Yöntem makalesi

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

DOI:

10.3791/50443

⸱

16 Temmuz 2013

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler arası Ca 2 +-Dalgaları gap junction kanalları ve hemichannels tarafından tahrik edilmektedir. Burada, hücreler arası Ca ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır 2 +-Dalgaları yerel bir tek hücreli mekanik uyaran ve özellikleri ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels düzenlenmesi araştırmak için uygulama yanıt olarak hücre mono tabakaları içinde.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler arası iletişim, beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal içeren organlar ve dokular, çeşitli hücreler arasında fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Deneysel ayarlarında, hücreler arası Ca 2 +-dalgaları tek bir hücreye mekanik bir uyaran uygulanarak elde edebilir. Bu hücre içi sinyal IP molekülleri 3 ve Ca 2 serbest bırakılması yol açar + komşu hücrelere mekanik uyarılmış hücreden + dalga eş Ca 2 yayılma başlatmasını. Arası Ca 2 +-dalga yayılımı kontrol ana moleküler yollar IP 3 doğrudan transferi yoluyla ve ATP serbest bırakılması ile hemichannels tarafından gap junction kanalları tarafından sağlanmaktadır. Özellikleri ve farklı konneksin ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels olarak pannexin izoformlarının düzenlenmesi belirlenmesi ve karakterizasyonu quantificatio izin verdiğin arası Ca 2 +-dalga siRNA ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels inhibitörlerinin kullanımının yayılması. Burada, bir sonucu olarak hücreler arası Ca2 hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyonu ile oluşturulan bir kontrollü ve lokalize mekanik uyarıcıya tepki olarak Fluo4-AM yüklendi primer endotel hücrelerinin mono tabakaları + dalga ölçmek için bir yöntem tarif az 1 mikron bir ipucu çaplı bir micromanipulator kontrollü cam mikropipet ile hücre zarının dokunmadan. Ayrıca birincil sığır kornea endotel hücreleri ve + dalgaları ATP serbest bırakılması ile arası Ca 2 için tahrik güç olarak Cx43-hemichannel aktivite değerlendirmek için model sistem olarak kullanımı izolasyonu açıklar. Son olarak, kullanımı, avantajları, sınırlamalar ve boşluk kavşak kanal ve hemichannel araştırma bağlamında bu yöntemin alternatifleri tartışmak.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler arası iletişim ve sinyal doku ve tüm organ düzeyinde 1,2 de hücre dışı agonistler yanıt olarak fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Hücreler arası iletişimin en doğrudan yolu boşluğu kavşak oluşumu tarafından oluşturulur. Gap junction 3,4 komşu hücrelerin iki konneksin (Cx) hemichannels (Şekil 1) başkanı kafaya yerleştirme ile oluşan protein kanalları gap junction kanalları plaklar vardır. Ara bağlantılar neden olan ve modüle Ca2 komşu hücreler 6 (Şekil 2) arasında hücre içi mağazalarından +-serbest bırakma., Ca2 + veya IP 3 5 de dahil olmak üzere, en az 1.5 kDa arasında bir moleküler ağırlığa sahip küçük sinyal moleküllerinin geçişine izin Boşluk birleşme kanalları sıkıca redoks modifikasyon ve benzeri gibi, intra-ve intermoleküler protein etkileşimleri ile ve hücresel sinyal süreçler ile düzenlenirfosforilasyon 7. Gjs böylece kimyasal ve elektriksel syncytium olarak hareket eden, bağlı hücrelerin koordine cevabı sağlar. Örneğin, atriyal ve ventriküler kalp miyositleri arasında hareket potansiyelinin yayılmasını Cx-tabanlı GJ kanal 85 aracılığıyla gerçekleşir. Cxs sadece gap junction kanalları olarak rol değil, aynı zamanda eşleşmemiş hemichannels oluşturmak, böylece düzenli iyon kanalları 8-10 (Şekil 1) benzer zarlarında kanalları olarak çalışmıyor. Hemichannels hücre içi ve dışı çevre arasındaki iyon ve sinyal molekülleri değişimini kontrol ederek komşu hücreler arasında parakrin sinyal katılmak.

