Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

Özet

Bu hücre içi Ca için kullanılabilecek insan atriyal miyosit izolasyonunu anlatır ^{2 + ölçümleri.}

Özet

Yama klemp tekniği ve kalp hücresel Ca ² arama ile kardiyak iyon kanallarının elektrofizyolojik özelliklerinin çalışma ⁺ taşıma anomaliler izole kardiyomiyositlerin gerektirir. Buna ek olarak, bu yöntemler kullanılarak hastaların miyositleri araştırmak için olasılık, bu tür atriyal fibrilasyon (AF) ve kalp hastalıklarının moleküler temeli aydınlatmak için çok değerli bir gerekliliktir. ¹ Burada her iki için uygun olan insan atrial miyositlerinde bölgesinin izolasyonu için bir yöntem tarif Patch-clamp çalışmaları ve hücre içi ^{Ca2 +} konsantrasyonu aynı anda ölçümleri. İlk olarak, açık kalp cerrahisi uygulanan hastalarda elde edilen sağ atriyal uzantıları küçük doku parçaları ("yığın yöntemi") içine doğranmış ve ^+-ücretsiz bir çözüm Ca ² yıkanır. Daha sonra doku parçaları 20 mcM Ca ^{2 +} ile çözümler içeren kollajenaz ve proteaz sindirilir. Bundan sonra, izole edilmiş olan miyosit Harvedoku süspansiyonu filtrasyon ve santrifüj ile sted. Son olarak, hücre depolama çözelti içinde ^{Ca2 +} konsantrasyonu 0.2 mM kademeli bir şekilde ayarlanır. Biz kısaca ⁺ ve Ca ^{2 +} izolasyon işlemi sırasında tampon ve aksiyon potansiyelleri ve membran akımlarının temsilcisi kayıtları sağlamak, her ikisi birlikte aynı anda Ca ^{2 +} geçici ölçümler, bu izole miyositler yapılan ile Ca ² anlamını tartışmak.

Giriş

Yama klemp tekniği ve ⁺ taşıma anormallikleri izole kardiyomiyositlerin gerektiren hücresel Ca ² arama ile kardiyak iyon kanallarının elektrofizyolojik özellikleri incelenmesi. Bunlar genellikle sindirim enzimleri kardiyak doku örneklerinin in vitro maruz kalma (kolajenaz, hiyaluronidaz, peptidaz vb) ardından elde edilir. 1.955 ^2'de canlı kalp miyositlerin izolasyonu ilk rapordan bu yana protokoller büyük miktarda fare, sıçan, tavşan, köpek, kobay ve insan dahil olmak üzere farklı türlerden tek atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde hasat için geliştirilmiştir. Bu derlemede insan atriyal miyositlerin izolasyonu odaklanın. Biz Worthington Biyokimyasal Corp, ABD (tarafından sağlanan "Worthington Doku Ayrılma kılavuzu" bölümüne bakın diğer türlerden miyositlerin izolasyonu için prosedürleri ile ilgili www.tissuedissociation.com ).

İnsan atriyal miyosit izolasyon protokolleri genellikle Burada amacıyla önceden yayınlanmış bir yöntem uyarlanan bir teknik bir adım-adım bir açıklaması, sağlamak Bustamante, ve diğ. ³ açıklanan yöntem kullanılarak elde edilmiştir Patch-clamp deneyler için değil, aynı zamanda eş zamanlı olarak hücre içi ^{Ca2 +} ölçümü için sadece uygun atrial miyositlerinde elde edilir. ^4-11

Protokol

Deneysel protokolleri, yerel etik kurul tarafından onaylanmış ve tüm hastalarda yazılı onay vermek gerekir gerekir. Araştırma Tıp Fakültesi Mannheim etik kurul, Heidelberg Üniversitesi (# 2011-216N-MA) tarafından onaylandı ve insan refahı için tüm, kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallar uygun olarak yapıldı. Tüm hastalar yazılı onam verdi.

