatolojik aşamalardan geçer histolojik kesitler 5,17. Kanser hücreleri genellikle ilerlemiş tümörler izole olarak tersine, transplantasyon modelleri, en geç evre tümörlerde yansıtma eğilimindedir. Böyle bir model, böylece tümör-stroma eğitim için daha uygundurlarfarklı aşamalarında arasındaki bu etkileşimler farklılıkları daha geç evre tümörlerde etkileşimleri.

Biz nasıl tedavi ile indüklenen hücre ölümü sonrası meydana görüntü nükleer yapısal değişikliklere ilişkin örnekler göstereceğiz. Anti-kanser tedavisi yokluğunda, bu strateji etiketleme yerine durulaştırmada, in situ görüntü hücre bölünmesi için kullanılabilir, örneğin, hücre proliferasyonu ve uyuşukluk mikroçevrede tarafından nasıl etkilenir. Gelecekte, mitokondriyal bileşenlerin fluoresan etiketleme apoptotik hücre ölümü esnasında meydana gelen görüntü mitokondriyal değişiklikler mümkün kılabilir.

Bu protokolde, biz de diğer microenvironmental bileşenleri de görüntülenebilir ve görüntülü olabilir nasıl tedavi sonrası görüntü kanser hücre-immün hücre etkileşimleri, ancak örnekler göstermiştir. Stromal bileşenleri için mevcut transgenik muhabiri çizgiler (örneğin., FSP1-EGFP 17, αSMA-TTT 21, COL1A1-EG fibroblastlar için olanlar dahilFP 21) ya da damar hücrelerinde (örn. TIE2-GFP 22; VEGF-GFP 23).

Intravital görüntüleme in vivo aşağıdaki kemoterapi yönetiminde meydana gelen etkileşimlere ve süreçlerin gerçek zamanlı görüntüleme sağlar. Teknolojisi mevcut, biz terapötik yanıtı nasıl etkilediğini miyeloid hücreler anlaşılmasında önemli ilerleme kaydettik; tümör mikro çok karmaşık çünkü ancak, önemli gelişmeler halen çevre aracılı ilaç direnci yatan süreçlere mekanistik defterleri başlamak için ihtiyaç vardır. Hala gerekli en önemli gelişmeler biri belirli bir hücre popülasyonu daha iyi belirleyiciler tanımlanmasıdır. Iyi belirteçlerin önemi de meme tümör mikro, fibroblastlar ve bağışıklık hücrelerinin en önemli stromal hücre bileşenlerinin iki gösterilmiştir. α-düz kas aktin (αSMA) sık tanımlamak için kullanılırfibroblastlar, fakat protein aynı zamanda, vasküler düz kas hücreleri ve myoepitelyal hücreleri 24 ile ifade edilir. ΑSMA-GFP muhabiri fareler mevcut olmakla Böylece, belirli bir hücre tipi belirlemede intravital görüntüleme deneme sırasında aşağıdaki olmak zordur. Benzer şekilde, c-fms promotörü altında ifade edilen bu tür EGFP gibi tek bir floresan işaretleyici sık sık 12,17 bağışıklık hücrelerinin çoklu alt popülasyonlar tespit edecektir. Biri ideal belirli bir hücre tipi tanımlamak için tek bir belirteç kullanmak istiyorum rağmen Böylece, temel biyoloji karmaşıklığı Bu yaklaşımı kullanarak önemli bir sorun teşkil etmektedir.

Bu problemin bir çözüm kısmi daha fazla aynı flüoresan raportör salgılayan hücrelerin alt popülasyonlar ayırt etmek için enjekte edilebilir etiket kullanmaktır. Örneğin, floresan dekstranlar makrofajlar tarafından alınır ve c-fms-EGFP ve Fsp1-EGFP raportör transgenik fareler ile etiketlenir makrofaj subpopülasyonunun etiketlemek için kullanılabilirler 17. Flüoresan millerine konjuge antikorlar da belirli altgrupları (c-FMS-EGFP muhabiri 17 etiketli miyeloid hücrelerin Gr1-pozitif nüfus gibi) tanımlamak için kullanılır olmuştur.

Nasıl ya da neden tümörlerin hayvanların büyük kohort gerektiren farklı zaman noktalarında hasat dokularından elde edilen idare terapötik veya histolojik serisi cevap hakkında az mekanistik bilgi vermek kumpas ölçümü, tarafından oluşturulan tümör yanıtı eğrileri aksine, bizim teknik doğrudan, ölçülebilir bilgi sağlar hücre ölümü dinamikleri ve küçük gruplarda kanser hücreleri ile stromal hücrelerin etkileşimleri. Bu nedenle, burada rapor edilen prosedür kullanılarak bir avantajı, gerçek zamanlı olarak bir dokunulmamış tümör mikro bağlamında ilaç etkileşimleri ile ilgili bilgi sağlar dinamik olmasıdır. Bu bilgiler 5 terapötik cevapları sürücü yatan süreçleri önemli bakışlar yol açabilir </> Sup.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek hiçbir çıkar çatışması var. Tüm hayvan deneyleri IACUC onaylanan protokoller çerçevesinde yapılmıştır.