Bir çok hücre tipinde (epitel hücreleri, osteoblastik hücrelerin, astrositlerin, endotelyal hücreler, vb gibi) ve organların (beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal gibi), hücreler arası Ca 2 + dalgalar hücreli yanıtların koordinasyonu için temel olan 11. Belirli bir hücrede hücre içi Ca 2 + düzeylerinde artış bu hücre ile sınırlı, ama böylece bir hücreler arası Ca 2 +-dalga 12,13 kurulması, çevredeki komşu hücrelere yaymak değildir. Bu hücreler arası Ca 2 + dalgaları syncytium ve düzensizliği patofizyolojik işlemleri 11 ile ilişkili olduğu gibi hücre katmanları fizyolojik düzenlenmesi için önemlidir. Kornea endotel ve epitel, kendi 25-33 gibi farklı grupları 14-24, hücreler arası iletişim mekanizmaları ve rolleri okudu. Olmayan uyarılabilir hücrelerde, kornea endotel hücreleri gibi, hücreler arası iletişim iki ayrı modu 28,29, yani boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim ortaya çıkar. Gap kavşak arası iletişim boşluğu kavşak 7 ile sinyal molekülleri doğrudan bir değişimi içerir. Gap junctional arası iletişim, doku dengesini korumak hücre çoğalması kontrol ve hücre dışı stres 10,34,35 bir senkronize cevap kurmak için önemlidir. Patolojiler bir dizi, gap junction bağlantı nedeniyle hatalı CXS düşürüldü, ve burada boşluk kavşak arası iletişim 36 etkiliyor. Bu çok hücreli organizmalarda boşluğu kavşak arası iletişimin önemini ve etkisini vurgular. Bu yayılabilir dışı haberciler (Şekil 2) sürümü içerdiğinden boşluğu kavşak arası iletişim aksine, parakrin hücreler arası iletişim, hücre-hücre apozisyon bağlı değildir. Sinyal moleküllerinin farklı hücre sinyalizasyon hücre dışı boşlukta serbest bırakılır. Molekül daha sonra belirli bir reseptör proteini ile tespit edilir, hedef hücreye taşınır. Daha sonra reseptör sinyal kompleksi olan bir hücresel yanıtı indüklersinyal, ya da etkisiz hale duyarsızlaştırma çıkarılması ile sonlandırılır. Çıkış lipofilik hücre dışı sinyal haberciler membran nüfuz ve hücre içi reseptörleri üzerinde hareket ederler. Buna karşılık, hidrofilik haberciler yanıt hücrenin plazma zarı çapraz değil, ama sonra hücre içi çevreye sinyal röle yüzey ifade reseptör proteinler, bağlanan bir ligand olarak hareket ederler. Iyon-kanalı-bağlantılı, enzim-bağlı ve G-protein-bağlantılı: hücre yüzeyi reseptör proteinlerinin üç önemli aile bu süreçte yer alırlar. Serbest haberci molekül yakın (parakrin) hedef hücreleri üzerinde, aynı hücre (otokrin) reseptörleri üzerinde hareket edebilir, ya da dolaşım sistemi (endokrin) gerektiren uzak hedef hücreler üzerinde.

Kornea endotel 28,29 dahil olmak üzere birçok hücre tipi içinde, hücre içi ATP Ca 2 + dalgalar 37-40 yayılma sürücü büyük hidrofilik, parakrin faktörlerden biridir. DurÇeşitli maddeler olarak kaldırılması ile mekanik deformasyon, hipoksi, inflamasyon veya stimülasyon, ATP kayma gerilmesi, çekme ya da ozmotik 44,45 şişme tepki olarak 41-44 sağlıklı hücrelerden serbest bırakılabilir. Farklı ATP-serbest bırakma mekanizmaları veziküler ekzositozu 44 ve bu, ATP-bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcılar, plasmalemmal voltaj bağımlı anyon kanalları 46, P2X7 reseptör kanalı 47,48 yanı sıra, ayrıca nakil mekanizması, bir bolluk da dahil olmak üzere, öne sürülmüştür konneksin hemichannels 49-52 ve pannexin hemichannels 43,49,53. Hücre dışı ATP ADP, AMP hızla hidrolize olması ve hücre dışı ortamda mevcut ectonucleotidases ile 54,55 adenozin olabilir. Ekstraselüler serbest ATP ve metaboliti ADP 56 difüzyon yoluyla yayılacak. Komşu hücrelerde purinerjik reseptörleri ile bu nükleotidlerin işlemler daha sonra p rolü de ortaya konmuşturarası Ca 2 +-dalgaları 28,37,51 bir ropagation. Purinerjik reseptörlerinin iki farklı sınıflar mevcut: Her iki pürin (ATP, ADP) ve pirimidin (UTP, UDP) nükleotidler en P2-purinoceptors 57 hareket ise adenozin, P1-purinoceptors için başlıca doğal ligand olduğunu.