0. İnsan Atriyal Doku Alınması

Aşılama kardiyopulmoner bypass için açık kalp ameliyatı geçiren hastalarda rutin kanülasyon prosedürleri sırasında, sağ atriyal apendiks ucunda genellikle kaldırılır ve atriyal kardiyomiyositlerinin izolasyonu için kullanılabilir. BDM, kasılma önleyici, miyosit c önlenmesi; eksizyon sonrası doku örneği 2,3-bütandion monoxime (Tablo I içeren ^+-ücretsiz ulaşım çözümü steril Ca ² ile 50 ml Falcon tüp içine hemen aktarılır) ontracture. 30 ve 45 dakika arasında ulaşım zaman ile, izole atriyal kardiyomiyositlerinin sayısı ve kalitesini göre soğutma veya oksijenasyon bir avantaj tanımadı. Laboratuara genel ulaşım mümkün olduğunca hızlı olmalıdır. Daha uzun süre taşıma süresi önlenemez Ancak, 4 de ulaşım ° C oksijenli çözüm avantajlı olabilir.

1. Prearrangements

1. Ceketli beher (Tablo II) sıcaklık kontrol thermocirculator, açın. Kabı içindeki sıcaklık 37 ° C ye eşit olduğundan emin olun Tüm süreç boyunca izolasyon beher içinde sabit bir sıcaklığı korumak için bir cam kapak ile kabı kapsamaktadır.
2. Üç cam bardak içine kollajenaz I ve Proteaz XXIV tartılır ve oda sıcaklığında saklayın. Enzimler, kullanımdan hemen önce seyreltildi edilecektir.
3. Ca ² Mağaza 20 ml 4 bir Petri kabındaki ⁺ ücretsiz bir çözüm ° C
4. Ca ² deposu 250 ml 37 ° C'de su banyosunda ⁺ serbest çözeltisi ° C

2. Doku temizliği

1. Bir Petri kabı (~ 10 cm çapında) içine taşıma çözümü ile birlikte doku örneği aktarın ve yaklaşık makas kullanılarak yağ doku kaldırmak.
2. Doku örneği tartılır. 200 ila 600 mg hücre izolasyonu için kullanılır. Kalan doku daha sonra biyokimyasal analiz için likit nitrojende dondurulmuş olabilir.
3. 20 ml Ca ² içeren Petri kabı içine doku örneği aktarmak 4 de ⁺ ücretsiz bir çözüm ° C (adım 1.3) ve boyutu yaklaşık 1 mm ³ küçük parçalar halinde doku örneği doğrayın.
4. Aşağıdaki adımlar% 100 O ₂ ile 37 ° C de ve sürekli gazlama altında yürütülmelidir. Bir pipet güçlü köpüren önlemek ve sürekli hava akışı oluşturmak için oksijen tüpü üzerine yerleştirilebilir.
5. Içinde ^{Ca2 +} içermeyen bir çözüm ile birlikte doku parçaları transferceketli beher ve bir manyetik karıştırma çubuğu ile yaklaşık 3 dakika boyunca dikkatli bir şekilde karıştırın.
6. Karıştırma durdurmak ve doku parçaları birkaç saniye yerleşmek için izin verir. Bir naylon örgü (200 mikron, Tablo II) ile süpernatant dikkatlice süzün. Forseps kullanarak beher içine örgü gelen ölçülü doku parçaları dönün.
7. Ca ² ile doldurun beher ⁺ serbest çözeltisi ile yıkama aşaması 2.4 ve 2.5 'da iki kez tekrarlayın.

3. İlk Enzimatik Sindirim

1. Kolajenaz ve proteaz ihtiva eden 20 ml enzim çözeltisi E1 (Tablo I) ile doku parçaları yeniden askıya ve 10 dakika boyunca dikkatli bir şekilde karıştırın.
2. 20 uM ^{Ca2 +} bir son konsantrasyon elde etmek için 10 mM _{CaCl2-çözeltisinin} 40 ul ekle.
3. 35 dakika doku parçaları çoğu beher kalır bir şekilde bir naylon örgü (200 mikron, Tablo II) dikkatle süpernatant süzün sonra. Dinlenme dönörgü gelen behere doku parçaları yağmur yağdı.

