Method Article

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

DOI:

10.3791/50369

⸱

July 3rd, 2013

 , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA girişim (RNAi) kullanılarak gen fonksiyonu Genom çaplı sorgulama kimyasal uysal kanser hücresi güvenlik açıklarının hızlı bir şekilde tespit için büyük umut vaat ediyor. Bu teknolojinin potansiyel sınırlandırılması hızla fenotipik sonuçlarının mekanik olarak tasvir ve böylece moleküler olarak hedeflenmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesi bilgilendirmek için yetersizliğidir. Biz anahtar kanser hücresi ile ilişkili süreçlerin izlenmesi izin multipleks muhabiri sistemlerini kullanarak hedef RNAi-aracılı gen tarafından uyarılan hücre fenotipleri yapısızlaştırmak burada yöntemleri özetlemektedir. Bu yüksek içerik tarama metodolojisi yönlüdür ve kolaylıkla büyük molekül kütüphaneleri diğer türlerine taranması için adapte edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre biyolojik süreçlerin çeşitli bir dizi izlenmesi için lusiferaz tabanlı muhabir çeşitli ticari olarak temin edilebilir. Bu DNA çoğunluğu belirli bir hücre ya da uyarana tedirginlikler ile ifade etmek uyarılan lusiferaz proteinleri kodlayan oluşturur. En güçlü transkripsiyonel tabanlı muhabir sentetik güçlendirici elemanlar veya gen promotör bölgeleri, fizyolojik olarak uygun transkripsiyonel etkinliği 1,2 raporlama, güvenilirlikleri iyi kurulmuş bölgesinin kontrolü altında bir lusiferaz enzimi ifade yerleştirin. Lusiferaz protein ekspresyonunu yürütmek için GAL4 UAS kullanmaktadır trans-lusiferaz raportör sistemler de vardır. Gal4, bir maya transkripsiyon aktivatörü ve UAS Gal4 özel olarak 3 aşağı akım yerleştirilmiş gen dizilerinin transkripsiyonunu aktif hale getirmek için bağlandığı bir arttırıcı. Lusiferaz Bu tip sistemler genellikle iki DNA plazmid tarafından desteklenen - bir regulato kaynaşık GAL4 proteini kodlayanRY ilgi bir proteinin bir kısmı ve ikinci bir veya daha fazla UAS sekanslarının kontrolü altında bir lusiferaz proteinini kodlar. Bu nedenle, hücresel sinyal lusiferaz ilgilenilen proteinin aktivite düzeyini yansıtır. Lusiferaz bazlı muhabir diğer bir yaygın kullanımı ilgi bir protein, bir lusiferaz enzim 4 kaynaşmış sayede protein stabilitesi izlenmesi içindir. Bir de sorguya olduğu herhangi bir muhabiri özgüllüğünü kabul edemeyiz gibi ne olursa olsun muhabiri türü, bir sorumluluğun alıcıya ait olması burada olduğunu kaydetti. Böylece, durum tespiti herhangi bir araştırma stratejisinde yeni muhabiri yapıları dahil edilmesi gereklidir.

Lusiferaz enzim salt üzerinden seçimi ifadesini kontrol eden DNA elemanlarının güvenilirliği kadar önemli olabilir. Ateşböceği lusiferaz (FL), ticari olarak mevcut yapıları en yaygın olarak kullanılan bir enzim olan ise, (durumunda olduğu gibi ATP gerektirmeyen yeni bir lusiferaz haberci sistemleri gelişineFL-tabanlı reaksiyonlar) ya da bu araştırma platformu verimini ve güvenilirliğini artırmak için söz veriyorum güçlü sinyaller yayarlar daha istikrarlı enzimler dahil. Kimyasal çalışmalarda lusiferaz gazetecilere seçimi ile ilgili önemli bir not sahte raporlar neden olabilir kimyasal inhibisyonu FL duyarlılık olduğunu. Deneyimlerimiz, bir substrat olarak coelenterazine kullanmak gibi Renilla veya Gaussia lusiferaz (sırasıyla RL ve GL,) gibi diğer enzimler daha az kolay küçük moleküller 5 ile inhibe bulunmaktadır.