Hücreler arası iletişim gibi kazıma yükleme, boya transferi, IP 3 ve Ca 2 +, mekanik uyaran, vb gibi agonistlerin yerel uncaging gibi farklı yöntemlerle incelenebilir. Burada + dalga yayılımı, tek bir hücrenin mekanik uyarılar ile ortaya çıkarılan Ca 2 çalışma açıklar. Mekanik olarak uyarılmasıyla, Ca 2 +-dalga yayılımı eğitim avantajı + dalga zamanla Ca 2 yayılmasını ölçmek için kolay bir araç sağlar ve kantitatif olarak farklı hücre ön işlemleri karşılaştırarak izin vermektedir. Kornea endotel, bu hücreler arası Ca 2 +-dalgaları eş izintek tabaka gelen koordine yanıt, burada göz içi ameliyat sırasında hücre dışı zorlamalara dayanıklı endotel yardımcı olmayan rejeneratif kornea endotel olası bir savunma mekanizması olarak hareket, ya da bağışıklık ret veya üveit 58,59 sırasında inflamatuvar mediatörlerin maruz üzerine.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kornea Endotel Hücre İzolasyonu

Başlamadan önce: göz enucleating sonra yerel bir mezbaha, en kısa zamanda elde edilen taze gözlerle, gelen hücreleri izole edin. Göz maksimum 18 aylık, beş dakika ölüm sonrası ve Earle Dengeli Tuz Çözüm korunmuş bir inek olarak çıkarıldı emin olun - 4% 1 iyot çözeltisi laboratuvara taşınması için ° C.

  1. Earle Dengeli Tuz Çözeltisi dışında göz atın - 1% iyot çözeltisi ve bir Petri kabı (100 x 20 mm) yerleştirin.
  2. % 70 etanol ihtiva eden bir çözelti ile göz sterilize ve% 1 iyot içeren Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ile durulayın.
  3. Bu adım, steril bir kaput çalışır. Dikkatlice gözden kornea incelemek ve yukarı gelecek şekilde epitel hücre tabakası ile Earle Dengeli Tuz Çözeltisi içeren bir Petri kabı (35 x 10 mm), yerleştirin. Dikkatlice kalan iris dokusu sti kaldırmakGerekirse kornea bağlanmış ll.
  4. Yukarı endotel hücre tabakası ile petri içeren başka bir Earle Dengeli Tuz Çözeltisi için kornea aktarın ve Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ile iki kez yıkayın.
  5. Bir fincan şeklinde yemektir bir kum saati, yukarı bakacak şekilde endotel tabakası ile kornea aktarın ve büyüme ortamı ile örtün. Büyüme ortamı, 25 mM glukoz,% 10 fetal sığır serumu,% 6.6 L-glutamin, 2.5 ug / ml amfoterisin B ve% 1 antibiyotik-antimikotik karışım 10,000 birim ihtiva / ml penisilin, 10,000 ug içeren Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı oluşmaktadır streptomisin / ml ve 25 ug / ml amfoterisin B
  6. Bir emme pipet ile ortam çıkarın.
  7. Korneanın endotel tabakası (tripsin içeren tüm adımları aynı konsantrasyon ile yapılan) bir tripsin solüsyonu (0.5 g / L) 300 ul uygulayın.
  8. Kapalı bir Petri kabındaki kornea içeren kum saati yerleştirin ve inc koydum37, 30 dakika boyunca ubator ° C ve% 5 CO2.
  9. Yavaşça steril bir başlık bir yangın cilalı kanca şeklindeki cam Pasteur pipeti ile kornea uzak endotel hücreleri kazıyın.
  10. Endotel hücreleri ihtiva eden çözelti emmek ve kültür ortamı 4 ml'lik kültür şişeleri (25 cm2) ekleyin.
  11. Kornea büyüme ortamı 300 ul uygulayın ve kazıma tekrar ve kültürü şişesi endotel hücreleri içeren çözeltisi ekleyin.
  12. Bir kez daha bu son adım (1.11) tekrarlayın.
  13. Kültür yerleştirin 37 inkübatör büyüme ortamı ° C ve% 5 CO2 'de endotel hücreleri içeren şişeler.
  14. İki gün sonra, kültür ortamı içinde 6 ml eklenir.
  15. Iki günde bir büyüme ortamı yenileyin.