4. İkinci Enzimatik Sindirim

1. Sadece 20 mL enzim çözeltisi içeren E2 kolajenaz (Tablo I) ile tekrar doku parçaları yeniden süspanse edin. Hemen 20 uM ^Ca2 bir son konsantrasyon elde etmek için 10 mM _{CaCl2-çözeltisi} 40 ul ^+.
2. İkinci sindirim kullanımı makas sırasında daha fazla bazen doku pıhtıları kesmek için.
3. 5 dakika sonra hücrelerin ayrışma kontrol etmek için bir Pasteur pipeti kullanarak bir örnek almak. Çubuk şeklinde, çizgili kardiyomiyositler görünene kadar bu 2-3 dk her tekrarlayın.
4. Karıştırma durdurmak ve doku parçaları yaklaşık 20-30 saniye yerleşmek için izin verir.
5. 50 ml'lik bir Falcon tüp (tüp A) içine, naylon elekten (200 mm, Tablo II) ile dikkatli bir şekilde yüzer süzün. Behere örgü gelen ölçülü doku parçaları dönün.
6. 20 ml Stora ile beher doku parçaları yeniden askıyaGE çözeltisi (Tablo I) 'in ¹⁰ ve daha fazla dağıtıcı içeren bir 20 mL serolojik bir pipet kullanarak yumuşak mekanik öğütülerek hücreleri ayırmak. Kabarcıklar hücre sağkalım ve kalite için zararlı olduğu için kabarcık oluşumunu önlemek için deneyin.
7. 50 ml Falcon Tüp (Tüp B) bir naylon örgü (200 mikron, Tablo II) dikkatle süpernatant süzün.

5. Final Ca ² Son Hazırlık ve Ayar ⁺ Konsantrasyon

1. 10 dakika 95 xg'de Falcon tüpler A ve B (adım 4.5 ve 4.7) hem de santrifüj.
2. Aspirasyon tarafından dikkatli bir şekilde her iki tüpleri süpernatantı. Pelet rahatsız etmemek için emin olun. Süpernatantı atın.
3. 1.5 ml saklama solüsyonu (Tablo I) 'in her biri (oda sıcaklığı) her iki pelet yeniden askıya.
4. İki kez her Falcon için 10 mM _CaCl2 çözüm 7.5 ul ekleyin ve dikkatli bir şekilde karıştırın. Her adım, sonra 10 dakika süreyle inkübe edin.
5. 0.2 mM nihai bir ^{Ca2 +} konsantrasyonu elde etmek için 10 mM _CaCl2 çözeltisi 15 ul ekle.

6. Floresan Ca ^{2 +-göstergesi} Fluo-3 AM (Şekil 1) ile miyositlerin yükleme

1. 2 ml mikrosantrifüj tüpü (Eppendorf tüp) içine hücre süspansiyonu, 1.5 ml (tüp A ve / ya da tüp B) aktarın.
2. Aşağıdaki adımlar floresan Ca ^{2 +} Gösterge Fluo-3 ışık hassasiyeti dikkate alınarak yürütülmelidir.
3. Pluronik F-127 (Tablo III) stok çözeltisi (% 20 susuz DMSO içerisinde ağırlık / hacim olarak) elde etmek için 44 ul içerisinde Fluo-3 membran geçirgen asetoksimetil ester türevi (Fluo-3 AM, Tablo III) 'ün 50 mg çözülür 1 mM Fluo-3 en az 1 hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir stok solüsyonu, Am.
4. 15 ul ekle Fluo-3 hücre süspansiyonu, 1.5 ml (adım 6.1) ve ajitasyon içeren mikrosantrifüj tüpüne stok solüsyonu AMdikkatli.
5. Bir optik olarak donuk olan bir kutuda 10 dakika boyunca hücre süspansiyonu inkübe edin.
6. Kısaca yaklaşık 6000 rpm santrifüj.
7. Süpernatantı atın ve 1.5 ml banyo solüsyonu (Tablo IV) pelet yeniden askıya.
8. Deneyleri ile başlamadan önce de-esterifikasyon için yaklaşık 30 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu bırakın.

