Method Article

Yenidoğan subventricular Bölge Elektroporasyon

DOI:

10.3791/50197

⸱

February 11th, 2013

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz yenidoğan subventricular dilimi elektroporasyon olarak adlandırılan minimal invaziv tekniği göstermek. Tekniği yenidoğan yavruların lateral ventriküllerin içine plazmid DNA enjekte ve sunmak için elektrik akımı uygulayarak oluşur ve genetik nöral kök hücreleri manipüle

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral kök hücreler (NSC'lerde) hattı postnatal lateral ventriküllerin ve nöronlar, astrositler ve ependimal hücreleri 1 dahil olduğu birden fazla hücre tipleri yol açmaktadır. Moleküler MGK kendini yenileme, bağlılık sorumlu yollar ve farklılaşma anlama sokmak beyin onarım ve iyi merkezi sinir sistemi bozuklukları anlamak için eşsiz potansiyeli açısından son derece önemlidir. Memeli sistemlerin manipülasyon için Önceki yöntemler tüm hayvan 2 düzeyinde genetik mühendisliğinin zaman alıcı ve pahalı bir çaba gereklidir. Böylece, çalışmaların büyük çoğunluğu in vitro ya da omurgasız NSC moleküllerin fonksiyonlarının inceledik.

Burada, neonatal subventrikuler alanin (SVZ) elektroporasyon olarak ifade edilir neonatal NPC işlemek için basit ve hızlı bir teknik göstermektedir. Benzer teknikler embriyonik NSC'lerde çalışmak için bir on yıl önce geliştirilen ve cortica çalışmalar yardım etmişl geliştirme 3,4. Daha yakın zamanda bu postnatal kemirgen ön beyin 5-7 incelemek için kullanılmıştır. Bu teknik SVZ NSC'lerde ve yavrularının sağlam etiketleme sonuçlar. Böylece, postnatal SVZ elektroporasyon memeli MGK genetik mühendisliği için bir maliyet ve zaman etkin bir alternatif sunuyor.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedür Yale IACUC gereklerine uygun olduğunu. Bilim adamları IACUC kuralları kendi kurumsal ihtiyaçlarına göre onaylanmış ve takip edildiğinden emin olun.

1. Bölüm 1. DNA, Çözümler ve Cam Pipetler hazırlanması

  1. Yüksek saflıkta (OD 260/280> 1.80) yüksek konsantrasyon (mg / ul> 2.5) endotoksin-serbest DNA oluşturun.
  2. Bir 22 mikron filtre ile% 0.9 salin solüsyonu ve steril filtre hazırlayın.
  3. Sıra 10 cm yangın parlatılmış borosilikat cam kapiller tüplerin (OD: 1.5 mm, ID: 1.10 mm) Model bir kanthal tel ile PP-830 Narishige PC-10 cam pipet çektirmenin içine. 70.5 de bir adım ağırlıklı çekme ° C'ye çektirme....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cımbız elektrot "süpürme" hareketi (Şekil 1E) takiben dorsal, dorsal lateral ve lateral subventricular bölgesi ile mücavir neredeyse tüm radyal glia ve etiketleme Yenidoğan subventricular dilimi elektroporasyon sonuçlar. Ancak, elektroporasyon ilgili deney şartı uyarlanmış ancak elektrot süpürme ve video ayrıntılı olarak belirli yerleşimi ve yönlendirme kullanarak değil olabilir. Dorsal lokalize radyal glia bu astar ventrikülün lateral bölümünde farklı yana Örneğin, biri sadece tek bir bölgede 9,10.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada ayrıntılı yenidoğan SVZ elektroporasyon tekniği, hızlı ve güçlü bir etiket ve SVZ kök hücre ve yavrularının işlemek için bir tekniktir. Elektroporasyon için diğer teknikler ile karşılaştırıldığında, sahip olduğu birkaç avantajı vardır. İlk olarak, hücrelerin odak etiketleme göz önüne alındığında, tek hücre ve otonom olmayan hücre otonom etkilerini ayırt edebilir. Indüklenebilir sistemleri kullanarak İkincisi, genetik manipülasyon birini önce veya sinaptik entegrasyon sonra etkilerini karşılaştırmak için izin veri.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar yapmak için hiçbir açıklama yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Savunma Bakanlığı (Fikir geliştirme ödülü, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Kök hücre hibe (AB) ve Sağlık NRSA 10.668.225 (DMF) Ulusal Enstitüsü bağışları ile desteklenmiştir. Mevcut malzeme kısmen Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler Programı kapsamında Connecticut Eyaleti tarafından desteklenen çalışmaya dayanır. İçeriğinde sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Connecticut, Connecticut veya CT Yeniliklerin Devlet Halk Sağlığı Bölümü Devletin resmi görüşlerini temsil etmemektedir, Inc fon, veri toplama çalışması tasarım herhangi bir rolü vardı ve analiz, yayınlamak kararı veya yazının hazırlanması.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
Ağır Parlak Borosilikat Tubing Sutter Instrument BF150-110-10
Çift Kademeli Cam Mikropipet Çektirme Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 Kare Dalga Sinyal jeneratörü Harvard Apparatus 45-0052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0488
Fiber-Optik Işık Kaynağı Fisher Scientific 12-562-36
Tungsten Halojenlamba Ushio America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Aletleri 052-0312-900

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neonatal SVZ ElectroporationSubventricular ZoneNeural Stem CellsElectroporation TechniqueDNA InjectionImmunohistochemistryMicroscopy AnalysisElectrophysiology MethodsCell Fate AnalysisPup Anesthesia

Related Articles