Yöntem makalesi

Yüksek Tuz Diyet ve Lewis Rat Kronik Böbrek Hastalığı tetikleyebilecek Nitrik Oksit Sentaz inhibisyonu ile bağlantılı 5/6th nefrektomi

23.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50398

⸱

3 Temmuz 2013

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology & Hypertension, University Medical Center Utrecht

Bu makalede

Özet

Cerrahi renal kitle 5/6th kaldırarak Lewis sıçan kronik böbrek hastalığı (KBH) kurmak için bir iki aşamalı yöntemi açıklanmıştır. Cerrahi işlem kombinasyonu, NOS-inhibisyonu ve yüksek tuz diyeti nedensel mekanizmaları ve yeni tedavi yaklaşımları gelişimi çalışma izin, insan CKD benzeyen bir model yol açar.

Özet

Kronik böbrek hastalığı (KBH) küresel bir sorundur. CKD ilerleme Yavaşlama önemli bir sağlık önceliktir. CKD dengesinin karmaşık bozukluklar ile karakterize olduğundan, bütünleştirici hayvan modellerinde CKD gelişimi ve ilerlemesi çalışma için gereklidir. CKD CKD ve yeni terapötik girişimlerin gelişimini incelemek için, insan CKD çeşitli yönleri benzeyen, 5/6th nefrektomi ablasyon modeli, ilerleyen böbrek hastalığının bilinen bir deneysel model kullanın. Renal kitle brüt azalma ilerici glomerüler ve tübülo-interstisyel yaralanma, kalan nefron kaybı ve sistemik ve glomerüler hipertansiyon gelişimine neden olur. Ayrıca, ilerleyen böbrek içi kılcal kaybı, enflamasyon ve glomerüloskleroz ile ilişkilidir. Için risk faktörleri her zaman endotel fonksiyonu üzerindeki etkisi CKD. Bu taklit için, nitrik oksit (NO) azalması ve yüksek tuz diyeti ile renal kitle 5/6th çıkarılması birleştirir. Varış ve iklimlendirme sonra, hayvanlar yenidenSağ taraflı uninephrectomy takiben 4 haftalık bir süre için içme suyu (20 mg / L) ile desteklenmiş bir NO sintaz inhibitörü (NG-nitro-L-arginin) (L-NNA), alma işlemine. Bir hafta sonra, bir alt toplam nefrektomi (SNX) sol tarafta gerçekleştirilir. SNX sonra, hayvanlar, 4 haftalık bir süre için daha içme suyu (20 mg / L) LNNA takiben iki gün süre ile iyileşmeye bırakıldı edilir. Zemin chow (zaman çizgisi bkz. Şekil 1) de ilave bir yüksek tuz diyeti (% 6), deney boyunca devam edilir. Böbrek yetmezliğinin ilerlemesi plazma üre, sistolik kan basıncı ve proteinüri ölçerek zaman içinde takip eder. SNX sonra altı hafta, böbrek yetmezliği geliştirdi. Böbrek fonksiyonu 'altın standart' inulin ve para-amino hippurik asit (PAH) temizlik teknolojisi kullanılarak ölçülür. CKD Bu model bir glomerüler filtrasyon hızı (GFH) azalma ve etkin renal plazma akışı (ERPF), hipertansiyon (sistolik kan basıncı> 150 mmHg), proteinüri (> 50 mg/24 saat ile karakterizedir) Ve hafif üremi (> 10 mM). Histolojik özellikleri inflamasyon, tübüler atrofi ve fibrozis ve kalan nüfus (<% 10) içinde sağlıklı glomerül büyük azalmaya yol açan fokal glomerüloskleroz yansıyan tübülo-interstisyel zarar içerir. Takip SNX CKD daha fazla ilerleme gösteren 12 hafta sonrasına kadar.

Giriş

Ilerici doğa, takip eden son dönem böbrek hastalığı ve ilişkili kardiyovasküler morbidite ve mortalite nedeniyle, CKD giderek büyüyen bir halk sağlığı sorunu 1'dir. CKD ilerleme Yavaşlama bu nedenle önemli bir sağlık önceliktir. CKD dengesinin karmaşık bozukluklar ile karakterize olduğundan, bütünleştirici hayvan modellerinde CKD gelişimi ve ilerlemesi çalışma için gereklidir. Böbrek birbirleri ile etkileşim farklı hücre tipleri arasında, geniş bir aralık oluşur. Bu karmaşıklık in vitro taklit edilemez.