Çoklama lusiferaz okumaları için en yaygın biçimi büyük ölçüde sırayla tek bir örnekten enzimatik faaliyetleri ölçmek için yeteneği ile kolay kullanımlı kitleri durumu verilen FL ve RL kullanımını gerektirir. En kitleri, numuneler ilk olarak eş zamanlı bir Secon vermek üzere koelenterazin tevdi bir söndürme reaktif takip FL aktivite düzeyleri ortaya çıkarmak için luciferase maruzdary RL sinyal. Bu GL veya kullanımı gibi Cypridina lusiferaz (CL), luciferases kullanarak yüksek miktarda veri ortaya çıkmıştır oluşturmak için olanaklar daha fazla sayıda başka substrat olarak salgılanan edilebilir diğer luciferases ilavesi ile. Bu tekniği kullanarak bir genom RNAi ekran bir örneği burada 6 bulunabilir. Bu teknolojik gelişmeler sırayla var çapraz konuşma 7 sınırlamak amacıyla lusiferaz enzim her tür gidermek için özel mekanizmaların geliştirilmesi teşvik. Bizim ellerde, bu tür GL veya CL olarak salgılanan luciferases ile, "kenar efektleri" (yüksek titre kültür plakaları kenarı ile ilişkili hücresel aktivite açıklanamaz eğilimler) bir daha sık not. Bu hücre canlılığı adulterating olmadan sinyali örnekleme izin gibi diğer yandan, salgılanan lusiferazlarm Kinetik tahliller için yararlıdır.

Burada sunulan Çalışmamızda için, aynı anda üç kansere ilgili faaliyet izleyecekhücresel süreçleri: p53, Kras ve Wnt sinyal ileti yolları. ,; Çalışmamızda dahil gazetecilere Clontech gelen pp53-TA-Luc FL muhabiri (bundan böyle p53-FL muhabiri olarak anılacaktır) 8, bir Elk1-GAL4/UAS-CL muhabiri sistemi (Agilent bundan böyle Elk-1 muhabiri) olan ve T-hücresi faktörler (veya TCFS) 9-11 olarak bilinen Wnt yolu transkripsiyonel düzenleyiciler tarafından tanınan birden fazla sentetik arttırıcı unsurları içermektedir 8X TCF RL muhabiri.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm protokol yaklaşık 4 gün sürer.

1. SiRNA ve bildirici Transfeksiyon için hücrelerin hazırlanması

Biz burada amaçlıdır bir genom siRNA kütüphaneden siRNA'lar küçük bir set (tek bir gen hedef 4x siRNA'lar oluşan her havuzlu 96 formatında 384 farklı siRNA havuzları dizi) kullanarak siRNA kütüphaneler sorguya için bir protokol tanıtacak. Bu özel çalışma için, biz HCT116 sapkın Wnt ve Kras sinyal sergi hücreleri ve p53 aktivite istismar olacaktır. Ilgi diğer hücresel süreçleri sorguya yönelik çalışmalarda uygun hücre hattı tespit ve benzer bir şekilde değerlendirilmesi gerekecektir.

  1. % 2 Fe içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) 10 ml 'si ile nötrleştirme ile takip tripsinizasyon çözelti / plaka 1 ml kullanılarak tripsinizasyon ile PBS daha sonra hasat hücreleri ile% 80-90 ortak akışlı HCT116 hücreleri 5 x 10 cm'lik 2 plaka yıkayıntal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin / levha.
  2. , DMEM /% 2 FBS /% 1 penisilin / streptomisin, 10 ml, 50 ml konik tüp süspansiye edilmiş hücreler aktarın ve 5 dakika boyunca ~ 130 x g centrifugate, süpernatantı ve yeniden askıya hücre pelletini.
  3. Bir hücre sayacı ile hücre sayısını saymak ve daha sonra 10 5 hücre / ml olan bir hücre çözeltisi hazırlanır, bir sonraki aşama için 150 ml hücre süspansiyonu tutun. Multidrop otomatik bir sıvı dağıtıcı (bundan sonra Multidrop) kullanılarak, 96 gözlü hücre kültür plakasının her bir plaka 10 4 hücreleri (100 ul). Hücre süspansiyonu kaplama 12 x 96 gözlü levhalar için bu durumda yeterli olmalıdır.
  4. % 5 CO 2 ile 37 ° bir kuluçka C hücreleri ile inkübe transfeksiyon karışımı hazırlarken.

2. Muhabir Construct Stok Çözüm hazırlanması

  1. Izole yüksek kaliteli muhabiri standart midiprep kitleri (nükleo Xtra Midi üretilen tarafından kullanılarak DNA inşaVe Clontech) her bir muhabir için 1 mg / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar DNA seyreltin.
  2. Muhabir p53-FL 30 ul, 8X TCF-RL, Elk1-Gal4 30 ul, 6 ul UAS-CL ve bir DNA karışımı elde etmek için H 2 O 4 ul 30 ul birleştirerek stok solüsyonu inşa 100 ul hazırlayın gazetecilere son bir 1:1:1:0.2 oranı. Bu DNA karışımı stok solüsyonu nihai DNA konsantrasyonu, 0.3 mg / ml 'dir.