2. Hücre Kültürü

  1. Kültür ortamı çıkarın ve ulaşıldığında konfluent Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (Abou içinde olan hücreler iki kez yıkayınizolasyon sonra t 10 gün).
  2. Bunları ayırmak ve inkübatör şişesi yerleştirmek için hücrelere 1.5 ml tripsin çözeltisi ekleyin (37 ° C,% 5 CO2) 3-4 dakika karıştırıldı.
  3. Büyüme ortamı 12 ml ilave edilir. Hücreleri dağıtmak ve hücreleri saymak için içinde ve dışında orta üç kez pipetle.
  4. Hücre yoğunluğu ve inkübatör koyun bağlı olarak değişken bir kısmı ile tohum hücreleri. 165.000 hücre hücre sayısı (cm 2 başına hücre yoğunluğu 39.286) ile iki iyi odacıklı slaytlar (4.2 cm 2 bir alana sahip) hazırlayın. Cm2 başına 6250 bir yoğunlukta yeni bir pasaj boyunca 80 cm2 kültürü şişeleri hazırlayın ve 25 ml'lik bir toplam hacme taze kültür ortamı ile toplayın.
  5. Her iki günde orta yenileyin.
  6. Hücre tabakası birleşene 3-4 gün sonra ulaşılır. Deneyler için hücreler kullanır.
  7. Şişeler, hücre tabakasının konfluent ulaşıldığında, 2.6 'dan 2.1 adımları tekrarlayın. 2 pasaj kadar hücre kültürleri kullanılan f edilebilirveya deneyler.

3. Indükleyen Kalsiyum Wave için mekanik Uyarım

  1. 10 uM Fluo-4 ile odacıklı slayt hücreleri yük AM 37, 30 dakika boyunca fosfat tamponlu tuz ° C'de hafifçe çalkalandı.
  2. Fluo-4 AM çözeltisi çıkarın, fosfat tamponlu tuz ile hücreler beş defa yıkanır, fosfat tamponlu tuz ile hücre inkübasyon ve ölçümden önce, oda sıcaklığında en az 5 dakika boyunca hücreler bırakın.
  3. Argon lazer ve kullanım ışın ayırıcı HFT 488 ile 488 nm de Excite, bir uzun geçiş emisyon filtresi LP 505 ile 530 nm floresan emisyon toplamak en azından iğne deliği ayarlayın. Bir yağ daldırma 40X objektif (Hava, 1.2 NA) kullanın. ARL-67156 ile deneylerde, bir 10X objektif kullanın (Hava, 0.3 NA).
  4. Hücreleri konfokal mikroskop birleşik olduğu bir alan arayın.
  5. Pozisyon, 45 odacıklı slayta açıdan ° ve-hücre membranı dokunmadan üstünde olacak şekilde pipet.Tek bir hücreye kısa (≈ 1 sn) mekanik stimülasyon kışkırtmak. Mekanik uyarma kısa olan bir amplifikatör aracılığıyla çalıştırılabilir bir piezoelektrik kristal nanopositioner birleştirilmiş bir cam mikropipet (uç çapı <1 mm) ile, hücre zarının% 1'den daha az dokunarak hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyon oluşmaktadır bir mikro-manipülatör monte. Cam mikropipet çekici bir mikroelektrot ile yapılır. Nanopositioner mekanik uyarılması sırasında 0,2 ve 1,5 V arasında bir gerilim tarafından işletilen olduğundan emin olun. 1,5 V daha bir gerilim yüksek hücre hasarına neden olabilir. Her hücre tipi ve durumu için, hücre zarar vermeden mekanik uyarılması için en uygun voltaj dikkatli yüksek (1,5 V) gerilimi (0,2 V) düşük başlayarak gerilim bir dizi uygulanarak belirlenmelidir. Bu voltaj, hücre zarı uygulanan mekanik stres ve gerginlik belirlediği için gerilim uyarım kuvveti için bir ölçüdür.Mekanik uyarı kuvveti alanı ile mekanik strese çarpılarak hesaplanabilir. Alanı (<3.14 mikron 2) ve mekanik gerilme hem de çok düşük olduğu için, mekanik uyarma gücü düşüktür. (Bir hücre hasar görmesi durumunda, hücre ve hücre dışına floresan sızıntıları karanlık döner unutmayın.)
  6. Mekansal değişiklikleri ölçmek [Ca 2 +] konfokal mikroskop ile mekanik stimülasyon takip i.
  7. Görüntü toplama ve depolama.
  8. Konfokal mikroskop yazılımı kullanarak duyarlı hücreleri (aktif alan, AA) toplam yüzey alanı tanımlamak için ilgi bir çokgen bölge çizin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak yürütülür ve ortaya olan protokol KU Leuven hayvan bakımı ve kullanımı komitesi rehberlik ve onay altında yapılır.