CKD yeni tedavi girişimleri incelemek, insan CKD 2,3 çeşitli yönleri benzeyen 5/6th nefrektomi ablasyon modeli, ilerleyen böbrek hastalığının iyi bilinen bir deneysel model, kullanın. Renal kitle brüt azalma ilerici glomerüler ve tübülo-interstisyel yaralanma, kalan nefron kaybı ve sistemik ve glomerüler hipertansiyon gelişimine neden olur. Bu Progr ile ilişkiliessive böbrek içi kılcal kaybı 4, inflamasyon ve glomeruloskleroz. Için risk faktörleri her zaman endotel fonksiyonu 5 üzerindeki etkisi CKD. Biz CKD gelişimi nispeten dirençli olan bir fare suşu (Lewis) kullanılan ve bu nedenle nitrik oksit (NO) azalması 6, 7, 8 ve yüksek tuz diyeti 9, renal kitle 5/6th çıkarılması birleştirilir. Varış ve iklimlendirme sonra, hayvanlar iki gün sonra L-NNA devamı ile sağ taraflı uninephrectomy (UNX) takip 4 haftalık bir süre için içme suyu (20 mg / L) için ilave bir NO sentaz inhibitörü (L-NNA), almak . Bir hafta sonra, renal kitle 2/3rds subtotal nefrektomi (SNX) yani kaldırma sol tarafında yapılır. SNX sonra, hayvanlar, 4 haftalık bir süre için içme suyu içinde 20 mg / L, LNNA yine ardından 2 gün süre ile iyileşmeye bırakıldı edilir. Zemin chow (zaman çizgisi bkz. Şekil 1) de ilave bir yüksek tuz diyeti (% 6), deney boyunca devam edilir. TO yandaki UNX gerçekleştirmek için bir neden ve sol taraftaki SNX böbrek damarlarının daha kolay böbrek vücut dışında maruz bırakıldığında çok damarları germeden böbrek erişimi kolaylaştırır sol taraftaki uzun olmasıdır . Literatürde, model bir hafta sonra 10,11,12 sağ böbrek UNX ardından, sol böbrek kutup önce kaldırılır olduğu tarif edilmektedir. Bizim ellerde bu model böbrek yetmezliği çok daha hızlı bir gelişme gösterdi, ama aynı zamanda böbrek fonksiyon kaybı çok daha büyük bir değişim. Böbrek yetmezliğinin ilerlemesi plazma üre, sistolik kan basıncı ve proteinüri ölçerek zaman içinde takip eder. SNX sonra altı hafta, böbrek yetmezliği, geliştirmiştir glomerüler filtrasyon hızında belirgin bir azalma (% 69) ve etkin renal plazma akışı (% 62) 13 hipertansiyon (sistolik kan basıncı> 150 mmHg), proteinüri (ile karakterize> 50 mg/24 saat) ve hafif üremi (> 10 mM). Histolojik özellikleri tubul içeriro-interstisyel zarar inflamasyon, tübüler atrofi ve fibrozis ve kalan nüfus (<% 10) içinde sağlıklı glomerül büyük azalmaya yol açan fokal glomerüloskleroz yansıyan. Takip 12 hafta sonrasına kadar SNX terapötik girişimlerin değerlendirilmesi için bir fırsat penceresi sağlayan, CKD daha fazla ilerleme gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler Utrecht deneysel hayvan komitenin hayvan deneysel etik kılavuz çizgileri uygun olarak yürütülür. Protokol yazarın kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi rehberlik ve onay altında yapılır.

CKD 8 hafta yaşında erkek doğuştan Lewis sıçan (Charles River, Sulzfeld, Almanya) indüklenir. Sıçanlar bir ışık, sıcaklık ve nem kontrollü bir ortamda, standart koşullar altında muhafaza edilmektedir.

1. Cerrahi Hazırlık

  1. Cerrahi aletler sterilize:
    • 1 öğrenci doku 1-2 diş 12 cm forseps
    • 1 öğrenci standart desen forseps
    • 2 Semken forseps
    • 1 Mayo makas
    • 1 öğrenci iris makası
    • Makasla 1 Olsen-Hegar iğne tutucu
    • Battaniye
  2. Envanter listesini kontrol edin:
    • Isınma pad ve lamba ile masa Çalışma
    • O 2, izofluran
    • Dokular
    • Tıraş makinesi
    • Terazi
    • Steril çalışma seti
    • Steril gazlı bez 5x5 ve 10x10
    • % 70 alkol
    • % 0.9 'luk NaCl çözeltisi
    • 1 ml şırınga
    • Iğneler (25G)
    • Jel köpük pedler: spongostan
    • Vicryl 4.0 ve 5.0
    • Buprenorfin, 0.03 mg / kg (1:10 fizyolojik tuz içinde seyreltilmiş)
    • Ameliyat sonrası sıçanlar için temiz bir kafes

