Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Özet

Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme (TED) floresan görüntüleme ile hücre içi kalsiyum deposu dinamiklerinin analizini destekler. Yöntem sentetik düşük afinite Ca yerel maskesinin geliştirir endoplazmik retikulum (ER), bir rekombinant karboksilesteraz hedeflenmesi üs ^{2 + göstergesi boyalar.}

Özet

Kalsiyum dinamikleri görselleştirme hücre fizyolojisi kalsiyum rolünü anlamak önemlidir. Kalsiyum dinamikleri incelemek için, sentetik floresan Ca ^{2 +} göstergeleri, popüler olmuştur. Burada TED (= hedef-esteraz bağlı boya yükleme), Ca ² serbest bırakılması geliştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır ⁺ farklı hücre tipleri ER lümeninde göstergesi boyalar. Bugüne kadar, TED hücre hatları, glial hücreler, in vitro ve in nöronlar kullanılmıştır. Vektör yapıları kullanarak ER lümen yüksek bir karboksilesteraz faaliyet hedefleyen etkin, rekombinant üzerinde TED üsleri olduğunu ifade karboksilesterazdan (CES). En son TED vektörleri böylece aynı anda iki-renkli görüntüleme sağlayan kırmızı floresan proteini kaynaşmış CES2 temel bir öğesi içerir. Ilgili ER yapısı kırmızı görünürken ER serbest kalsiyum dinamikleri, tek bir renkte görüntülü. Prosedürün başlangıcında, hücreler bir lentivirüs ile transduse edilmiştir. Daha sonra, enfekte olmuş hücreler,yeniden nihayet canlı hücre görüntüleme sağlamak için lamelleri numaralı seribaşı. Daha sonra, canlı hücrelerin asetoksimetil ester (AM-ester) düşük afinite Ca ² formu inkübe edilir ⁺ göstergeleri, örneğin Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, veya Mag-Fura2-AM. ^{Ca2 +} göstergesi ve hidrofilik bir floresan boya / Ca ^{2 +} kompleksi, AM formundan hidrofobik yan zincirler kapalı ER bölmektedir içinde esteraz oluşan ve ER lümeninde tutulur. Boya Yükleme işleminden sonra, hücreler, bir ters konfokal lazer tarama mikroskobu de analiz edilmiştir. Hücreler sürekli Zil benzeri çözümleri ile perfüze ve Acil kalsiyum dinamikleri zaman atlamalı görüntüleme doğrudan görsel vardır. ER kalsiyum deposunun dolum floresan bir artış üreten ise ER kalsiyum açıklaması, ilgi bölgelerinde floresan azalma ile tanımlanır. Son olarak, zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişiklik kadar taşınmış / F ₀ hesaplama ile belirlenmektedir.

Giriş

ER fizyolojik kalsiyum yanıtları çözmek için, biz ER içine sentetik kalsiyum hassas boyaların yakalama artırmak için yeni bir strateji geliştirdi. Bu yöntem hücre dışı kalsiyum varlığında serbest ER kalsiyum doğrudan, olmayan yıkıcı gerçek zamanlı izleme sağlar.

ER Kalsiyum fonksiyonu ve sinyal

Kalsiyum sinyalleri farklı hücre tipleri, örneğin kas hücreleri, nöronlar ve öğrenme ve hafıza ^1,2 sinaptik iletim bir katılımı kas kasılması aracılık gelen glial hücreler ve işlevleri aralığında bulunur. Kalsiyum gen transkripsiyonu, hücre çoğalması, nöronal uyarılabilirliği, hücre ölümü ve olaylar ^1-7 sinyalizasyon diğer hücre düzenlenmesinde yer almaktadır, çünkü serbest kalsiyum konsantrasyonunu değişiklikler yüksek bir bilimsel ilgi vardır. Bütün bu hücre içi kalsiyum sinyalleri işlevsel olarak bağlı ve hücre içi kalsiyum katkıda bulunmaktadırmağaza dinamikleri ^8-10.

Tüm kalsiyum sinyalleri arasında ortak bir özelliği hücre dışı alan arasında kalsiyum akışını, sitoplazmada ve organeller, özellikle ER ve mitokondri olduğunu. Bu, farklı sinyal bileşenleri tarafından algılanır ve bu organellerin içinde kalsiyum konsantrasyonunda dinamik değişiklikler olur. Genel olarak, 100-800 uM arasındaki ER aralıkları içinde kalsiyum konsantrasyonu, sitoplazmada kalsiyum konsantrasyonu yaklaşık 100 nM, ve hücre dışı ortamda konsantrasyon 1-2 mm civarındadır. Buna göre, sitoplazmada ^2,9,10 doğru kalsiyum akışı için yüksek bir kimyasal itici güç vardır.

