Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kanal Hücreleri Toplama kültür İlköğretim Rat İç Medüller

14.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50366

⸱

21 Haziran 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Arginin-vazopressin (AVP) böbrek temel hücreleri tarafından su geri emilimini kolaylaştırmak yoluyla vücudun su dengesi ince ayar kontrol eder. Burada, AVP-aracılı su geri emilimini moleküler mekanizmaları hakkında aydınlatılması için uygun toplayıcı kanal hücrelerinin primer sıçan iç medüller yetiştiriciliği için bir protokol mevcut.

Özet

Arginin-vazopressin (AVP) böbrek kanalı temel hücre toplanması ve böylece ince ayar vücut su dengesi suyun geri emilimini kolaylaştırır. AVP, hücrelerin yüzeyi üzerinde vasopresin V2 alıcıları (V2R) ile bağlanır ve böylece, cAMP sentezini indükler. Bu su kanalı aquaporin 2 (AQP2) fosforlaştıncı değişikliklere yol açan hücresel sinyal sürecini hızlandırır. Protein kinaz A AQP2 phoshorylates ve böylece birincil idrar su geri emilimini kolaylaştırmak plazma zarı içine hücre içi veziküllerden AQP2 en translokasyon tetikler. Asıl hücrelerde hipofiz veya AVP-aktif sinyal gelen AVP serbest sapmaları sırasıyla, merkezi ya da nefrojenik diabetes insipidus neden olabilir; yüksek bir kan plazma AVP düzeyi, kronik kalp yetmezliği ve uygunsuz antidiüretik hormon salgılanması sendromu gibi kardiyovasküler hastalıklar ile ilişkilidir.

Burada, cultivati ​​için bir protokol mevcutifade V2R ve AQP2 endojen kanal (IMCD) hücreleri, toplama birincil sıçan iç medüller on. Hücreler AQP2 bölgesinin kontrolü altında yatan moleküler mekanizmaların için uygun olan ve bu nedenle AVP-aracılı su emiliminin bozulmasına ile bağlantılı hastalıkların tedavisi için yeni bir ilaç bulmak için hedefler. IMCD hücreleri sıçan böbrek iç medullae elde edilir ve altı ila sekiz gün tohumlama sonra deneyler için kullanılır. IMCD hücreleri düzenli hücre kültürü yemekleri, matara ve farklı biçimlerde mikro-titre plakalar kültür olabilir, işlem sadece birkaç saat gerektirir ve standart hücre kültürü laboratuarlar için uygundur.

Giriş

Böbreğin toplayıcı ana hücrelerde, arjinin-vasopresin (AVP) su ekleme uyararak su emilimini kontrol plazma zarı içine kanal aquaporin 2 (AQP2). AVP adenilat siklaz ve böylece cAMP oluşumunu uyarıcı G-protein çiftli vazopressin tip-2 reseptörü (V2R) bağlanır. Bu sinyal akışının başlatılması protein kinaz A (PKA) aktivasyonuna yol açar. PKA plazma zarı içine hücre içi veziküllerden yeniden dağıtımı için en önemli tetikleyici olan, 256 (S256) serin de AQP2 fosforile. Membran ekleme ozmotik degrade ve ince ayar vücut su dengesinin birlikte su geri emilimini kolaylaştırır.

Nedeniyle AVP salgı veya AVP-aktif sinyal nedenleri veya sapmaları AVP-aracılı su geri emiliminin bozulmasına, ciddi hastalıklar ile ilişkilidir. V2R veya AQP2 mutasyonlar neden azalma su geri emilimini bir elev ise, nefrojenik diabetes insipidus yol açarated kan plazma AVP düzeyi, kronik kalp yetmezliği ve uygunsuz antidiüretik hormon salgılanması (SIADH) en sendromu gibi kardiyovasküler hastalıklar aşırı su geri emilimini ile ilişkilidir.

AVP-aracılı su geri emilimini önemi sadece hastalık kendi ima kaynaklanıyor. AQP2 taşıyan için veziküller ve plazma zarı ile füzyon AVP bağlı translokasyon şu anda iyi anlaşılmış değildir kesinlikle cAMP-bağımlı exocytic süreci temsil eder. Bir cAMP bağımlı ekzositozu için diğer örnekleri, böbrek ve H renin salınımı + mide salgı vardır. Bu nedenle renal ana hücrelerde AQP2-translokasyon düzenleyen moleküler mekanizmaların açıklanması, sadece diğer hücre tipleri içindeki moleküler süreçleri anlamak yardımcı olur, ancak, aynı zamanda AVP-aracılı su emiliminin bozuklukları ile bağlantılı hastalıkların tedavisi için yeni terapilere yol açabilecektir .

Emekanizmaları kontrol AQP2 lucidating kanalı temel hücre modelleri toplama gerektirir. Bunun için farklı memeli böbrek hücre hatları bir dizi kullanılabilir. Ancak, bu modeller birkaç sakıncaya sahiptir. Birçok hücre sistemlerinde AQP2 protein düzeyi (Tablo 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) düşüktür 1-10, ektopik diğerleri aşın insan (MCD4, WT10) 11,12 veya sıçan (CD8) 13 AQP2. MCD4 ve COS-7 hücreleri içinde V2 reseptörü ifade değildir. Bildiğimiz kadarıyla orada böbrek iç medüller toplayıcı, AQP2 ifade en bol olan böbrek bir kısmının türetilmiştir kullanılabilir bir model olarak kalıcı bir hücre hattı, ancak kortikal toplayıcı 1,11,13-16 gelen . Bu tür hücre modelleri örnek, yaygın olarak kullanılan ölümsüzleştirdi mpkCCD (örneğin 17) veya yeni kurulan mTERT-CCD 14 hücre hatları içindir. Her iki hücre hatları ve endojen olarak ifade AQP2 V2R ancak türetilen yanakortikal toplama kanalı büyük olasılıkla kanal (IMCD) hücreleri toplamak iç medüller göre farklı bir proteom içerir. Bunlar örneğin farklı Na ifade etmelidir + taşıma sistemleri.

Burada, V2R ve AQP2 endojen ifade kültürü birincil IMCD hücrelere bir protokol mevcut. Bu model, bu nedenle, böbrek toplama kanalında en yakın fizyolojik durumu temsil eder. Kültür kurulması gereğine göre sadece standart laboratuar ekipmanları vb laboratuarlar kolayca bu yaklaşım kabul edebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hazırlık

  1. Kültür kaplarına hazırlanması
    1. Çözülme Kollajen Tip 4 de IV O / N ° C ve% 0.1 steril asetik asit içinde çözülür. Kullanmak için ses hücreleri numaralı seribaşı için olduğu yemekler türüne ve sayısına bağlıdır. 2 mg / cm 2 kullanın.
    2. En az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin ve yemekler için damıtılmış su (A tridest) ile iki kez yıkanır.
    3. Yemekler düzgün kurumasını bekleyin.
  2. Ortam takviyesi
    1. 500 ml orta 1.75 g glukoz ekleyerek kadar 4,5 g / L glikoz düzeyini artırmak. Orta 600 mOsmol ayarlamak için, sırasıyla, 200 ve 100 mOsmol mOsmol tarafından ozmolarite geliştirmek için, 100 mM NaCl ve 100 mM üre ekleyin.
    2. 600 mOsmol DMEM ortamı,% 1 esansiyel olmayan amino asitler,% 1 ultroser, 500 uM DBcAMP, 20 U / ml nistatin ve 0.25 ug / ml gentamisin (50 ug / ml 'lik bir konsantrasyon ile stok solüsyonu 1:200 seyreltme) ekleyin taze hazırlama gününde.
  3. Enzim çözeltisi
    1. 1 mg / ml hiyaluronidaz ile 2.2 mg / ml kollajenaz ekleyin DPBS içeren 0.25 mg / ml gentamisin ve nistatin. 2 böbrek iç medullae parçalamak için bu enzim çözeltisi, 1 ml hazırlayın. Çözelti süzme ile sterilize edilmesi gerekir ve 50 ml Falcon tüpleri içinde depolanır.

2. İlköğretim Rat İç Medüller yetiştirme Kanal (IMCD) Hücreleri Toplama

Tüm hayvan inceleme işlemleri, yerel ve federal mevzuata uygun olarak yapılacak olan.

  1. CO 2 fareler (CO 2 ile doymuş bir kutu içinde) veya izofluran (; 2-2.5% izofluran ile hava akışı 350-400 ml / dk U-400 Anestezi ünitesi, Univentor Ltd, Malta) uyuşturan. Beyazımsı iç ve koyu dış medulla arasındaki sınırın tam tespiti izin kanama için hayvan başını kesmek. Buna ek olarak, kanama izole eritrositlerin sayısını en aza indirir. Böbrekler çıkarın vebuz üzerinde gentamisin ve nystatin (yukarıya bakınız) ile desteklenmiş steril DPBS yıkayın. Bütün adımları steril temiz tezgah koşullar altında yapılacak olan.
  2. Aşırı sıvı kaldırmak için steril bir kompres üzerine DPBS çözüm böbrek aktarın. Steril forseps ve makas ile yağ böbrek kapsülü çıkarın.
  3. Böbrek hala kompres sabit dış (kortikal) tarafının uzunlamasına ekseni yanında biraz kesilmiş olması. Tamamen kesmek için, ancak renal pelvis bağlı, tek parça halinde bırakmak değil emin olun.
  4. Kavisli makas ile dikkatli bir şekilde gül parıltılı dış medulla ile çevrilidir beyazımsı iç medullae, incelemek. Buz üzerinde bir 60 mm kültür çanak gentamisin ve nistatin içeren, DPBS onları toplamak.
  5. Tüm medullae izole ve buz üzerinde toplanan sonra, sadece tampon ile kaplıdır bir seviyeye DPBS hacmini azaltmak. 5 küpler halinde medullae kesmek için steril bir jilet kullanınmm 3.
  6. Bir ateşe kısa bir süre tutarak eritin ve steril Pasteur pipet keskin ucunu yuvarlak. Pipet devam etmeden önce soğutulur emin olun.
  7. Yuvarlak Pasteur pipeti kullanılarak hiyaluronidaz ve kolajenaz (1.3.1) taze olarak hazırlanmış steril bir enzim çözeltisi içeren 50 ml Falcon tüplerine doku süspansiyonu aktarın. Sıkıca kapağını kapatın ve 37 ° C 1.5 için düzenli bir masa su banyosunda sürekli ajitasyon (220 rpm) altında inkübe - 2 saat.
  8. Süspansiyon ezilerek için, homojen bir süspansiyon bulanık hale gelene kadar yuvarlak Pasteur pipeti (yukarıya bakın) ile bir kaç kez aşağı karışımı pipet ve.
  9. 300 xg'de 5 dakika ve 16 ° C için süspansiyon santrifüj Süpernatantı atın, pelet tekrar gentamisin ve nystatin ve santrifüj içeren, DPBS iyice tekrar süspansiyon. Bir kez bu yıkama adımı yineleyin.
  10. Tam takviye orta ve c içine tohum onları hücrelerin tekrar süspansiyonulture yemekler ve / veya mikro-titre iyi plakaları. 2 medullae (1 hayvan) hazırlanması biri 60 mm kültür çanak için yeterli hücreleri verecektir.
  11. 24 saat sonra, 600 mOsmol DMEM ile iki kez yıkama ve hücreler taze ortam ilave edin. Bir sonraki haftada 2-3 kez hücreleri (Şekil 1) yıkanmalıdır. 6-8 gün sonra tohumlama, IMCD hücre deneyleri için de kullanılabilir. Deney başlamadan önce 24 saat DBcAMP ve nystatin olmadan ortamda bunları tasarlamak unutmayın. Aksi takdirde AQP2 plazma zarında sadece yer alacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Primer fare IMCD hücreleri başarılı ekimi 6-8 gün tohumlama sonra konfluent tek tabaka (Şekil 2) ile sonuçlanır. 60 mm kültür çanak başına yaklaşık 6 x 10 6 hücre vardır. Bu tip IV kolajen, bir bazal membran bileşeni 18 ile kaplanmış olduğu gibi sıkı bir şekilde hücreler, kültür tabaklarına uygun. Bu nedenle, IMCD hücreleri birkaç ayrıntılı yıkama işlemleri sırasında bile terketmez. Yukarı, kültürlenmiş hücreler,% 80, endojen V2R ve AQP2 ifade eder. AQP2 yoksun hücreler interkalate...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz primer sıçan IMCD hücrelerinin hazırlanması ve kültür için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu yaklaşım bir sıçan 20 hücreleri 21 cm 2 kadar verir. Deney, standart hücre kültürü ekipman gerektirir ve yaklaşık 6 saat içinde, tek bir kişi tarafından yapılabilir. Dolayısıyla, bu yaklaşım, bir standart laboratuar yöntemi olarak uygundur.

Primer fare IMCD hücreleri, 96 oyuklu plakalar, 60 mm yemekler arasında, farklı büyüklükte kültür tabaklarında tohumlanmış edilebilir. B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (; KL 1415/3-2 ve KL 1415/4-2 DFG) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kollajen Tip IV FareBD Biosciences356233
HyaluronidazSIGMAH6254
Kollajenaz tipi CLS-IIBiochrom AGC2-22
DMEM + GlutMAXInvitrogen GIBCO21885108
NystatinSIGMAN4014
Ultroser GSitojen15950-017
Esansiyel olmayan amino asitler (NEA)Biochrom AGK0293
GentamisinInvitrogen GIBCO15710
DBcAMPBIOLOGD009

Kaynaklar

  1. Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
  2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
  3. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
  4. Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
  5. Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
  6. Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
  7. Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
  8. Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
  9. Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
  10. Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
  11. Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
  12. Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
  13. Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
  14. Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
  15. Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
  16. Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
  17. Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
  18. Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
  19. Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
  20. Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
  21. Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
  22. Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
  23. Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
  24. Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
  25. Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
  26. Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
  27. Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
  28. Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
  29. Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
  30. Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

Etiketler

Primer Sıçan IMCD Hücreleriİç Medulla İzolasyonuEnzimatik Doku SindirimiHücre Kültürü ProtokolüArjinin Vazopressin Sinyal iletimiAquaporin-2 TranslokasyonuV2 Reseptör EkspresyonuKollajen KaplamaWestern Blot Analiziİmmünofloresan Mikroskopi
Kanal Hücreleri Toplama kültür İlköğretim Rat İç Medüller
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.