3. SiRNA / DNA Transfeksiyon Mix hazırlanması

Protokolün bu bölümünde, 12 x 96 plakaları transfecting için yeterli olacaktır siRNA / DNA transfeksiyon karışımları hazırlayacaktır. SiRNA'lar 4 x 96 plaka Bu test kütüphane için, üç kopya halinde her siRNA havuz transfect olacaktır. Biz kullanacağız transfeksiyon reaktif Effectene (Qiagen) denir. Elimizdeki bu kültür hücreleri içine siRNA ve DNA'nın eş zamanlı teslimat için çalışan tek reaktiftir.

  1. Muhabir yapı stok sol 80 ul sulandırmak3 mg / ml 'lik nihai bir konsantrasyon ile bir DNA eriyiği elde etmek için EM tamponu (Effectene Kiti) 8 ml ution. Genel olarak, hemen kullanım için yeterli sayıda DNA çözeltisi karışımı hazırlamak.
  2. , 96 gözlü / levha, her sıra için bu DNA solüsyonu levha 20 ul. , 96 gözlü levhalar sayısı siRNA havuzları test edilecek kaç bağlıdır. Örneğin, bu durumda, 384 farklı havuzları siRNA değerlendirilmesi için 4 x 96 gözlü levhalar gerekir.
  3. Test edilecek siRNA'lar 5 uM'lik bir stok konsantrasyonu olmalıdır. Değilse, çoğaltma kaplama ve her kütüphane ile ilgili tavsiye edilen seyreltme tamponu kullanarak bu konsantrasyona seyreltilmiş olabilir.
  4. De, bir Biomek Automated sıvı işleyici ile seyreltilmiş DNA stoku içeren PCR plakasının karşılık gelen her biri 5 uM siRNA stoklar 2 ul aktarın. Çalışmanın ölçeğine bağlı olarak, bir çok kanallı pipet yeterli olabilir.
  5. Şimdi, DNA / siRNA pla her bir kuyunun Artırıcı çözüm (Effectene kiti) 1 ul katacakte. Bu da otomatik bir sıvı işleyici veya çok kanallı pipet ile de gerçekleştirilebilir.
  6. Daha sonra her bir kuyucuğa Effectene transfeksiyon reaktifi 3 ul ekleyin ve ek bir 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir, güçlendirici reaksiyon, 5 dakika boyunca oda ısısında oluşmasına izin verir.
  7. Transfeksiyon kompleksi oluşumu durdurmak için, PCR plakasının her bir oyuğa 10 ul DMEM /% 2 FBS /% 1 penisilin / streptomisin ekleyin.
  8. Hücreleri (hücre inkübatöründe alınan) içeren 96 çukurlu bir levhanın her kuyuya transfeksiyon karışımı 10 ul aktarın. Her bir transfeksiyon, üç kez gerçekleştirildi edileceği gibi, aynı karışım hücrelerini içeren iki ek 96 kuyucuğu uygulanacaktır.
  9. 36 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir ortamda 37 ° C 'de ilave transfeksiyon karışımları ile hücrelerin inkübe edin.

4. Hücre Örneklerden Lusiferaz Etkinlikler belirleyin

36 saat sonra lusiferaz aktiviteleri ölçümü için hazırTransfekte edilmiş hücreler. Son nokta bir başına deney temelinde belirlenmelidir. Çalışmamızda, bir 36 saat inkübasyon süresi daha önce sonuç belirlenmesi anlam için yeterince güçlü bir sinyal ile uyumlu bulundu. Bu çalışmada, farklı muhabir (hücre sitoplazmasında ifade kültür ortamı ve diğer iki salgılandığı bir tane) içermektedir olarak, her iki kültür ortamı, hem de bir hücre lizatından ölçümleri elde edecektir.