En yaygın olarak incelenmiştir ER-türevi kalsiyum sinyaller daha sonra fosfolipaz C (PLC), aktive G-protein bağlı reseptörler (GPCR), uyarımı bağlıdır. Da PLC inositol 1,4,5-trisphosphate (IP ₃₎ ¹ üretir. Onun rec IP ₃ bağlayıcı üzerineeptor (IP _3-Rec, Şekil 1) ER-membran, kalsiyum iyonları ER lümeninde salınır. Tarihsel olarak, ER IP _3-aracılı kalsiyum sürümü ilk - bile dolaylı - Streb ve arkadaşları tarafından asiner pankreatik hücrelerde ölçülen 1.983 ^11.. Bu yayın, ilk kez önerilen asetilkolin, fosfolipaz C ve IP ₃ içeren bir sinyal akışında. Kalsiyum serbest Bu şekilde genellikle IP _3-bağlı kalsiyum sürümü (IiCR) (Şekil 1) olarak adlandırılır. Reseptör tirozin kinazlar, bağlantılar IP ₃ yükseklik ¹² sonra sinyal ER kalsiyum büyüme faktörleri ve nörotrofik faktörlerin etkisi ile fosfolipaz Cγ arasında kinaza bağımlı aktifleştirme. IiCR ek olarak, kalsiyum yüksekliği riyanodin Re, voltaj-bağımlı kalsiyum kanallarının (Ca _V) ve daha sonra kalsiyum ile indüklenen kalsiyum tahliyesinin (CICR) ile, örneğin, iyonotropik kalsiyum girişini aracılık edilebilirreseptör (RYR). IiCR ve CICR fizyolojik mağaza ile çalışan kalsiyum girişi (Soce) ile bağlantılıdır. Soce ER kalsiyum serbest bırakılması için bir sensör STIM (stroma etkileşen molekül), bir işlem içerir. STIM geçici reseptör potansiyel bir kanal (Trp) ^13, Orai kalsiyum kanalları ¹⁴ ve hatta voltaj kapılı kalsiyum kanalları ¹⁵ (Şekil 1) yoluyla hücre-dışı kalsiyum girişini teşvik ettiği gösterilmiştir. ER kalsiyum kaybı dinamik aktif pompalar kalsiyum geri ER içine Sarko-endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA), bir eylem tarafından kurtarılır. Bu thapsigargin gibi ilaçlar ile SERCA Engelleme sitozolik bölmesine ER kalsiyum sürekli bir kaybı tanıttı. Bu ER kalsiyum "kaçak" gibi Sec61 protein kompleksi ^16,17 (Şekil 1) olarak ER intramembrane gözenek kompleksleri neden olur.

1998 yılında, Berridge bir model, "bir nöron modeli içinde nöron", hangi yayınlandıh nöronal kalsiyum ⁵ entegre ER bir ilke fizyolojik rolünü göstermektedir. Bu model nöronal plazma zarı ⁵ bir hücre içi "görüntü" oluşturan sürekli ER membran sisteminin varlığını dikkate alır. Bu ikili ökaryotik membran sistemi nöronlarda hızlı ve yavaş kalsiyum sinyallerinin zamansal ve mekansal entegrasyonu için temel bir ön koşul olduğu iddia edildi. Aynı nöron farklı dikenler veya dendritler eş zamanlı veya daha sonra da meydana kalsiyum sinyalleri hücrenin soma ya da ^5,18 toplanır ER, ile çekirdeğine veriliyor. Daha sonra, bunların toplamı sinyal şelaleden gen transkripsiyonu veya entegrasyon nöron, düzenleme heyecanlanma üzerinde etkileri olabilir. Bu nedenle, ER kalsiyum sinyallerinin birleştirilmesi destekler. Bu kavram için bir ön koşul çeşitli çalışmalar tarafından iddia edilmiştir ve en az somato-d kanıtlanmıştır ki tek bir hücre, içinde ER sürekliliği olanendritic alanları ve kısa bir mesafe aksonal projeksiyonlar ^19-21. Uzun aksonal projeksiyonlar içinde ER süreklilik olup olmadığını tartışma meselesidir.

ER membran üzerinden ücretsiz kalsiyum akışını ölçmek için Stratejiler

Kalsiyum sinyalleri en sık sitoplazmada ^22,23 izlenir. Bu nedenle, kolaylıkla hücre dışı ^{Ca2 +} veya ^6,24 hücre içi mağazalarından sitozolüne akan olup olmadığını ayırt edilemez. Bu sınırlama üstesinden gelmek için, doğrudan ER kalsiyum görüntüleme için metodolojik stratejiler geliştirilmiştir. Özet olarak, aşağıdaki stratejileri kullanılmıştır:. (1) genetik olarak işlenmiş protein göstergeleri: ^25-27 protein tabanlı, düşük afiniteli bir ^{Ca2 +} göstergeleri, bir kalsiyum algılama proteini ile kombinasyon halinde biyolüminesans proteini aequorin veya GFP kullanımı ER-hedefli. Bu genetik Ca ^{2 +} göstergeleri (GeCIS) canBir sinyal peptidi yardımıyla ER hedeflenebilir ve aktif bir saklama ve geri çağırma motifi kullanılarak ER tutulur. Cameleon bölünmüş YC7.3ER ²⁹ ve Cameleon D1 ³⁰ ve Cameleon ilkesine Ortak ER Ca ^{2 +} göstergeleri baz Cameleon YC4.3 ^26,28 bulunmaktadır. AM-ester düşük afinite Ca ² (2) Doğrudan esteraz tabanlı boya yükleme ⁺ göstergeleri ^31,32. Gösterge boyaların (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM veya Fluo5N-AM)-türevleri AM geçmek bir lipofilik, kalsiyum-duyarsız durumda biyolojik membranlar. Daha sonra, sitoplazmada gibi ER, endojen esterazlar AM-ester grubunun yarılma ve sitoplazmada aktif olan boya belirli bir miktarda arkasında ve ER bırakarak, ^{Ca2 +} göstergesi bırakın. Sitozolik kalsiyum konsantrasyonu de de altında kalır Bu nedenle, bu yaklaşım sürece ER yüksek bir kalsiyum konsantrasyonu koşulları altında yararlıdırözellikle karakteristik kalsiyum sinyalleri (düşük mcM örneğin nM) sırasında düşük afinite göstergelerin koruması sınırı,. Plazma zarının geçirgenliği ³² ile birlikte (3) AM ester yükleme., Kalan sitosolik ^{Ca2 +} gösterge yapay bir hücre içi tampon içinde bir "hafif" deterjan (örneğin saponin) küçük miktarlarda bulunan plazma membran geçirgenliği ile çıkarılır. Bu nedenle, hücre içi zarlar doğrudan plazma zarında "gözenekler" yoluyla, hücre içi tampon IP ₃ ile, örneğin, güdülenebilir. (4) Ca ² tam hücre konfigürasyonu ve eş zamanlı ölçüm altında sitoplazmada Diyaliz ⁺ ER lümeni ve sitosol içinde ^32,33. Bir hücre olanlar, düşük afiniteli bir ^{Ca2 +} göstergesi (örneğin, Mag-Fura2-ile yüklenir AM,), rasyometrik UV ışık. Daha sonra, bir yama pipet, herhangi bir geri kalan cyt yardımıylaosolic düşük afiniteli bir ^{Ca2 +} göstergesi Yüksek afiniteli bir ^{Ca2 +} göstergesi (örneğin, Flu-3, görünür ışık) ihtiva eden bir tampon maddesi ile sitoplazmada üzerinden dializ edilir. Bu strateji, sitosolik ve ER türetilen sinyallerin eş zamanlı kayıt sağlar. (5) Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme ^8,34. Bir karboksilesteraz (CES) ER lümenine hedefleyen ve düşük afinite Ca ^{2 +} göstergelerin AM-ester formunun etkin yakalama için yüksek esteraz aktivite sağlar.

Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme (TED)

ER lümen için düşük afinite Ca ^{2 +} göstergelerin hedef artırmak için, TED geliştirilmiştir. TED ekspresyon yapıları ile elde edilir, bir ER hedeflenen fare karboksilesteraz (CES2) (Şekil 2), bir aşırı gerektirir. Yeniden birleştirici bir yapı CES-salgılayan hücrelerin bir kalsiyum AM-ester şekli ile inkübe edilirdicator boya (Fluo5N-AM, Şekil 2). Daha sonra, ER, boya Ca ^{2 +} dönüştürülür duyarlı membran geçirgen ^Ca2 nedenle ER lümeninde ⁸ de yüksek bir konsantrasyon olarak, boya tutucu yüksek esteraz ile ⁺ göstergesi kompleksi (Fluo5N/Ca ^{2 +), , 34.} Yöntem SERCA ¹⁷ abluka sonra örneğin doğrudan "kaçak kanalları", ile metabotropik, purinerjik-veya glutamat reseptörleri ^8,34 ile örneğin IiCR-yollardan ER kalsiyum-serbest araştırmak ve ER kalsiyum tükenmesi görselleştirmek için özellikle yararlıdır ^{, 34.} Deneyimlerimizi için düşük afinite Ca ^{2 +} göstergesi Fluo5N-AM şu anda TED boya yükleme stratejisi ile kullanmak için mevcut en iyi göstergesidir. Fluo5N-AM, ^{Ca2 +} için düşük bir afiniteye sahiptir (ayrışma sabiti _Kd ~ 90 uM, Şekil 2), hemen hemen-floresan ile AM-formunda olduğu, ancak calciu üzerine yüksek floresans emisyon içerirm bağlayıcı ^8,34. Fluo5N/Ca ^{2 +} kompleksi gibi FITC, Alexa 488 veya eGFP gibi standart boyalar karşılık ~ 490 nm standart bir ışık kaynağı ile heyecanlı olabilir. Sitosolik kalsiyum sinyalleri hemen hemen düşük uM aralığında bir konsantrasyonuna ulaşmak ve bu ancak sitoplazmada Fluo5N ³⁵ tarafından tespit edilir.

TED performansını artırmak için, birkaç rekombinant vektör yapıları (Şekil 3) geliştirilmiştir. Başlangıçta, CES2 kodlama dizisi (RefSeq katılım sayısı NM_145603, CES2c) ve en iyi TED performansa dayalı TED vektörler CES yapıları istikrarlı ifade ile görülmektedir. Yeni TED vektörler kırmızı floresan proteini TagRFP-T2 ³⁶ erimiş CES2 temel bir unsuru ifade eder. Bu vektörler hücrelere transduse tespit etmek ve Fluo5N/Ca ² değişikliklerin normalizasyonu için bir iç kontrol olarak, kızıl flüoresans kullanmak için kullanılabilir olması avantajına sahiptir ⁺ floresan. Kırmızı floresan da stimülasyon koşullar altında ER ve ER dinamikleri değişikliklerin yapısal dağılımı görselleştirmek için imkan sunuyor.

Protokol

Bu protokol, TED hücre hatları, hipokampal, kortikal glial hücreler uygulanır getirmektedir. TED performans iyi TED vektörleri stabil lentiviral vektörler tarafından örneğin, ifade olduğunda. TED yöntemin şematik bir genel görünüşü Şekil 4 'de gösterilmiştir.

1. Çözeltilerin hazırlanması

Aşağıdaki çözümleri başlamadan önce hazırlanmalı ve belirtildiği gibi saklanabilir. Biz genellikle steril cam ve plastik malzeme ve otoklava su kullanın.

1. 125 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 2 CaCl _2, 1.25 ₂ PO ₄ NaH H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O:. HEPES-Ringer (mM) hazırlayın 127 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 1.25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O ve 0.1 EGTA: Kalsiyum-ücretsiz HEPES-Ringer (mM) oluşur.. Glikoz olmadan bu görüntüleme çözümleri b olabilir4 saklanan E ° C D-glikoz gerekli miktarda taze kullanımdan önce ilave edilir.
2. Hipokampal nöronlarda TED analizi için, yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) önerilir. ACSF (mM olarak) oluşmaktadır: 127 NaCl, 23 _NaHCO3, 3 KCI, 2.5 NaHPO _{4H 2,} O, 25 D-glucose.H _2, O, 2 _{CaCl2, MgCl2} 2 .7 H ₂ GKD 0. ₂ 0.
3. Hazırlama 5 mM bir konsantrasyona kadar Fluo5N-AM. Çözündürme liyofilize Fluo5N-AM, 50 mg,% 20, Pluronic F-127 (DMSO içinde, nem ve ışıktan korunan, oda sıcaklığında) 8.9 ul ekleyin yardımcı olmak için. Daha sonra en az 2 dakika süreyle su banyosunda sonikatör ile Fluo5N-AM çözünür. Mağaza alikotları à -20 ° C'de 0.5 ul, ışık ve nemden korunmalıdır.
4. Gerektiğinde antagonistinin ve agonisti stokları hazırlayın. Örneğin: H ₂ O (agonist a), 10 mM ATP ve ADP ₍₂ H, O, purinerjik reseptörlerin metabotropik aktivasyonu), b), 10 mM karbakolmuskarinik asetilkolin reseptörü) ve c), DMSO içinde 30 mM siklopiazonik asit (CPA) (SERCA arasında bloke edicileri), d), PBS içinde 50 mM DHPG (mGluR _I mGluR ve ₅ için, metabotropik glutamat reseptör agonisti), e) H, 10 mM Glutamatın DMSO içinde ₂ O, F), DMSO (iyonofor), g, 1 mM ionomycin), 5 mM thapsigargin (SERCA yüksek afinite engelleyici). -20 ° C de saklayınız alikotları
5. Lentiviral vektörleri: Bu protokol lentiviral TED ifade vektörü parçacıklarının kullanımını içerir. Onların üretim ve depolama bu protokolün bir parçası değildir. Bu hücre hatları, gliyal hücreleri ve nöronların rekombinant karboksilesteraz'lann transferini ikinci nesil lentiviral vektörleri kullanarak. Ifade vektörü FUGW ^37, ve ambalaj plazmid pCMVΔR8.91 veya psPAX2 ve pMD2.G ^38,39 plazmid pseudotyping bizim lentiviral sistemi üsleri DİKKAT:. Rekombinant kendini inaktive lentiviral vektörler ile iş dikkatli gerektirir düşününbiyogüvenlik kurallar dikkate. Birçok ülkede, bu vektörler biyolojik tehlike risk grubu 2 olarak sınıflandırılır. Bakın daha fazla bilgi için http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Hazırlık ve Fare Hipokampal nöronlar Viral Enfeksiyon

1. Yaklaşık olarak 30 dakika için% 70 etanol içinde 20 cm çapında (tabak başına 100 lamelleri), 1x bir cam petri kabı cam lamelleri yıkayın. Son olarak, 2 dakika boyunca% 100 etanol (PA) ekleyin. Artık etanol çıkarın ve steril bir başlık altında lamelleri kurulayın.
2. B27 01:50 ile neurobasal orta, Glutamax 1:100, ve N2 ek 1:100:, (b) tam orta B27 01:50 ile (a) neurobasal orta: hipokampal nöron kültürleri için medyanın iki farklı hazırlayın. Steril süzüntü medya ve kullanıma kadar hücre inkübatör saklayın.
3. Önce diseksiyon bir gün, lamelleri önce her bir steril 10 mm lamel koyarak hazırlanırde bir 4-kuyulu hücre kültürü çanağı. Daha sonra, dikkatli bir şekilde her bir kat 80-100 ul% 0.1 Poli-L-lisin ile lamel ve gece boyunca bir inkübatöre yemekler saklayın.
4. Diseksiyon ve hücre kültürü gününde, 100 ul HBSS ile lamelleri üç kez yıkama ile başlar ve her lamel 100 ul neurobasal orta aktarın. Dengeleme için bir kuluçka (farelerin diseksiyonu sırasında örneğin) içine yemekleri yerleştirin.

Teşrih

Biz kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış Avrupa Birliği kurallarına uygun olarak fareler ile deneyler.

5. Toplam beyin çıkarın ve hippocampi bilateral incelemek.
6. Dikkatlice zarları ve hipokampus ve yer dışında doku bir hipokampus 450 ul HBSS içeren 1.5 ml tüp her çıkarın. Hipokampi yeterli sayıda izole edilmiş kadar buz üzerinde doku saklayın.

Hücre kültürü

7. Her tüpe 50 ul% 1 tripsin (Worthington) ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde inkübe bunları. Bazen tüpleri çalkalayın. Sindirim reaksiyonu durdurmak için her bir tüp, 50 ul% 1 tripsin inhibitörü ekleyin ve tüp birkaç kez ters çevirin.
8. Hippocampi sıvı transferi kaçınarak bir 15 ml şahin tüp 5 kadar her doku transferi. 5 ml'lik bir hacme B27-ortam (a) ekleyin.
9. Dikkatli bir şekilde aşağı yukarı pipetleme ve bir yangın cilalı Pasteur cam pipet kullanarak doku Karışım DİKKAT:. Hava kabarcıkları kaçının!
10. 3 dakika boyunca 400 x g ile dönüş, süpernatan aspire ve 5 ml B27-ortam (a) 'da hücre pelletini.
11. , 1000 ul plastik filtre yardımı ile iki kez daha sonra cam pipet ile bir kez daha doku Karışım, vb. Gibi adımları 2.9 ve 2.10 'da açıklanan bu gerçekleştirin.
12. Son santrifüj işleminden sonra, 2 ml tam Mediu'nun olarak hücre pelletini200 ul plastik filtre ucu hücreleri m (b) ve çiğnemek. Tek hücre süspansiyonu kalan hücre kümeleri ayırmak için, hücre kümeleri 1-2 dakika yerleşmek izin.
13. Hücre sayımı ve viral enfeksiyon için gerekli hücrelerin toplam sayısını hesaplamak. TED görüntüleme için 10 mm lamel başına 25.000 hücreleri kullanır.
14. Bir kontrol olarak kaplama ek 25.000 olmayan transduced hücreleri bu noktada tavsiye edilir.

Viral Enfeksiyon

15. Yeni bir 15 ml Falcon tüpü ve 400 x g de 3 dakika boyunca santrifüj içine viral enfeksiyon için hücre süspansiyonu aktarın.
16. Süpernatan aspire ve 300 ul ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri (B)
17. Bulaşıcı lentiviral TED ekspresyon vektörü taneciklerin, uygun bir miktarda eklenir ve Falcon tüpü 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir.
18. Kaplama (her biri 10 mm lamel boyunca 100 ul) için gerekli olan son hacim olması için tam bir ortam (b) ile tüp doldurun yüzeyleri bulunan ortamı aspireerslip ve hemen her lamel üzerine 100 ul hücre süspansiyonu yerleştirin.
19. Tüm hücreleri yerleşti (yaklaşık 2 saat) ve 2 ml orta (b) içeren kadar dikkatli yemekleri doldurmak kadar inkübatör içine yemekleri yerleştirin.
20. Nöronlar, en az bir hafta süreyle büyümesine izin. Her hafta, orta% 50 değiştirin.

3. Fare Kortikal glial hücre kültürü ve viral enfeksiyonu

Hazırlık

1. 4 ml 0,5 ng / ml 'poli T75 hücre kültürü şişesi, bazal glia ortamı (% 10 FCS ile DMEM/F12 1:1 karışımı,% 5 HS,% 1 penisilin / streptomisin,% 0.45 glukoz) ve kaplama hazırlayarak başlayın -DL-ornitin hidrobromür (PORN) (150 mM borik asit solüsyonu, pH değeri 8.35 ile seyreltilir). 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübasyondan sonra, gece boyunca, HBSS ile hücre kültürü şişesi üç defa yıkamak ve B27 01:50 ve 10 ng / ml EGF içeren 18 ml bazal glia orta ekleyin. Inkübatör hücre kültürü şişesi (en fazla 3 saat) dengelenmesi.

Diseksiyon

1. Biz kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış Avrupa Birliği kurallarına uygun olarak fareler ile deneyler.
2. Bir P5-P7 fare beyin incelemek ve 2.5 açıklandığı gibi her iki yarımkürede gelen hipokampus ve meninks çıkarın.
3. Frontal korteks incelemek, birkaç küçük parçalar halinde kesilmiş ve HBSS içeren 1.5 ml tüp bunları toplamak. Buz tüpü saklayın ve hücre kültürü kısmına geçin.

Hücre kültürü

4. Tüpünden yangın parlatılmış cam pipet kullanarak 15 ml şahin tüp tüm doku aktarın.
5. 5 ml son hacim bazal orta ekleyin ve bir yangın parlatılmış cam pipet ile aşağı birkaç kez pipetleme ve ile doku çiğnemek. 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj işleminden sonra, ortam aspire edilmiş ve 5 mL bazal ortamı içinde hücre pelletini.
6. Iki kez 3.5 adımı tekrarlayın.
7. Thi sonraRd santrifüj, B27 (1:50) ve 10 ng / ml, EGF içeren 2 ml bazal ortam içinde glia hücre pelletini.
8. Bir kez daha Titruate ve hazırlanan T75 hücre kültürü şişesine hücre süspansiyonu transfer ve hücreler 3-4 gün süreyle büyümesine izin.

Glial hücrelerde (kültür 3-4 gün sonra) Yıkama:

9. 10 ml PBS ile bir kez hücreleri yıkayın ve diğer elinizde sıkı tutarken şiddetle, dokunun veya hafifçe elinizle şişeyi birkaç kez vurdu. Bu adım, hücre artıkları ve hücre kümeleri ile kültür kaldırılır.
10. PBS aspire ve B27 (1:50) ve 10 ng / ml EGF içeren taze bazal glia orta ekleyin. Hücrelerin% 80 confluency ulaşana kadar daha 5-7 gün boyunca kültür yetiştirmek.

Yarma, iletimi ve glial hücre son tohumlama:

11. 100 ul Poly-D-lisin ile kat 10 mm lamelleri: ve inkübe (stok çözeltisi 0.1,% 1/50 AD 20 ug / PBS veya HBSS içinde seyreltilmiş mi)onları gece boyunca bir inkübatör. HBSS ile lamelleri üç kez yıkayın ve 100 ul bazal glia orta ekleyin. Inkübatör lamelleri (3 saat) dengelenmesi.
12. 10 ml PBS ile iki kere yıkayın glial hücreler, PBS aspire ve 3 ml tripsin (TrypLE, seyreltilmemiş) ilave edin. Kadar 1 dakika için hücreleri Trypsinize DİKKAT:. Aşırı trypsinization kaçının. Tüm hücreler, normal olarak% 80'den fazla 1 dakika sonra ayrılmış ve sağlıklı hücrelerin birkaç milyon için yeterlidir edilir.
13. 10 mi bazal glia orta ekleyerek reaksiyonu durdurun, 3 dakika boyunca 300 x g'de 15 ml'lik bir Falcon tüpüne, santrifüj için hücre süspansiyonu aktarın. Süpernatan aspire edin ve 5 ml bazal ortam içinde glia hücre pelletini.
14. Yine, spin ve gibi adım 3.15 açıklandığı aspire, sonra 5 ml bazal Glia orta hücreleri tekrar süspansiyon.
15. 1.5 ml'lik bir tüp hücreleri gerekli sayıda aktarın. 10 ^{4-2x10 4} glial hücreler bir 10 mm lamel için yeterlidir. Genellikle, süspansiyon vol4-iyi çanak az 200 ul biri için hücreleri uyum sağlamak UME. Hücrelere lentiviral TED ifade vektörü parçacıkları, uygun bir miktarda eklenir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe. Daha sonra ekim hacmi (lamel başına 100 ul) için bazal glia orta süspansiyon doldurmak.
16. Yaklaşık 2 saat boyunca inkübe edilir ve lamel başına enfekte olmuş hücreleri Tohum 100 ul ve ardından 2 ml 'lik bir son hacme kadar B27 01:50 ve 10 ng / ml EGF içeren bazal glia orta ekleyin.
17. Kaplama gün sonra 3-7 deneyler için hücreleri kullanmak ideal bir kültür koşulları için.

4. Muhabir Hücre Hattı Üretimi ve Kültür

TED raportör HeLa hücre hatları, BHK21, HEK293 ve SH-SY5Y temelinde oluşturulmuştur. Burada HeLa hücreleri için protokol sağlar, ancak protokol yanı sıra başka bir hücre hattı ile transfer edilebilir.

Stabil HeLa hücre hattı üretimi

1. Bir vahşi tip HeLa hücre hattı ve transfer 100,000 C Bölünmüş1.5 ml'lik bir tüp, 200 ul bir hacim içinde arşın.
2. Tüpe lentiviral TED ifade vektörü parçacıkları, uygun bir miktarda ilave edin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücre virüs süspansiyonu inkübe edin. Daha sonra 3 gün boyunca 30 mm'lik bir çanak ve inkübe içinde 2 ml ortam içine bir toplam hacmi (DMEM,% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin) içinde tohum hücreleri.
3. Bir kez PBS ile yıkandıktan sonra, ortam aspire ve 500 ul tripsin (TrypLE, PBS içinde 2:3) ile ekleyin. Yaklaşık inkübe edin. Daha sonra 3 dakika 3 ml ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun. 3 dakika 400 x g'de 15 ml şahin tüp ve santrifüj içine süspansiyonu aktarın.
4. 200 ul ortam içinde hücre pelletini ve 4.2 'de tarif edildiği gibi yeniden lentiviral parçacıkları ile hücreleri enfekte. Daha sonra, 10 mL ortam içinde bir T25 hücre kültürü şişesi içinde tohum hücreleri.
5. % 60-80 bir katışma ulaşılana kadar hücrelerin büyümesine. Daha sonra kültür bölünmüş.

TED raportör hücre hatları

6. TED muhabiri hücre hatları korumak olabilirherhangi bir standart ortam, örneğin DMEM,% 5 veya% 10 FCS ve% 1 penisilin / streptomisin içeren ed kullanılır.
7. Steril 10 mm lamelleri (yukarıya bakınız), örneğin lamel başına 10.000 ile 20.000 hücreleri içeren 4-iyi çanak hücre plaka uygun sayıda.
8. TED görüntüleme için kullanmadan önce en az iki gün boyunca hücreleri büyütün.

5. Bir Ters Mikroskop de Canlı Görüntüleme Prosedürü Hazırlık

1. 1. Ön ısıtılması, oda sıcaklığına kadar HEPES Ringer ve D-glikoz eklenmektedir.
   2. Prewarm ACSF ^{(Ca2 +} olmadan ve ^{Mg2 +),} oda sıcaklığına kadar, ve D-glikoz eklenmektedir. 5 dakika karbojen ile ACSF havalandırır. Daha sonra, 2 mM her son konsantrasyonlara _CaCI2 ve _MgCl2, 1 M stok çözelti ekleyin.
2. Canlı görüntüleme mikroskoplar ve tüm bilgisayar programları başlatın.
3. Bir "kukla" görüntüleme odasının üzerine perfüzyon başlatın ve tüp sistemi denge.
4. Mikroskop aşamasında satır içi çözüm ısıtıcı ve görüntüleme odası Prewarm. Bir ısıtma elemanı olarak görüntüleme odasına düzeltmek.
5. Eğer boya yükleme işlemi başlamadan ° C önce 32-37 için sistem dengelenmesi DİKKAT:. Biz mikroskop sahne korumak için amaç ve elastomerik silikon levhalar (1 mm) etrafında saç bağları kullanmak mikroskop sisteme perfüzyon çözüm yanlışlıkla akışını önlemek için.

6. Hücre Tipi Ya bir boya Yükleniyor

1. 100 ul prewarmed görüntüleme çözümü (HEPES-Ringer veya ACSF) olarak Fluo5N-AM 1 kısım (1.3) süspanse edin.
2. Çözünürleştirilir 90 saniye boyunca bir su banyosunda sonikatör görüntüleme çözeltisi (HEPES Ringer veya ACSF) içerisinde Fluo5N-AM.
3. Ya da iyi birine 24 plaka ve transfer 400 ul önceden ısıtılmış görüntüleme çözümü - yeni 4 kullanın. 5 mcM çözüm 500 ul gelmek için de aynı için boya çözeltisi ekleyin.
4. Hücreler (örneğin, bir lamel ile dikkatli bir şekilde yerleştirmekKuyudaki çapı 10-18 mm), yukarı bakacak hücreleri.
5. 37 bir hücre kültürü inkübatör zaman uygun bir süre boyunca inkübe ° C (Bu arada mikroskop aşamasında görüntüleme ayarları hazırlamak). Tipik bir boya yükleme kez 10-20 dakika nöronlar ve glial hücreler 7-15 dakika süreyle ve hücre hatları içindir.