2. Sağ Taraf Uninephrectomy

  1. % 70 alkol ile masaya dezenfekte edin.
  2. Yeri indüksiyon kutusunda fare ve% 4 izofluran ve O 2 1 litre akışı ile anestezi neden. Not: Kullanılan sıçan suşu bağlı olarak, ön ve perioperatif analjezi reçete edilir, yerel veteriner hekim ile görüşülmelidir bu ihtiyacı.
  3. Koni içine masa ve yer burun sıçan aktarın. Sıçan ve burun konisi sıçan vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerine yerleştirilir. Sıçan is O 2 izofluran ve 1 litre% 2 karışımı ile havalandırılan.
  4. Sıçan kanadını Tıraş ve alkol ile dezenfekte edin. Yıkayın ve dezenfekte el ve steril cerrahi eldiven giyin. Kafa kapağı ve bir maske. 1 olun - 1.5 cm kesi paralel anatomik forseps ve künt makas kullanılarak kaburga. Arka kasların künt diseksiyon ile böbrek Açığa.
  5. Böbreğin alt kutbu görünür, dikkatle perirenal yağ dokusu kavrama küçük künt forseps kullanabilir. Hafifçe forseps ile perirenal yağ çekerek böbrek dışa. Bu işlem sırasında böbreküstü bezi rahatsız dikkat edin. Böbrek üstü bezi kolayca yağ dokusunda medial sitesinde bir forseps koyarak çıkarıldı ve hafifçe böbreküstü bezi ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, böbrek arasında yukarı doğru hareket ettirilebilir.
  6. Gazlı bez ve yağ ve bağ dokusu çevreleyen açık hafifçe böbrek yerleştirin. Renal arter ve ven belirlenmesi ve bir bağ (5.0 yervikril) gemilerin etrafında tek bir düğüm ile, ancak düğüm kapalı kravat yok.
  7. Böbrek ve düğüm arasında boşluk oluşturmak için, yaklaşık 0.5 cm aorta doğru damarları boyunca dikkatle gevşek düğüm taşıyın. Bu kesim sonra kaymasını bağ önlemek için yapılır.
  8. Iki çift düğüm ile düğüm. Perfüzyon durduruldu ise böbreğin renk hemen kahverengiye kadar değişecektir. Bağ ucunda kesmeyin.
  9. Böbrek yakın böbrek damarları kesin ve böbrek çıkarın. Yavaşça böbrek damarlarının kanama kontrol etmek için dikilen uzun ucunda çekin. Bağ gemide yerde kalmak gerekir. Bağ uzun biter kesin. Not, kalan böbrek damarlarının hemen karın boşluğuna geri çekilecektir.
  10. Leke eksize böbrek kuru ve tartın.
  11. Vicryl 5.0 ile sütürlerinin ile iskelet kası kesi kapatın. Arka bacak, 0.10 mL (0.03 mg / kg) enjekte buprenorfin im. Yakınintrakutanöz dikişler ile Vicryl 4.0 ile cilt. Bu yara açmasını sıçan engeller. Not: Lewis sıçanlarda solunum depresyonu nedeniyle, sadece sadece izofluran kapatmadan önce post-operatif analjezi verir.
  12. Yiyecek ve su kolay erişim ile temiz bir tek kafeste sıçan ev. Isınma pad O / N kafes yarım yerleştirin ve dikkatli bir şekilde sıçan ertesi gün kontrol edin. Yara kapatıldı ve sıçan ameliyat sonrası 6 ile 12 saat arasında normal olan, aktif olduğunda, sıçan grubu gövde içine tekrar yerleştirilebilir.

3. Sol Taraf Ara toplam nefrektomi

  1. Yedi gün sonra, aynı preparatlar olarak da 2.1 'den 2.5' e tarif sağ tarafı için de sol tarafta yapılır. Ameliyattan önce, sağ böbrek ağırlığının yaklaşık 2/3rds karşılık kaldırılması gerekiyor böbrek doku miktarı hesaplanır. Ameliyat öncesi jel köpük küçük parçalar (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey) hazırlayın.
  2. Sol böbrek üst kutup etrafında keskin bir makas yerleştirin ve bir inme (makas konumu için, bkz. Şekil 3) en üst kutup rezeke. Jel köpük bir parça ile hemen kapak ve steril gazlı bez ile hafif baskı.
  3. 3.3 'de olduğu gibi böbrek alt kutup ile tekrarlayın.
  4. Cilt üzerinde pıhtılaşma önlemek için böbrek kaldırın. Kanama durana kadar steril gazlı bez ile jel köpük pedler hem de hafif basınç koruyun. Kanama devam zaman, başka bir köpük yastık ekleyin.
  5. Karın içinde yapışık jel köpük pedler ile kalan böbrek yerleştirin. Kas ve deri kapatın ve 2,9-2,12 izleyin.

4. Sham Cerrahi

  1. Sham çalışan kontrolleri böbrekler ortaya koymak için aynı prosedürü tabi. Bunun yerine böbrek kökünü kazıma ya da bir hafta sonra direkleri kesme, böbrekler her iki böbreküstü bezleri rahatsız etmemek için özen, bir hafta arayla decapsulated vardır. Yara kapatılması ve ameliyat sonrası bakım kimliği olan2.11 ve 2.12 için entical.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Subtotal nefrektomi sonra, toplam böbrek kütlesinin yaklaşık 1/6th bırakılır. Şekil 4 önceki iki deneylerde ortalama ve standart sapma ile doğru böbrek Çıkarılan parçanın ağırlığını gösterir. Bir UNX sonra hafta, sol böbrek hipertrofisi oluşur tutmalı; belirten 5/6th kaldırma daha az doğru böbrek her zaman sonuçlarının ağırlığına göre hesaplanan kaldırılması gerekiyor ağırlık. Bu ameliyat sırasında sol böbrek ağırlığını belirlemek mümkün olmadığı için ancak, bu orijinal böbrek kütlesinin yaklaşık 5/6th ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yüksek tuz diyeti ve geçici NOS inhibisyonu ile birlikte Lewis sıçanlarda renal kitle, bir 5/6th cerrahi olarak çıkarılması insan CKD benzer CKD bir modeli yol açar ve CKD medikal tedavinin nedensel mekanizmaları ve etkinliğinin çalışma sağlar.

5/6th nefrektomi modeli CKD, iyi bilinen ve geniş çapta tarif modelidir. Ancak, sadece böbrek kitle 5/6th kaldırarak tüm sıçan suşları acil böbrek yetmezliğine yol açmaz. Biz GFP + Lewis sıçan 21 durumu gibi CKD hücre bazlı tedavilerin etki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz onu mükemmel teknik yardım için Krista den Ouden teşekkür ederim. Bu teknik, mali, Hollanda Böbrek vakıf, hibe C06.2174 tarafından desteklenmiştir. MCV Bilimsel Araştırma Hollanda örgütü (NWO) Vidi-hibe 016.096.359 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    Reaktif< / güçlü>
L-NNASigma-aldrichN5501 
Spongostan dental: jel köpük pedler 1x1x1 cmJohnson & JohnsonMs0005 
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36EthiconV303H 
Ethicon Vicryl RB-1 + naald 5/0 V303H p / 36EthiconV392H 
Buprenorfin (0.3 mg/ml)Reckitt Benckiser tarafından sipariş edilen yerel eczacı aracılığıyla, ilaçbilinmiyor 
    Ekipman< / güçlü>
Öğrenci Doku Forsepsleri - 1x2 Diş 12 cmİnce Bilim Aletleri (FST)91121-12 
Öğrenci Standart Desen ForsepsFST91100-12 
Mayo MakasFST14010-15 
2X Semken ForsepsFST11008-13 
Öğrenci İris MakasıFST91460-11 
Olsen-Hegar İğne TutucuFST12002-14 

Kaynaklar

  1. AS, G. o, Chertow, G. M., Fan, D., McCulloch, C. E., Hsu, C. Y. Chronic kidney disease and the risks of death, cardiovascular events, and hospitalization. N. Engl. J. Med. 351 (13), 1296-1305 (2004).
  2. Fleck, C., Appenroth, D., et al. Suitability of 5/6 nephrectomy (5/6NX) for the induction of interstitial renal fibrosis in rats--influence of sex, strain, and surgical procedure. Exp. Toxicol. Pathol. 57 (3), 195-205 (2006).
  3. Griffin, K. A., Picken, M. M., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A. K. Functional and structural correlates of glomerulosclerosis after renal mass reduction in the rat. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (3), 497-506 (2000).
  4. Kang, D. H., Kanellis, J., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
  5. Baylis, C. Nitric oxide synthase derangements and hypertension in kidney disease. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 21 (1), 1-6 (2012).
  6. Bongartz, L. G., Braam, B., et al. Transient nitric oxide reduction induces permanent cardiac systolic dysfunction and worsens kidney damage in rats with chronic kidney disease. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298 (3), 815-823 (2010).
  7. Fujihara, C. K., De N, G., Zatz, R. Chronic nitric oxide synthase inhibition aggravates glomerular injury in rats with subtotal nephrectomy. J. Am. Soc. Nephrol. 5 (7), 1498-1507 (1995).
  8. Fujihara, C. K., Sena, C. R., Malheiros, D. M., Mattar, A. L., Zatz, R. Short-term nitric oxide inhibition induces progressive nephropathy after regression of initial renal injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (3), F632-F640 (2006).
  9. Dikow, R., Kihm, L. P., et al. Increased infarct size in uremic rats: reduced ischemia tolerance? J. Am. Soc. Nephrol. 15 (6), 1530-1536 (2004).
  10. Elrashidy, R. A., Asker, M. E., Mohamed, H. E. Pioglitazone attenuates cardiac fibrosis and hypertrophy in a rat model of diabetic nephropathy. J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther. 17 (3), 324-333 (2012).
  11. Haylor, J., Schroeder, J., et al. Skin gadolinium following use of MR contrast agents in a rat model of nephrogenic systemic fibrosis. Radiology. 263 (1), 107-116 (2012).
  12. Moriguchi, Y., Yogo, K., et al. Left ventricular hypertrophy is associated with inflammation in sodium loaded subtotal nephrectomized rats. Biomed. Res. 32 (2), 83-90 (2011).
  13. van Koppen, A., Joles, J. A., et al. Healthy bone marrow cells reduce progression of kidney failure better than CKD bone marrow cells in rats with established chronic kidney disease. Cell Transplant. , (2012).
  14. Baylis, C., Corman, B. The aging kidney: insights from experimental studies. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (4), 699-709 (1998).
  15. Szabo, A. J., Muller, V., Chen, G. F., Samsell, L. J., Erdely, A., Baylis, C. Nephron number determines susceptibility to renal mass reduction-induced CKD in Lewis and Fisher 344 rats: implications for development of experimentally induced chronic allograft nephropathy. Nephrol. Dial Transplant. 23 (8), 2492-2495 (2008).
  16. Darling, I. M., Morris, M. E. Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion. Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).
  17. Levey, A. S. Measurement of renal function in chronic renal disease. Kidney Int. 38 (1), 167-184 (1990).
  18. Myers, G. L., Miller, W. G., et al. Recommendations for improving serum creatinine measurement: a report from the Laboratory Working Group of the National Kidney Disease Education Program. Clin. Chem. 52 (1), 5-18 (2006).
  19. Hostetter, T. H., Meyer, T. W. The development of clearance methods for measurement of glomerular filtration and tubular reabsorption. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287 (5), F868-F870 (2004).
  20. Koeners, M. P., Racasan, S., Koomans, H. A., Joles, J. A., Braam, B. Nitric oxide, superoxide and renal blood flow autoregulation in SHR after perinatal L-arginine and antioxidants. Acta. Physiol. (Oxf). 190 (4), 329-338 (2007).
  21. van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
  22. Kreutz, R., Kovacevic, L., Schulz, A., Rothermund, L., Ketteler, M., Paul, M. Effect of high NaCl diet on spontaneous hypertension in a genetic rat model with reduced nephron number. J. Hypertens. 18 (6), 777-782 (2000).
  23. Liu, Z. C., Chow, K. M., Chang, T. M. Evaluation of two protocols of uremic rat model: partial nephrectomy and. 25 (6), 935-943 (2003).
  24. Griffin, K. A., Picken, M., Bidani, A. K. Method of renal mass reduction is a critical modulator of subsequent hypertension and glomerular injury. J. Am. Soc. Nephrol. 4 (12), 2023-2031 (1994).
  25. Meyer, F., Ioshii, S. O., et al. Laparoscopic partial nephrectomy in rats. Acta. Cir. Bras. 22 (2), 152-156 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kronik B brek Hastal ModeliRenal Fonksiyon l mn lin KlerensiPAH KlerensiProtein ri l mSistolik Kan Bas nc

İlgili makaleler