Teşekkürler

Biz teknik destek için J. Cappellani ve J. Qiu ederim. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (U01 CA141451), Starr Kanser Konsorsiyumu, Cure için Susan G. Komen, Meme Kanseri, ME Meme Kanseri Karşı Manhasset Kadın Koalisyonu Mücadele Long Island 2 Günü Yürüyüşü'ne ve fon tarafından desteklenen Congressionally Yönetmen Meme Kanseri Araştırma Programı öncesi-doktora bursu, ESNESN ABD ayrıca Biyolojik Bilimler Watson Okulu Leslie C. Hızlı ve William Randolph Hearst Vakfı Bursu sahibidir. HAA Norveç Araştırma Konseyi (160698/V40 ve 151.882), ve Güneydoğu Bölgesel Sağlık Yetkililer (2.007.060) fonları tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif
MMTV-PyMT farelerde Jackson Laboratuvarı 2374
C3 (1)-Tag fareler Jackson Laboratuvarı 13591
ACTB-ECFP farelerde Jackson Laboratuvarı 3773
ACTB-H2B-EGFP farelerde Jackson Laboratuvarı 5418
1 x PBS -House Made in
2 MD Dekstran, Flöresein-konjuge Invitrogen D-7137 1 x PBS içinde seyreltilmiş ve 1 mg / ml; dH 2 O (-20 ° C, 4 mg / ml, mağaza) içinde sulandırın
10 kD Dekstran, Alexa Fluor 647-konjuge Invitrogen D-22914 1 x PBS içinde seyreltilmiş ve 1 mg / ml; dH 2 O (-20 ° C, 4 mg / ml, mağaza) içinde sulandırın
Doksorubisin hidroklorür Sigma-Aldrich 44583 4 at dH 2 O ve mağaza sulandırın ° C; 1 x PBS içinde seyreltin
Isothesia (İzofluran) Butler Hayvan Sağlığı Kaynağı 029450 250 ml
Propidium iyodür Invitrogen P3566 1 mg / ml; 1:15 seyreltilmiş 1 x PBS içinde
Azot
Oksijen
Ekipman
18G x 1 ½ "Düzenli konik iğne BD 305196
μManager Vale Lab, UCSF www.micro-manager.org Açık kaynak yazılım
Alkol çubukla BD 326895 % 70 izopropil alkol bezlerden
Anestezi sistemi Moleküler Görüntüleme Ürünleri, Co
Cam Kapak Corning 2940-245 1 ½, 24x50 mm No;% 70 izopropanol mendil ile dezenfekte
Curity gazlı bez sünger (steril) Kendall 6939
Cam mikroskop slaytlar Corning 2948-75x25 Önceden temizlenmiş; önceden temizlenmiş değilse,% 70 izopropanol mendil ile dezenfekte
Sertleştirilmiş ince makas Güzel Bilim Araçları 14090-11 2 çift; paslanmaz çelikten, keskin keskin uçları, düz uçlu, 26 mm kesme kenarı, 11 cm uzunluk
Isıtmalı battaniye Gaymar Industries
Sıcak boncuk sterilizatör Güzel Bilim Araçları 18000-45 Kullanmadan önce yaklaşık 30 dakika açın;> 200 aletleri sterilize ° C 30 sn
Imaris Bitplane www.bitplane.com
Krazy Glue Elmer Ürünleri KG484
Laboratuvar bant (½ ")
Laboratuar bant (1 ")
Için KapakStrafor nakliye soğutucusu Bu, cerrahi platform olarak kullanılacak
Mikro diseksiyon forseps Roboz SC-5153 1x2 dişler, hafif eğri, 0.8 mm uç genişliği, 4 "uzunluğu
Mikro diseksiyon forseps Roboz RS-5135 Dişli, hafif eğri, 0.8 mm uç genişliği; 4 "uzunluğu
Mikroskop İplik disk konfokal, XYZ Piezo aşamada, epifluourescence capablility 17,25
Mikroskop sahnede insert Uygulamalı Bilimsel Aletler Özel iki dairesel görüntüleme portları ile, fabrikasyon
MouseOx oksimetre, yazılım ve sensörler STARR Yaşam Bilimleri www.starrlifesciences.com
Nalgene Süper Versi-Kuru laboratuar Soakers Thermo Scientific 74218-00 Cerrahi platformu astar için dörtte halinde doğrayın
Nebulizatör Salter Labs 8901 Gazlar nemlendirmek için kullanılır; akciğer dokuları tahriş olmasını engeller
Slip-ucu tek tüberkülin şırınga (1 ml) BD 309659
Surflo kanatlı infüzyon seti Terumo SV-23BLK 23G x ¾ "ultra ince iğne, 12" boru
Betadine Sprey Purdue Pharma BASP3H

Kaynaklar

  1. Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
  2. Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
  3. Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
  4. DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
  5. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
  6. Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
  7. Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
  8. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  9. Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
  10. Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
  11. Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
  12. Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
  13. Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
  14. Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
  15. Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
  16. Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
  17. Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
  18. Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716(2011).
  19. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563(2011).
  20. Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
  21. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  22. Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
  23. Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
  24. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
  25. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97(2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

D nen Disk Konfokal Mikroskopila Da l mKanser H cre l mStromal H cre MigrasyonuZaman Atlamal G r nt lemeFare Meme T m rleriMeme Kanseri ModelleriG r nt Analiz Yaz l m

İlgili makaleler