ÖNEMLİ: Boya-yükleme süresi ve konsantrasyon boya hücre tipi, hücre yoğunluğu ve deney-özel ihtiyaçlarına bağlıdır! Boya varlığında uzun inkübasyon süreleri, hücrelere zarar özellikle birincil nöronları ve primer gliyal hücreleri ve bu fizyolojik uyaranlara yanıt için kritik olabilir. Uzun inkübasyon sürelerinde (örneğin 30 dakika) sadece küçük hücre içi yapılar, örneğin ince neurites veya dikenler içinde ER kalsiyum dağılımını araştırmak için ER kalsiyum lokalizasyonu deneyler için faydalı olacaktır. Bazı deneylerde, görüntüleme çözeltisi ile 1/3 büyüme ortamı karışımı Fluo5N-AM sırasında hücrelerin korunmasına yardımcı olabiliryükleme.

6. Anında, iyi görüntüleme çözümü içeren başka bir hücre kültürü (HEPES-Ringer veya ACSF) için lamel aktarmak ve görüntüleme odasına hücreleri montaj başlar.

7. Konfokal Mikroskop Tarama bir Ters Lazer ile ER-kalsiyum Canlı Hücre Görüntüleme

1. Bir görüntüleme odasına yüksek vakum gres uygulamak için bir fırça kullanın. Gres perfüzyon odasının alt üzerine lamel sabitleşmek için gereklidir. Böylece dakikada 15 kat tampon değişimi kadar yüksek perfüzyon hızı sağlayan, küçük bir hacmi ile 10-12 mm lamelleri için kendi kendini yetiştirmiş görüntüleme odaları kullanın. 18 mm lamelleri için bir ticari perfüzyon odası, Warner araçlar (RC-49FS) satın alınabilir. Bu bölme, ayrıca nöronların alan uyarımı sağlar.
2. Fluo5N-yüklü hücreler ile lamel almak ve görüntüleme çözeltisi ile kaplı hücreler tutmak için hücrelerin üzerine görüntüleme çözeltisi (50-100 ul), küçük bir damla ilave edin.Ters lamel çevirin ve görüntüleme odasına hücreleri monte edin. Silikon yapıştırıcı içine lamel basın, (örneğin, Q-ipuçları) bir pamuklu çubuk kullanın.
3. Pamuk tomurcukları ile cam lamel altından uzak kalan tampon silin DİKKAT:. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yüksek sayısal açıklık ile bir yağ-objektif kullanırken dikkatli uzak kalan nem silin. Artık tuz iyi su tarafından kaldırılır. Gres yanlışlıkla smear aseton veya saf etanol ile kaldırılabilir.
4. Deneysel görüntüleme odası ile değişim "kukla" görüntüleme odası. Sürekli perfüzyon ile 5-10 dakika için hücreler yıkayın.
5. 5 için hücreleri yıkayın - 10 dakika sürekli perfüzyon ile.
6. Hücre seçimi için lazer aydınlatma, yüksek tarama hızları (2-4 Hz), küçük bir görüntü boyutu ve yüksek kazanç az miktarda kullanın.
7. DİKKAT: Fluo5N-işaretli hücrelerin seçimi için epifluorescen ile ışık veya aydınlatma aşan kullanmayınt ışık. Fluo5N/Ca ² Parlak aydınlatma ⁺ kompleksleri 2-4 saniye (Şekil 5) içinde ER-özel floresan tam kaybına neden olur.
8. Planlanan deney göre mikroskop ayarlayın. Yönü, farklı TED vektörlerle görüntüleme için Örnek ayarları Tablo 1 'de verilmiştir. Ve spektral dedektör sistemi; konfokal mikroskobu ters lazer için, diyot lazer (559 nm, 20 mW 473 nm, 15 mW) ile donatılmış bir Fluoview 1.000 konfokal sistemi ile birlikte bir Olympus IX81 mikroskop kullanın.
9. Deney belgenin başında yüksek çözünürlüklü x, yz görüntü yığınlarının tarafından ilgi hücreleri.
10. Özel deneysel koşullar altında ER kalsiyum dinamikleri izlemek için x, yt görüntüleme gerçekleştirin. Sistemimiz tipik ayarları, Tablo 2'de listelenmiştir.
11. Görüntüleme çözümü ile sürekli perfüzyon altında ER kalsiyum değişiklikleri izlemek. Tipik tampon döviz kurları e vardırxemplarily: (a) SERCA bloğu tarafından hücre yıkama ve mağaza tükenmesi: 1.5 ml / dakika, (b) ATP / DHPG stimülasyon: 3 ml / dakika.
12. 12-bit (4096 gri değerleri) ile tercihen dijital görüntüler elde. Fluo5N/Ca ² paralel görüntüleme için ⁺ ve TTT, 8-bit görüntüler (256 gri değerleri) veri taşması karşı sisteminizi kurtarmak olabilir.
13. Bir ImageJ uyumlu formatı (örneğin tiff) hücre zaman serisi görüntüleri (x, yt) veya 3D görüntü yığınlarının (x, yz) (Fluo5N/Ca ^{2 +} komplekslerinin hücresel dağıtımı için) canlı saklayın.