  1. Kültür ortamı içinde CL aktivitesinin Tespiti:
    1. Kültür ortamı 20 ul kopya-kaplama beyaz opak 96 plaka (ya Biomek Sıvı Handler veya kanallı pipet kullanarak).
    2. Her kuyuya KU analiz tamponu içinde 20 ul (Sistem Hedefleme) ekleyin.
    3. Her bir kuyunun Cypridina luciferase substrat (Sistem Hedefleme) 10 ul ekleyin ve bir luminometre (örneğin BMG tarafından üretilen Pherastar plaka okuyucu) ile CL faaliyet algılar.
  2. FL ve RL faaliyet Algılama:
    1. C Lyseilk kültür ortamı kaldırarak arşın. Bu ters plaka dönüm ve bir lavabo orta savurma tarafından hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Kalan orta yavaşça kağıt havlu üzerine ters plaka dokunarak kaldırılabilir. Bir platform rocker Multidrop ve yer kullanarak hücrelerin her bir kuyunun 1X Pasif Lizis Tampon (Promega) 30 ul ekleyin oda sıcaklığında 5 dakika boyunca orta hızını ayarlamak (Bellco bu yapan bir şirket).
    2. Luminometre kullanılarak Multidrop ve hemen ölçmek FL aktivitesi, lusiferaz Reaktif II (Promega Çift Lusiferaz takımı parçası) 20 ul ekle. Daha sonra, eklemek ve Durdur FL faaliyet gidermek ve RL aktivite ölçümü sağlayacak Glo Reaktif (Promega). Not: Eğer uzun sinyal süresi (örneğin Promega'dan Çift-Glo Lusiferaz Setleri gibi) izin substrat karışımları kullanmadığınız sürece, flaş kitleri kullanımı substrat Ayrıca üzerine hızlı bir şekilde ölçülmesi (5 dakika içinde) gerektirir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyük genom dizileme çalışmaları 12-14 kullanarak çeşitli kanser mutasyon peyzaj haritalama ilerlemelere rağmen, biz hala yerinde müdahale stratejileri içine bu gözlemler çevirmek için sistematik bir yaklaşım yok. / Wnt β-katenin, p53 ve Kras sinyalizasyon - - kolorektal kanser (CRC), üç hücresel süreçlerin bileşenleri etkilemesi tahmin edilmektedir mutasyonlar onlar bağırsak hücresel dönüşümün önemli bir faktör düşündüren tüm tümörlerin% 99 bulunur 13. Bu nedenle, kanser genom veri setleri olasılı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilk kez bir yüksek verimli ekran eğlenceli olanlar için yararlıdır on-line kaynak sağlamak lusiferaz tabanlı muhabiri sistemlerinin birkaç edicisidirler (örneğin Promega gibi, Hedefleme Sistemleri, New England Biolabs ve Thermo Fisher) vardır. Buna ek olarak, gen bulunması ve nasıl RNAi tabanlı tarama sonuçları diğer-omics tabanlı veri setleri ile entegre edilebilir için yüksek verimli ekranların kullanımını optimize ile ilgili mükemmel değerlendirmeleri bir dizi yararlı 15,16 olmalıdır. Yüksek verimli ekranl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tamam ve LL lusiferaz teknoloji çoğaltılmış ile ilgili bir patent üzerinde yazarlar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz CPRIT (RP100119) ve Welch Vakfı (I-1665) fon desteği kabul.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Raporlama SistemiAgilent Technologies Inc.
Yol Profil Oluşturma Luciferaz Sistemi 4 pp53-TA-Luc VektörClontech Lab Inc.
Effectene Transfeksiyon ReaktifiQiagen Inc.
Çift Lusiferaz Raportör Test SistemiPromega Corp.E1960
Cypridina Luciferase Test reaktifiHedefleme SistemleriVLAR-1
HCT116 hücreleriATCCCCL-247
CytoTox-Fluo Sitotoksisite TestiPromega Corp.G9260
EQUIPMENTMultiFlo
Mikroplaka DispenseriLabsystems Inc.Model 832
Biomek FXP Laboratuvar Otomasyon İş İstasyonuBeckman Coulter Inc.A31842
PHERAstar FS-çok modlu HTS mikroplaka okuyucuBMG Labtech Inc.0471-101A
Parlak Çizgi Reichert HematitometrelerHausser Scientific Company1490
219005631914301427

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
  2. Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).
  3. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).
  4. Smirnova, N. A., et al. Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators. Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).
  5. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).
  6. Tang, W., et al. A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).
  7. Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. , (2012).
  8. Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).
  9. DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway. Science. 308, 826-833 (2005).
  10. Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
  11. Korinek, V., et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).
  12. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, 330-337 (2012).
  13. Koboldt, D. C., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. , (2012).
  14. Wood, L. D., et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
  15. Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens. Science Signaling. 2, pt4(2009).
  16. Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide. Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).
  17. Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. Analysis of cell-based RNAi screens. Genome Biology. 7, R66(2006).
  18. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS ONE. 6, e28338(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Luciferase ScreeningCancer Signal TransductionRNA Interference Gene TargetingReporter Gene AssaysFirefly Luciferase AssaySecreted Luciferase MeasurementCell Lysate PreparationTransient Transfection ProtocolHCT116 Colorectal Cancer CellsPathway Activity Monitoring

Related Articles