7. Eşzamanlı Patch-kelepçe ve epifluorescent Ca ^{2 +} Ölçümler

Yama-kelepçe ölçümleri bu yorumu en önemli konu olmadığı, bu tekniğin derinlemesine bir açıklama daha sağlayan diğer yayınlar için ilgilenen okuyucu bakın. ^11-14 bütünlüğü uğruna biz ölçmek için bir protokol kısa bir özetini aksiyon potansiyelleri veya L-tipi Ca ^{2 +} akımları, eş zamanlı Ca ^{2 +-geçici} kayıtları ile birlikte hem.

Deneyler sırasında miyositler banyo soluti ile 37 ° C'de superfused edilirhızlı bir perfüzyon sistemi (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY) ile (Tablo IV). Voltaj-kıskaç deneyleri için, K ⁺ akımlarının banyo solüsyonuna 4-aminopiridin (5 mg / L) ve BaCl ₂ (0.1 mmol / L) eklenerek bloke edilmiştir. Borosilikat cam Mikroelektronlar kullanılır ve pipet çözüm (Tablo V) ile dolu zaman MQ 2-5 dirençleri ucu olmalıdır. Fluo-3 ek olarak (adım 6), miyosit yükleme PM, Flu-3, aynı zamanda pipet çözeltisi (Tablo V) 'de yer almaktadır. Floresan 488 nm heyecanlı ve yayılan ışık (<520 nm) [Ca ^{2 +]} _i varsayarak dönüştürülür

burada K, _D Fluo-3 sabiti = çözünme (864 KM), K = Fluo-3 floresan;. _Fmax = ^Ca2 her deney sonunda elde edilen ⁺ doymuş floresan ¹² elektrik sinyalleri ve Epifluorescent ^{Ca2 +} hem de görüntü sinyallerini da kaydedilir. Aksiyon potansiyelleri 1.2x eşik gücü 1 msn akım darbeleri kullanarak akım kelepçe modunda 0,5 Hz uyarılır. L tipi ^{Ca2 +} akımları, 100 milisaniye ile hızlı-Na ⁺ akımı, ardından etkisiz hale getirmek için -80 mV değerinde bir tutma potansiyeli -40 mV'a bir 100-msn rampa darbe ile voltaj-kelepçe modunda ölçülür 0,5 Hz +10 mV test darbe.

Sonuçlar

Şekil 2A izole insan sağ atriyal miyositlerden üç temsilci örnekler gösterir. Bir CellFinder mikroskop lamı (üzerine hücre süspansiyonu (adım 5.5) 10 ul pipet hücre verimi ölçmek için http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). 16.5 ± 3.1 cells/10 ul (n = 29) vs 5.1 ± 2.3 cells/10 ul: Şekil 2B'de Ortalama hücre verim açıkça kronik AF (CAF) daha düşük hücre verim eğilimi hasta örnekleri (tüp bir olduğunu gösterir (n = 10) sırasıyla SR ve Caf, p <0.05; tüp B: 17.9 ± 3.9 cells/10 ul (n = 29) vs 5.9 ± SR ve Caf 2.0 cells/10 ul (n = 9), , p = 0.107).