8. Görüntü İşleme ve Veri Analizi

1. ImageJ programında görüntü yığını açın. ImageJ tarafından sorulduğunda çok renkli görüntüleme durumunda, RGB kanalları bölünmüş.
2. (Örneğin bir yoğunluk vs zamanlı arsa yardımıyla) görüntü yığınlarının dikkatli bir muayene ile ilgi (ROI) sizin bölge (ler) tespit
3. Bir yatırım getirisi ortalama piksel yoğunluğu (F _ham) okumak için Zaman Serisi Analyzer eklentisi kullanın. Dependinbilerek g, tam ER veya periferik hücre bölgelerin dendritlerin ER örneğin ER küçük bölgeler ya etrafında ROI çizin. Ayrıca arka plan çıkarma için hücreleri olmadan alanlarda 1-3 ROI içerir.
4. Arka ROI ortalama floresan değeri hesaplayarak ortalama eşiğe (F _b) hesaplayın ve F _roi değeri elde etmek için F _ham değerlerden arka plan değeri F _b çıkarın.
5. Bir dinlenme durumunda her yatırım getirisi için on 30 floresan değerlerinin ortalama değeri hesaplayarak hücrelerin bazal floresan olan F _0,, hesaplayın.
6. Formülle mesafe kadar taşınmış / F ₀ ile floresan arka plan-düzeltilmiş göreceli değişiklikler hesaplayın:

7. Mevcut göreceli değişiklikler floresanY ekseni ve X ekseni için süre mesafe kadar taşınmış / F ₀ ile bir iz olarak nce.

Sonuçlar

Bu protokol ücretsiz ER kalsiyum doğrudan görüntüleme için olmayan bir yıkıcı bir yaklaşım sağlar. Düşük afiniteli sentetik Ca ^{2 +} göstergeleri yayımlanan ve hedeflenen bir ER yardımıyla, rekombinant esteraz enzim aktivitesi ile ER lümen içinde sıkışıp kalırlar. ER lümen için Ca ^{2 +} göstergesi boyaların Geliştirilmiş yükleme ER kalsiyum deposu dinamikleri doğrudan ve hızlı görüntüleme sağlar.

TED için hücre tipleri

Yöntemin etkinliği hücre hatl...

Tartışma

TED yöntemin avantajları ve dezavantajları son yayınları ^34,35 yaygın olarak tartışılmıştır. Yukarıda tarif edilen diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında, TED hücreleri bozan ve perfüze problemini önlediği. Ayrıca, iki açıdan vurgulanması gerekir. ER kalsiyum görüntüleme için TED prensibi TED vektör yapıları yardımıyla ve düşük afiniteli bir sentetik AM-esterlerin (2). Verimli ve tercihli serbest bırakılması ile ER lümeninde aktif karboksilesteraz bölgesinin (1). Hedeflenen ifade gerektirir ER lümen kalsiy...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
(S)-3,5-DHPG (Dihidroksifenilglisin)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, ATP disodyum tuzu hidrat	Sigma	A26209-1G
B-27 takviyesi, 50x	Invitrogen	17504-044
Karbamoilkolin klorür (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Siklopiazonik asit (CPA)	Çıkış bilimsel	Asc-300
Dimetilsülfoksit (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM, Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco'nun Ca / Mg içermeyen PBS'si 1x	PAA	H15-002
Fetal buzağı serumu	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-, 10 x 50 μ g	Invitrogen	F14204
Glutamat	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Jambonun F12 besin karışımı	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS (1x) Ca'sız, Mg olmadan, Fenol Kırmızısı ile, HBSS	PAA Laboratuvarları	H15-010
At serumu	SHD3250YK	Linearis
İyonomisin Ca2+ tuz	Yükseliş bilimsel	Asc-116
murin EGF	PreproTech	315-09
N2 takviyesi 100x	Invitrogen	17502-048
Nörobazal ortam	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, düşük UV emilimi, 2g	Invitrogen	P6867
Poli-DL-ornitin hidrobromür PORNO	Sigma	P8638
Poli-D-lizin hidrobromür	Sigma	P7280
Poli-L-Lizin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Tripsin	Worthington	LS-003707
Glycine MAX (soya fasulyesi)	Sigma	T6522
MaterialsConfokal sistemden tripsin inhibitörü
: ters çevrilmiş lazer tarama mikroskobu: IX81 ile FV1000	Olympus		kullanıcıya özel konfigürasyon
Konfokal sistem: lazer birleştirici FV10 ve diyot lazerler (405, 473, 559, 635)	Olympus		Kullanıcıya özel konfigürasyon
Konfokal sistem: spektral dedektörlü FV10-SPD tarama kafası	Olympus		kullanıcıya özel konfigürasyon
Isıtıcı kontrolörü TC-344B	Warner Instruments	64-0101	hat içi çözelti ısıtıcısını kontrol etmek için
NIH ImageJ yazılımı	WS Rasband, ImageJ, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Amaç: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Amaç: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Amaç: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfüzyon odası, ters	ısmarlama
Perfüzyon odası, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfüzyon tüpü: PT-49	Perfüzyon için	Warner Instruments	64-1730
Peristaltik pompa MiniPlus 3 (4 kanal)	Gilson	n.a.perfüzyon	pompası
Tek sıralı çözelti ısıtıcısı SH-27B	Isıtıcı	kontrolörü tarafından kontrol edilen	64-0102
Emme tüpleri: ST3R	Perfüzyon için	Warner Instruments	64-1407
Isıtma eki: Tempocontrol 37-2 dijital 2 kanallı	Pecon	n.a.