Yöntem makalesi
* These authors contributed equally
Canlı hücre döngüsü analizi için bir protokol Drosophila dokular açıklanmıştır. Bu protokol, eş zamanlı olarak ya da floresan nesilli izleme proteinlerin doku spesifik ifade yoluyla göreli hücre boyutu ile ilgili bilgi, hücre sayısı, DNA içeriği hücre tipi içerir In vivo.
Flow sitometri çok farklı hücre döngüsü aşamalarında göre yüzde anlaması için, bir hücre nüfus DNA içeriği hakkında bilgi edinmek için kullanılır olmuştur. Bu teknik başarılı in vivo hücre döngüsü düzenleme genetik çalışmalar için model organizma Drosophila melanogaster mitotik dokulara uzatıldı. Hücre türüne özgü floresan protein ekspresyonu ve genetik manipülasyonlar ile birleştiğinde, bir hücre sayısı, hücre boyutu ve in vivo olarak aşamalı hücre döngüsü üzerindeki etkileri hakkında ayrıntılı bilgi edinebilirsiniz. Ancak bu canlı hücre yöntemi UV lazer ile donatılmış akış sitometrelerinde kullanıcıları sınırlayıcı, hücre geçirgen Hoechst 33.342 DNA-intercalating boya kullanımı güvendi. Biz daha yaygın mor 405nm lazer ile uyumlu yeni bir canlı hücre DNA boya, Vybrant DyeCycle Violet, kullanmak için bu protokol değiştirdiniz. Burada sunulan protokol, hücre ile birlikte verimli bir hücre döngüsü analizi sağlarDrosophila dokularda çeşitli tip, göreli hücre boyutu ve hücre sayısı bilgiler. Bu protokol tek laboratuvar ölçekte çalışan ve korunabilir bir küçük masa üstü analiz için canlı Drosophila dokular için yararlı hücre döngüsü analizi tekniği, Attune Akustik Odaklama Sitometreyi, uzanır.
Akış sitometri hücre canlılığı, nispi hücre boyutu, DNA içeriği ve canlı hücre popülasyonunda floresan proteini ifade ölçümü için kullanılabilir. S-fazı, bir hücre popülasyonunda DNA içeriği hakkında bilgi boyunca nükleer DNA çoğaltma bağlı olarak farklı hücre döngüsü faz 1-3 görece yüzdeleri belirlemek için de kullanılabilir. Bu yöntem, mayadan memelilere modeli sistemlerinde hücre döngüsü analizi bir taşı haline gelmiştir.
Meyve sineği Drosophila melanogaster hücre döngüsünün düzenlenmesi in vivo analizlerde genetik için mükemmel bir model sistem haline gelmiştir. Sinekler mevcut geniş genetik araçları v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. Yetiştiriciliği Fly
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Şekil 2 sağlanan GFP şablonu kullanarak, doku arka yarısında GFP ifade, bir larva kanat örnek temsilcisi sonuçları gösterir. Benzer sonuçlar, aynı doku tipindeki ve verilen TTT şablon (Şekil 3A) kullanılarak TTT için ekspresyon modeli ile elde edilir. Resim şablonları ve gerilimleri (Tablo 2) larva gözde (Şekil 3B), beyin ve kanatların yanı sıra, pupa gözler, beyinleri (Şekil 3B) ve kanatların analizi için uygundur. Kapılar 5 ve 6 popülasyonlar için FSC.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Burada tarif edilen protokole, hücre döngüsü, göreli hücre boyutu ve nispi hücre sayısı, çeşitli gelişim aşamalarında Drosophila canlı dokularda analizi için olanak sağlar. Bu analiz hücre türüne özgü floresan protein ifade veya izleme soy bağlandığı zaman, detaylı bilgi gizli hücre döngüsü veya büyüme tedirginlikler hücresel yanıtları hakkında elde edilebilir. Beyin hücreleri tutuklandı 90% G1 üzerinde normal olduğunda ilkesinin kanıtı olarak, biz (3D Şekil) bir gelişim aşamasında anormal DNA .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Biz gelişmekte olan ve bu sürüm 10 dayandığı orijinal protokol öğretmek için Aida de la Cruz teşekkür ederim. Buttitta Laboratuarı'nda çalışma NIH hibe GM086517 tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 12x75 mm Polistiren Yuvarlak Alt 5 ml Test Tüpü | BD Falcon | 352058 | 5 ml tüpler | ||||||||||||
| Attune Akustik Odaklama Sitometresi | Yaşam Teknolojileri / Uygulamalı Biyosistemler | 4445315 | Mavi / Mor konfigürasyon | ||||||||||||
| Attune Sitometre Yazılımı (sürüm 1.2.5) | Yaşam Teknolojileri/ Applied Biosystems | Free | Yalnızca PC | ||||||||||||
| Attune Performans İzleme Boncukları (5 x 106 boncuk / ml) | Yaşam Teknolojileri / Uygulamalı Biyosistemler | 4449754 | Günlük performans testi için | ||||||||||||
| Dumont #5 Inox forseps | Güzel Bilim Araçları | 11251-20 | |||||||||||||
| Embriyo tabakları 30 mm x 12mm | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 70543-30 | Cam diseksiyon kapları | ||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | |||||||||||||
| Tripsin-EDTA Çözeltisi (10x) | Sigma | T4174 | |||||||||||||
| Vannas-Tü bingen Bahar Makası | Güzel Bilim Araçları | 15003-08 | Düz 5mm Kesici | ||||||||||||
| Kenar Vybrant DyeCycle Menekşe Leke | Yaşam Teknolojileri/ Invitrogen | V35003 | |||||||||||||
| Tablo 1. Gerekli reaktifler ve aletler. | |||||||||||||||
Canlı DNA Leke Çözeltisi (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ serbest PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ serbest PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibazik), 20mM KH2PO4 (monobazik) pH'a ayarlanmış 7.2 | |||||||||||||||
Tablo 2. Şekil 2. |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste