Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Özet

Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam açıklanır Ex utero Embriyonik fare genelinde hemisferlerin elektroporasyon, diseksiyon ve kültür. Hazırlanması erken kortikal gelişim sırasında gen fonksiyonu farmakolojik çalışmalar ve testler kolaylaştırır.

Özet

Kortikal gelişme nöronlar ve öncü hücreleri, kan damarları, zarları ve ilişkili ekstrasellüler matriks içeren nöronal olmayan elemanlar arasındaki karmaşık etkileşimleri içerir. Onlar uygun bir organotipik ortamı sağlamak için, kortikal dilim eksplantlar genellikle nöronal farklılaşma ve gelişimini kontrol bu etkileşimlerin araştırılması için kullanılır. Yararlı olsa da, dilim eksplant modeli aberan hücresel laminasyon ve göç gibi sakıncaları muzdarip olabilir. Burada kortikal dilimleri ve gösterileri tutarlı organotipik göç ve laminasyon daha hazırlamak kolaydır erken kortikal gelişim çalışmaları için bir bütün serebral hemisfer eksplant sistemi rapor. Bu model sistem, erken laminasyon ve göç yollarını, preplate bölme dönemi de dahil olmak üzere, in vitro iki günlük bir süre için normal prospektif kortikal tabaka boyunca altı formları devam edin. Biz o eski utero elektroporasyon (EUEP) geliştirdidorsal medial korteks gelişen nöronlar GFP hedefleme ~% 80 başarı elde yaklaşım.

Bütün yarımkürede eksplant modeli elektroporasyon, farmakolojik müdahale ve canlı görüntüleme yaklaşımları için erişilebilir erken kortikal gelişim yapar. Bu yöntem transfeksiyon ve alansal hedefleme tutarlılığı hem artırırken utero elektroporasyon (IUEP) yaklaşımlar gerekli sağkalım cerrahi önler. Bu yöntem nöronal proliferasyon, göç ve farklılaşma deneysel çalışmalar kolaylaştıracaktır.

Giriş

Gittikçe üretilen nöronların uyumlu proliferasyon, göç ve farklılaştırılması yoluyla memeli serebral korteks formları. Her bir nöron ventriküler zonunda (VZ) doğdu ve kortikal plaka (CP) ¹ oluşturan, ara bölge (IZ) içine VZ göç ediyor. Edilir Onlar farklı kortikal alanları geçerken, göç nöronlar gelişmekte doku içindeki ekstraselüler çevre ve diğer hücresel elementler (örneğin radyal glia) bağlıdır göç ^2,3 çoklu ekran modları. Kortikal nöronlarda sonra nöronal göç yakalanması ve dendritogenesis ⁴ çakışık süreçlerinde şekillendirme kortikal plaka üstünde göç tutukla.

Kortikal gelişme embriyonik gün....

Protokol

Plazmid Yeşil Floresan Protein Ekspresyonu ile 1. Ex utero Electroporations

1. Plazmid DNA enjeksiyon çözeltileri GKD ₂ O. içinde 0.33 mg / ml 'lik nihai konsantrasyona seyreltildi çalışma CAG-eGFP DNA ²⁷ ile hazırlanır Qiagen Endo-Free Maxi-Preps dönüştürülmüş bakteriler plazmid arındırmak için kullanılır. ~% 0.02 (w / v nihai) çabuk bir yeşil boya enjeksiyon İzleyici olarak DNA çözeltisine ilave edilir.
2. Cerrahi alan hazırlamak için,% 70 etanol çözeltisi ile tezgah üstü ve diseksiyon mikroskop sahne yıkadığınız ve kurulayın. Öncesinde diseksiyonu% 70 etanol ile cerrahi makas ve forseps püskürtün ve kurulayın.

Sonuçlar

Embriyonik kemirgen korteks gelişim dönemi boyunca bir enine nörogenetik degrade sergiler, öyle ki yanal neokorteks dorsal medial neokorteks ²⁸ yaklaşık 1 gün daha olgun olduğunu. Katman 6 nöronların toplu böylece lateral korteks bölgesindeki E12 üzerinde (ayrıca Saha 40 ⁵ denir) ve E13 de dorsal medial korteks (ayrıca Tarla 1 ⁵ denir) (S-fazı nihai sergilemek gibi) oluşturulur. Preplate yarma Katman 6 nöron üretimi yaklaşık 1 gün sonra başlar ve böylece E13 üzerinde lateral kor.......

Tartışma

Biz gelişmiş ve deneysel modelini değerlendirdi - Bütün yarımkürede eksplantlar - erken kortikal gelişim çalışması için (E13-E15). Modeli serebral korteks ^25,37 tabaka 6 teşkil eksitatör nöron soy göç ve farklılaşma analizi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Sistemin prensibi avantajları hazırlık sadeliği ve beyin gelişiminin bu erken, kritik döneminde elektroporasyon, Farmakolojik manipulasyon ve görüntüleme için nöronlara 3) deneysel erişim)) 2 DIV organotipik büyüme, 2 1 vardır. Biz morfolojisi, yönelim v.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifler< / güçlü >
DMEM / F12 + GlutaMAX	GIBCO	10565
G5 Takviyesi 100X	Invitrogen	17503-012
B27 Serumsuz Takviye 50X	Invitrogen	1504-044
Kalem / Strep Sıvı 100X	Invitrogen	15140-122
HBSS 500 ml	GIBCO	14025
Kültür eki kollajen kaplı	Costar	3492
Sığır derisi jelatini	Sigma	G9382
H & # 8211; chst 33342	Invitrogen	H1399
Sığır Serumu Albümin	Sigma	7906
EndoFree Plazmid Maxi Kiti	Qiagen	12362
< güçlü > Ekipman< / güçlü >
BTX 830 Elektroporatör	Harvard Aparatı	450052
Cımbız elektrotları 10mm	Harvard Aparatı	450166
Kuluçka	makinesi Billups Rothenberg	MIC-101
Hamilton şırınga (5uL)	Hamilton	87930
Hamilton şırınga iğnesi	Hamilton	7803-04	1" ve stil 4'ü belirtin
Dumont #5 Forseps	FST	11251-10
İnce Makas Sert Kesim 9 cm	FST	14058-09