Aksiyon potansiyel ölçümleri ve sitosolik ^{Ca2 +,} aynı anda geçici kayıtları için temsili örnekler, Şekil 3'te verilmiştir. Incelenmiştir hücreler, T arasında yaklaşık% 90o aksiyon potansiyeli-tetiklenen Ca ^{2 +} sürümü açık ve normal bir cep kasılmalar neden olur. Önceden bildirildiği gibi, hücre bütünlüğü için kabul edilen bir göstergesidir istirahat membran potansiyeli, -73.9 hakkında ortalama ± 2.7 mV (n = 23/10 miyositler / hasta) ve -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 miyositler / hasta ) sırasıyla SR ve Caf (p> 0,05). ¹⁵ Şekil 4 voltaj bağımlı L-tipi Ca ^{2 +} akımları ve sitozolik Ca ^{2 +} geçici temsilcisi eş zamanlı kayıtları gösterir. Seçici olmayan β-adrenoseptör agonisti izoprenalin (1 uM) Uygulama sağlam β-adrenerjik sinyal transdüksiyon kaskadının düşündüren bir _{Ca, L} ve sitosolik ^{Ca2 +} hem de geçici amplitüdlerinin artırır.

FŞEKIL 1. miyositler Fluo-3 akış şeması (adım 6.1-6.5 bakınız) protokolü yükleme AM. m / v, kütle / hacim.

Şekil 2. Depolama çözümü bir saat sonra bir, izole insan sağ atriyal miyositler. B, depolama çözümü hücrelerin 10 ul sayılır hücre verim ± SEM (adım 5.5) ortalama. n, her bir grup içinde preparatların sayısını ifade eder. * P <0.05.

Aksiyon potansiyeli-tetiklenen Ca ² sinüs ritmi bir atriyal miyosit içinde ^+-geçici (Cat) ve chr Şekil 3. Temsilcisi kayıtlarıonic atriyal fibrilasyon hasta. Top: Enjekte stimülasyon (0.5 Hz) için kullanılan akım membran (I _M). Aşağıda: membran potansiyeli (V _M) ve tetiklenen Cat (alt) aynı anda kayıt. (Voigt ve ark izniyle Replotted. 2012) ¹⁵

L-tipi Ca ² izoprenalin (1 mcM) etkisi Şekil 4. Temsilcisi kayıtları ⁺ akım tetiklenen Ca ² sinüs ritmi ve kronik atriyal fibrilasyon hasta bir atriyal miyosit içinde ^+-geçici (Cat). Top: Gerilim-kelepçe protokolü (0.5 Hz). Aşağıda: Mevcut toplam net membran Eş zamanlı kayıt (I _M), ağırlıklı olarak L-tipi Ca ^{2 +} akım (orta) ve tetiklenen Cat (alt) yansıtan. (Voigt izni ile Replotted,ve ark. 2012) ¹⁵

Tablo I. Çözümler.

Tablo II. Özel ekipman.

Tablo III. Fluo-3 ile miyositlerin yükleme için maddeler var.

Tablo IV. Yama-kelepçe için banyo çözüm.

Yama-kelepçe * için Tablo V. Pipet çözüm.

Tartışma

Burada açık kalp cerrahisi uygulanan hastalarda elde edilen sağ atriyal uzantıları insan atriyal miyositlerin izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Sitosolik ^Ca2 ölçümleri için bu miyositler kullanmak için ^{+ Eğer} saklama çözeltisinden EGTA ihmal edilmesi ile daha önce tarif edilen yöntem ^4-11 uyarlanmıştır.

Zaten 1970 yılında bu miyositler ⁺ sindirim sırasında Ca ² varlığında ayırmak rağmen, hepsi nedenle kontraktürü ve cansız. ^16,17 içinde olduğu gözlenmiştir, hücre izolasyonu Ca ^{2 +-ücretsiz} bir çözüm yapılır. Ancak, Ca ² fizyolojik konsantrasyonlarının yeniden giriş ⁺ hızlı Ca ^{2 +} akını ve hücre ölümüne neden oldu. Bu aslında Zimmerman ve Hulsman ile perfüze gözlenmiştir ^{Ca2 +} paradoks bir olgu olarak tarif edilmiştir. 7.0 pH azaltılması da dahil olmak üzere yalıtım ortamı ¹⁸ Değişiklikler 20 veya Ca ^{2 +} (adım 3.2 ve 4.1 'e bakınız), ²¹ yanı sıra, depolama çözelti ²² EGTA ihtiva eden izole miyosit depolama küçük miktarlarda> 19, ek destek ^{Ca2 +} paradoksu. ¹⁷ engellemek için öne sürülmüştür Bununla birlikte, iyi bir ^{Ca2 +} EGTA ile tampon L-tipi Ca ^{2 +} akımı genliği ile indüklenen ^{Ca2 +} geçici genlik ve ^{Ca2 +} geçici bifazik bir çürüme ile sonuçlanır azalttığı bilinmektedir. ^23. Bu nedenle, EGTA ihmal Tipik özellikleri ve tek fazlı bozunur olan ^{Ca2 +} geçici elde etmek için, tüm süreç boyunca izolasyon. Ca ^{2 +} hücreleri korumak için paradoks biz 0.2 mM kadar kademeli bir şekilde depolama çözeltinin nihai ^{Ca2 +} konsantrasyonu artar.

Kollajenaz seçimi muhtemelen başarılı miyosit izolasyon için en önemli adımdır. Geleneksel collagenases Clostridium histolyticum elde edilen ham preparatlar olup diğer proteinazlar polysaccharidases ve lipazlar arasında bir dizi ek kolajenaz içerir. Kendi genel kompozisyon kolajenazlar göre farklı bölünmüştür. ²⁴ Worthington kollajenaz Türleri I ve II başarıyla anda açıklanan protokolde insan atriyal miyositlerin izolasyonu. ^{4-10,15,25-30} için kullanılmıştır biz kollajenaz kullanılmasını tavsiye biz de kollajenaz Tip II kullanarak canlı hücreler kabul edilebilir miktarda elde etmek mümkün olmasına rağmen, ben yazın. Ancak, hatta tek bir kollajenaz tip içinde enzim faaliyetleri ile ilgili önemli bir toplu-seri farklılıklar vardır. Bu varyasyonlar dikkatli toplu seçimi ve izolasyon prosedürü optimize etmek için çeşitli gruplar test gerektirir. Worthington Biyokimyasal Corp (den online olarak mevcuttur toplu-seçim aracı http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php), insan atrial miyosit izolasyonu için uygun olduğu gösterilmiştir bir bileşim ile uygun gruplar bulmak için de kullanılabilir. Şu anda kollajenaz 250 U / mg kollajenaz aktivite, 345 U / mg caseinase aktivite, 2.16 U / mg clostripain aktivite ve 0.48 U / mg triptik aktivite (lot # 49H11338) ile tip I kullanın.

