Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kültür birincil kardiyomiyositlerindeki (CMS) kullanımı, kalp hastalığı anlayışımızı ilerleyen kalp hastalığı olan kemirgen modellerinde güçlü bir tamamlayıcı sağladı. Özellikle, hasta koşulları ve hastalığa neden olan mutasyonlar ile iyon homeostazı, iyon kanalı fonksiyonu, hücre uyarılabilirliğini ve uyanlma-kasılma kuplajı ve değişiklikler çalışma yeteneği kalp hastalıkları hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, kültür yetişkin CMS taklit etmek yeterli ölümsüzleştirdi hücre hattı eksikliği ve yenidoğan CMS sınırlamaları (erişkin CMS yapısal ve işlevsel biyomekanik özelliği nedeniyle birçok eksikliği olan), sinyal yolları arasındaki karmaşık etkileşimin anlayışımızı engel var iyon kanalları ve erişkin izole kardiyomiyositlerin okuyan önemini güçlendirilmesi erişkin kalp kasılma özellikleri. Burada, adenoviral-Expre ile gen ekspresyonunun izolasyon, kültür, manipülasyon için yöntemler sunmakssed proteinleri ve erişkin fare kardiyomiyositlerin sonraki fonksiyonel analiz. Bu tekniklerin kullanımı hücresel eksitabilitesi düzenleyen yolları, Ca 2 + dinamiklerini ve kasılma sinyalizasyon içine mekanik anlayış geliştirmek ve kardiyovasküler hastalık çok daha önemli fizyolojik karakterizasyonu sağlamak için yardımcı olacaktır.
Giriş
Kalp-damar hastalığı olan kemirgen modellerinde potansiyel terapötik hedefler 1,3 belirlenmesi için temel bir hastalık mekanizmalarının 1,2 açıklık yanı sıra için etkili araçlar olarak hizmet etmişlerdir. Özellikle, (örneğin basınç aşırı olarak) edinilmiş kalp hastalıklarının hem kemirgen modellerinde 4,5 ve transgenik fare modellerinin kullanımının kalp hastalığı 6-8 anlayışımızı gelişmiş var. Tek hücre düzeyinde kalp 11-13 hücre uyarılabilirliğini ve uyanlma-kasılma kaplin altında yatan tek tek proteinler de sinyal iletim 3,9,10 ve değişiklikler çalışma hücre kültürü tekniklerinin kullanımı in vi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Kardiyomyosit İzolasyon
Malzeme (Şekil 1)
Forseps Microdissecting
Doku forseps
Narin hemostatik forseps
Hemostatik forseps
Microdissecting, tırtıklı, kavisli forseps
Çalışma makas, düz
Çalışma makas, kavisli
15 ml Falcon tüpleri (5)
60 mm Petri
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)
Naylon Mesh - 400 mikron gözenek boyutu
Küçük huni
Balmumu kaplı, örgülü ipek 4-0, 19 mm uzun, 7-10 cm
Non-derialtı iğne, küt uç, 24 G veya ticari hayvan besleme iğne (W/1-1/4, 24 x 1)
Heparin sodyum
Ketamin / ksilazin k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Çubuk şeklinde, çizgili ve (kendiliğinden dayak değil) hareketsiz hücrelerde (Şekil 5A) yetişkin cardiomyoctyes sonuçlarının izolasyonu. Ölü hücreleri yuvarlak bakmak ve hiçbir çizikleri mevcut olacaktır. Hareketsiz hücreler kültürlendi ve gen ekspresyonu (Şekil 5B ve 5C) işlemek için adenovirüs ile transfekte edilmiş olabilir. Kültür 24 saat, canlı hücrelerin morfolojisi değişmez sonra hala Ca2 +-toleranslı ve bunlar saha uyarısıyla tempolu edilebilir. Öneri.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, fare kalp başarılı izolasyonu ve yetişkin CMS kültürü için gerekli teknikleri tarif var. Bizim teknik, yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak CM fonksiyon uyarılma ve daha sonra çalışma için izin verir. Yetişkin CMS işlevselliğini eğitim için kritik parametre izole CMS sağlık ve kalitesidir. Yukarıda tarif edildiği gibi, teknik adenoviral / lentiviral kültüründe enfeksiyonları ve hücresel uyarılımın ve kontraktil fonksiyon analizi kullanılarak gen ekspresyonunun manipülasyon için uygun olan fonksiyonel b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sodyum Klorür | Sigma | S7653 | |
| Potasyum Klorür | Sigma | P9333 | |
| Magnezyum Klorür | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodyum Fosfat Monobazik | Sigma | S8282 | |
| D-glikoz minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurin | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Bütandion monoksit | Sigma | B0752 | |
| Kollajenaz B | Roche Uygulamalı Bilimler | 11088807001 | |
| Kollajenaz D | Roche Uygulamalı Bilimler | 11088858001 | |
| Streptomyces griseus Sigma'dan Proteaz XIV | Sığır Serumu Sigma'dan | ||
| Albümin | A2153 | ||
| Kalsiyum Klorür | Sigma | C8106 | |
| Minimum Esansiyel Medya | Sigma | 51411C | |
| Sigma | A8412 | Sigma'dan elde edilen albümin çözeltisi | |
| G3126 | |||
| Penisilin-Streptomisin | Sigma | P4333 | |
| İnsülin-transferrin-sodyum selenit ortamı ek | Sigma | I1884 | |
| Sezyum Klorür | Sigma | 289329 | |
| Glutamat | Sigma | G3291 | |
| Adenozin 5'-trifosfat magnezyum tuzu | Sigma | A9187 | |
| Etilen glikol-bis(2-amin– thylether)-N, N, N ', N'-tetraasetik asit | Sigma | E3889 | |
| Sezyum Hidroksit Çözeltisi | Sigma | 232041 | |
| Tetraetilamonyum hidroksit çözeltisi | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optik cam dürbün vizörü | Dohegan Optik Şirketi A.Ş. | N/A | |
| Doku forsepsleri, 5.5", 1x2 dişler | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forseps - 4.5" (11.5 cm) uzunluğunda hafif eğri, tırtıklı | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forseps, Dumostar, uç boyutu 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Paketleyici Sivrisinek Forseps 5" Düz Düz | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Mikro Diseksiyon Makası 4.5" Kavisli Keskin/Keskin | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Mikro Diseksiyon Makası 3.5" Düz Keskin/Keskin20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
Kaynaklar
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse asce....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
