Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Kromozom analizi kromozom istikrarsızlığı ve genetik bozukluklar ve malignite ^1,2,8,9 giden düzenlenmeleri teşhis etmek için dünya çapında kullanılan geleneksel bir tekniktir. Ayrıca, yapısal ve kanser kaynaklı genetik anormalliklerin teşhis ve araştırma için daha yüksek bir çözünürlük gibi floresan in situ hibridizasyon (FISH) sitogenetik olarak klasik prosedürler ve moleküler sitogenetik metodolojileri kombinasyonu, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) ile elde edilebilir ve spektral karyotip (SKY) ^14,15. Daha yakın zamanda, bu teknikler, kök hücre araştırma ile ilgili kromozom istikrarsızlık değerlendirilmesi için kullanılmıştır. Bu tür uzun süreli kültür embriyonik hücreler (ES) ve çeşitli organizmaların erişkin kök hücrelerinin anöploidinin olarak kromozomlarda anormallikler birden laboratuarlar tarafından bildirilmiştir. Yeni kanıtlar, bazı hücre hatları doğal kromozom instabilitenin birlik daha eğilimli olduğunu desteklerne olursa olsun kültür koşulları bağdaştırılır. Kurulması ve / veya insan, fare veya Rhesus kök hücre hatları muhafaza, bu nedenle, kromozom analizi, kalite kontrol işleminin bir parçası olarak tavsiye edilir. Birçok rapor, kültür ^10-13 kök hücreleri ve habis hücrelerinin veya çeşitli organizmaların kromozomal stabilitesini izlemek için rutin ve moleküler sitogenetik kullanımında artan bir ilgi açıklar. Bu protokoller giderek onların kültürlü hücrelerin ¹³ hızlı kromozomal değerlendirilmesi için nongenetik laboratuvarlar tarafından kullanılmaktadır. Çeşitli organizmalardan elde edilen klinik ve araştırma amaçlı ve hücreler hem de uygulanabilir çeşitli hücre tipleri, kromozom hazırlanmasına yönelik temel prosedürleri sunuyoruz.

1.. Yapışık Hücrelerin kromozom Hasat

1. Standard protokol
   1. Belirli bir hücre kültürü koşullarına göre hücreler büyür. Hücreler logaritmik fazı (% 80 kaynaşma) ulaştığı zaman, hücre kültürü şişesine Colcemid 10 ul / ml. 2 x 10 ⁶ hücre bir minimum tavsiye edilir.
   2. 45 dakika boyunca bir% 5 _CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri. Steril bir pipet kullanılarak, 15 ml konik bir tüp içine hücrelerden ortam aktarın. Kenara koyun.
   3. Yavaşça şişeye HBSS Tampon 2 ml ekleyerek hücreleri yıkayın. Girdap tampon ve daha sonra bir pipet kullanılarak çıkarılabilir. Atın.
   4. Bu, şişenin tüm yüzeyini kaplar sağlanması, tripsin 1 ml ilave edilir. Sadece yaklaşık 2 dakika boyunca tripsin hücreleri bırakın. Hücrelerin çoğunun müstakil sonra, geri hücreler üzerine konik bir tüp içinde ortam pipetle.
   5. 15 ml konik tüp içine 10 ml alikotları hücre süspansiyonu aktarın.10 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı ve pelet tekrar süspansiyon.
   6. Konik bir tüp içinde kalan topak 37 ° C'ye önceden ısıtılmış olan 0.075 M KCI 10 ml ilave edilir. KCI ve hücrelerin karışımı orta hızda vorteks tüp.
   7. 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. 25 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje Ve tekrar süspansiyon pelet (yaklaşık 0.5 ml kalmayıncaya kadar) süpernatant kaldırmak.
   8. Vorteks edilirken hücrelere: dikkatle taze Carnoy fiksatif 5 ml (buzlu asetik asit, metanol içinde 3:1 oranında) ekleyin. Daha sonra 10 ml 'lik bir toplam için girdap olmayan sabitleyici daha 5 ml ekleyin.
   9. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Her tüpe fiksatif 5 ml.
   10. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Her tüpe fiksatif 5 ml. Hücreler, şimdiye kadar, bir yıl boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
2. Protokol Modifikasyon: Kromozom harvestilenfoblastoid hücre çizgilerinin ng
   1. Belirli bir hücre kültürü koşullarına göre hücreler büyür. (Kullanım hücreleri kültüre edildikten miktarı için uygun bir balon). Hücreler logaritmik fazı (hücre bölünmüş olan yaklaşık 2 gün sonra) ulaştığı zaman, hücre kültürü şişesine Colcemid 10 ul / ml.
3. Protokol Modifikasyon: kandan kromozom hasat
   Fitohemagglutinin (PHA), kırmızı barbunya elde edilen bir lektin, bir insan T-hücreleri ¹⁶ için güçlü bir mitojen olduğu. 72 saat kültüre PHA eklenmesinden sonra, hücrelerin yaklaşık% 45 S aşamasında bulunmaktadır. Bu durum, zirve mitotik faaliyet gösteren ve kromozom çalışmaları için hasat için hangi uygun bir yer. B hücreleri ^17,18 analiz edilirken pok otu (1-10 ug / ml) gibi diğer mitojenlerdir kullanılabilmektedir.
   1. Yeşil bir üst sodyum heparin bir tüp içinde, bütün haldeki kan, en az 1 ml toplayın. Toplandıktan sonra 3 gün içinde kullanın. RT un saklayınız kankullanıma hazır til.
   2. Kısım L-glutamin (% 20 fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 fungizon ve% 1 PHA) ihtiva eden RPMI komple ortam içinde, 10 ml tam kan, 0.25 ml. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de kültür.
4. Protokol Modifikasyon: Kemik iliğinden kromozom hasat
   Kromozomal anormal klon gözlem lösemi belirli bir türü için tanısal olabilecek kemik iliği üzerine sitogenetik analiz Birçok malign hematolojik hastalıklarda yararlı. Kromozom çalışmalar aynı zamanda blast krizi ve tedaviye cevabın başlangıcı olarak hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için kullanılır. Kemik iliği hücreleri aktif bölünen yana, hiçbir mitojenle stimülasyon gereklidir ^9,19 olduğunu. Akut lösemiler için 24 ve 48 saat kültürleri de kurulur.
   1. Yeşil bir üst sodyum heparin tüpte kemik iliği en az 1 ml toplayın. L-glutamin (2 içeren RPMI tam ortam, 10 ml kemik iliği kısım 0.25 mi0% fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 fungizon). % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de kültür.

2. Slayt Hazırlama ve Katı Boyama

Temsili bir slayt hızlı bir değerlendirmesi gibi G-bantlama, FISH, CGH, ya da SKY gibi başka işlemlere devam etmeden önce hasat kalitesi hakkında bilgi verecektir. Bazı laboratuvarlar katı leke hızlı hasat ve kromozom değerlendirilmesi için hücreleri tercih ederim. Alternatif olarak, bir faz kontrast mikroskop Bu analiz için kullanılabilir. Slaytlar iyi nem yaklaşık% 50 olduğu zaman hazırlanmış ve çevre sıcaklığı (20-25 ° C) gerçekleştirilmiştir.

1. 25 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje hücreleri Sadece 0,3-0,5 ml kalmayıncaya kadar süpernatant kaldırmak.
2. Sonra yavaşça 45 ° 'lik bir açıda eğilmiş ve bir süspansiyon sağlayan bir slayt üzerine yaklaşık 2 arasında, bir mesafeden hücre süspansiyonu topak, pipet üç damla yeniden süspanseslaytta rulo. Slayt taze Carnoy Fiksatif bir büyük damla ekleyin.
3. Bir kağıt havlu üzerine slayt arka kurulayın ve ardından en az 10 dakika boyunca kuru dışarı slayt oturun. Slayt tamamen kuru olmalıdır.
4. Taze Giemsa Boyama Çözüm (Gurr Tampon ve Giemsa Leke 3:1 oranı) hazırlayın. Bir boyama rafa slaytlar yerleştirin. Giemsa boyama çözüm tüm slayt örtün. Kayar parçalar 5 dakika boyunca boyama çözeltisi içinde kalmasına izin verin. , Distile su ile durulayın slaytlar drenaj ve kurumaya bırakın.
5. 4 Permount damla ve slayta bir kapak kayma ekleyin. Emin coverslip altında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Fazla Permount bir kağıt havlu ile temizlenebilir.
6. 10X ve 100X büyütme altında bir ışık mikroskobu ile hücrelerin analiz. Metafaz hücreleri bol ve iyi yayılmış ise, kalan slaytlar diğer deneysel işlemler için kullanılabilir.

3. G-Bantlama Tripsin ve Giemsa (GTG) kullanma

1. 4 Coplin kavanoz için aşağıdaki çözümleri ekleyin.
   Jar 1. 1x HBSS = 30 ml 10x tripsin 4 ml (% 0.5)
   1x HBSS'nin Jar # 2 = 50 ml
   Jar # 3 = 1 x 45 ml HBSS ve fetal sığır serumu, 5 ml
   1x HBSS'nin Jar # 4 = 50 ml
2. 5 saniye için Jar # 1 her slayt, Jar # 2 hızlı durulama batırın, en az 30 saniye boyunca Jar # 3 Kavanoz 4. hızlı durulama her slayt bırakın sonra slaytlar kurumasını bekleyin.
3. Fres hazırlayınh Giemsa Boyama Çözüm (Gurr Tampon ve Giemsa Leke 3:1 oranı). Bir boyama rafa slaytlar yerleştirin. Giemsa boyama çözüm tüm slayt örtün. Kayar parçalar 5 dakika boyunca boyama çözeltisi içinde kalmasına izin verin.
4. Bu lekeli aynı sırayla damıtılmış su içinde slaytlar durulayın. Slaytlar için yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin. Slayt tamamen kuru olmalıdır.
5. 4 Permount damla ve slayta bir kapak kayma ekleyin. Emin coverslip altında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Fazla Permount bir kağıt havlu ile temizlenebilir.
6. 10X ve 100X büyütme altında bir ışık mikroskobu ile hücrelerin analiz. Ilk slayt sonuçlarına göre slaytların kalanı tripsin zamanlamasını ayarlayın.

Yüksek kaliteli metafaz yayılır kromozom analizi için gereklidir. Başarılı bir deney de yayılmış ve uygun kromozom morfolojisi olan kromozom verir. Düzgün G-bantlı kromozomlar karakteristik ışık ve karanlık bantlama desenler içerir.

Şekil 1. Kromozomları normal uzunlukta olduğu başarılı bir kromozom yayılmış, iyi yayıldı ve kolayca birbirinden görülemeyecek, ışık ve karanlık bantlar arasında yeterli kontrast. İyi kromozom morfolojisi gösteren herhangi düzenlenmeleri için bireysel kromozomlar ve değerlendirilmesi tanımlanması için izin verir kromozom instabilite.