Bu makalede tarif edilen prosedür kullanılarak elde edilen hücreler patch-clamp çalışmaları, ^{Ca2 +} geçici ölçümleri ve ek olarak her iki. ¹⁵ bir kombinasyonu için 8 saat içinde kullanılabilir, bu hücrelerin elektrik alanı uyarılmasına tepki olarak hücre daralma ölçümü sağlar ya da elektrik stimülasyonu yama-kelepçe pipet (yayınlanmamış gözlemler) kullanarak.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
			Taşıma çözeltisi
Albumin	Sigma-Aldrich	A3059	Saklama çözeltisi: 1%
BDM	Sigma-Aldrich	31550	Taşıma çözeltisi: 30
DL-β-Hidroksibütirik asit	Sigma-Aldrich	H6501	Saklama çözeltisi: 10
Glikoz	Sigma-Aldrich	G8270	Taşıma çözeltisi: 20 Ca2+ içermeyen çözelti: 20 Enzim çözeltisi E1 ve E2: 20 Saklama çözeltisi: 10
L-Glutamik asit	Sigma-Aldrich	G1251	Saklama çözeltisi: 70
KCl	Merck	1049360250	Taşıma çözeltisi: 10 Ca2+ içermeyen çözelti: 10 Enzim çözeltisi E1 ve E2: 10 Saklama çözeltisi: 20
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Taşıma çözeltisi: 1.2 Ca2+ içermeyen çözelti: 1.2 Enzim çözeltisi E1 ve E2: 1.2 Saklama çözeltisi: 10
MgSO4	Sigma-Aldrich	M9397	Taşıma çözeltisi: 5 Ca2+ içermeyen çözelti: 5 Enzim çözeltisi E1 ve E2: 5
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	Taşıma çözeltisi: 5 Ca2+ içermeyen çözelti: 5 Enzim çözeltisi E1 ve E2: 5
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Taşıma çözeltisi: 100 Ca2+ içermeyen çözelti: 100 Enzim çözeltisi E1 ve E2: 100
Taurin	Sigma-Aldrich	86330	Taşıma çözeltisi: 50 Ca2+ içermeyen çözelti: 50 Enzim çözeltisi E1 ve E2: 50 Saklama çözeltisi: 10
Kollajenaz I	Worthington	4196	Enzim çözeltisi E1 ve E2: 286 U/ml
Proteaz XXIV	Sigma-Aldrich	P8038	Enzim çözeltisi E1 ve E2: 5 U/ml*
pH			Taşıma çözeltisi: 7.00 Ca2+ içermeyen çözelti: 7.00 Enzim çözeltisi E1 ve E2: 7.00 Saklama çözeltisi: 7.40
ayarlanan madde			Taşıma çözeltisi: 1 M NaOH Ca2+ içermeyen çözelti: 1 M NaOH Enzim çözeltisi E1 ve E2: 1 M NaOH Saklama çözeltisi: 1 M KOH
Aksi belirtilmedikçe konsantrasyonlar mM cinsindendir. BDM, 2,3-Butandiyon monoksim. *Proteaz XXIV sadece Enzim çözeltisi E1'de yer alır.
Tablo I. Çözeltiler.
Naylon ağ (200 μm)	VWR-Almanya	510-9527
Ceketli reaksiyon beheri	VWR	KT317000-0050
Tablo II. Özel ekipmanlar.
Dimetil sülfoksit	Sigma-Aldrich	D2650
Fluo-3 AM (özel paketleme)	Invitrogen	F-1242
Pluronic F-127	Invitrogen	P6867
Tablo III. Miyositlerin Fluo-3 AM ile yüklenmesi için kullanılan maddeler.
4-aminopiridin*	Sigma-Aldrich	A78403	Banyo çözeltisi: 5
BaCl2*	Sigma-Aldrich	342920	Banyo çözeltisi: 0.1
CaCl2 × 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080	Banyo çözeltisi: 2
Glikoz	Sigma-Aldrich	G8270	Banyo çözeltisi: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Banyo çözeltisi: 10
KCl	Merck	1049360250	Banyo çözeltisi: 4
MgCl × 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250	Banyo çözeltisi: 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Banyo çözeltisi: 140
Probenesid	Sigma-Aldrich	P8761	Banyo çözeltisi: 2
pH			Banyo çözeltisi: 7.35
ayarlanan madde			Banyo çözeltisi: 1 M HCl
Tablo IV. Yama-kenetleme (patch-clamp) banyo çözeltisi. *4-aminopiridin ve BaCl sadece voltaj-kenetleme deneyleri için eklenmiştir.
DL-aspartat K+ tuzu	Sigma-Aldrich	A2025	Pipet çözeltisi: 92
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Pipet çözeltisi: 0.02
GTP-Tris	Sigma-Aldrich	G9002	Pipet çözeltisi: 0.1
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Pipet çözeltisi: 10
KCl	Merck	1049360250	Pipet çözeltisi: 48
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Pipet çözeltisi: 1
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Pipet çözeltisi: 4
Fluo-3**	Invitrogen	F3715	Pipet çözeltisi: 0.1
pH			7.20
ayarlanan madde			1 M KOH
Tablo V. Yama-kenetleme (patch-clamp) pipet çözeltisi*. *Deney günlerinde pipet çözeltisi kullanıma kadar buz üzerinde saklanır. **Fluo-3, deney günlerinde 1 mM'lik stok çözeltiden eklenir.