Sığır kornea endotel hücreleri (BCEC) olarak, fonksiyonel gap junction ifade ve boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim hem de interaktif bir şekilde hücreler arası iletişim önemli katkı, ancak ana yol aracılık parakrin hücreler arası iletişim yolu olduğu gösterilmiştir v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, bir mikropipet kullanarak lokalize ve kontrollü mekanik stimülasyon sağlayarak birincil sığır kornea endotel hücrelerinin tek katmanlarını içinde hücreler arası Ca 2 +-dalga yayılımı ölçmek için basit bir yöntem tarif. Mekanik olarak uyarılmış hücreleri +, her ikisi de arası Ca 2 + dalga yayılımının 11,67 sürücü gerekli hücre içi sinyal molekülleri, hücre içi IP 3 ve Ca 2 yerel bir artış ile yanıt verir. Ca 2 + hemichannels açılması ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuvarda yapılan araştırma Araştırma Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir - Flanders (FWO; hibe numaraları G.0545.08 ve G.0298.11), Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar Programı (Belçika Bilim Politikası; hibe sayısı P6/28 ve P7/13) ve FWO destekli araştırma topluluğu yerleştirilmiştir. Flanders (FWO) - CDH Araştırma Vakfı bir doktora sonrası adam olduğunu. Yazarlar çok Moleküler ve Hücresel Sinyal (KU Leuven), Dr SP Srinivas (Optometri Indiana Üniversitesi, ABD), Dr Leybaert en laboratuvar (Ghent Üniversitesi) Laboratuvarı tüm mevcut ve eski üyelerine minnettar ve vardır yararlı tartışmalar sağlanan Dr Vinken (VUB), prosedürler optimize veya konneksin hemichannels çalışma için araçlar geliştirilmesi dahil edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS)Invitrogen-Gibco-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)14155-048
İyotSigma-Aldrich (Deisenhofen, Almanya)38060-1EA
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Invitrojen-Gibko-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)11960-044
L-glutamin (Glutamax)Invitrogen-Gibco-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)35050-038
Amfoterisin-BSigma-Aldrich (Deisenhofen, Almanya)A2942
Antibiyotik-antimikotik karışımıInvitrogen-Gibco-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)15240-096
TripsinInvitrogen-Gibco-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)25300-054
DulbeccoPBSInvitrogen-Gibco-Moleküler Probları (Karlsruhe, Almanya)14190-091
Fluo-4Invitrogen-Gibco-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)F14217
ARL-67156 (6-N,N-Dietil-b,g-dibromometilen-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Almanya)A265
Apyrase VISigma-Aldrich (Deisenhofen, Almanya)A6410
Apyrase VIISigma-Aldrich (Deisenhofen, Almanya)A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)Özel peptit sentezi
Gap27 (SRPTEKTIFII)Özel peptit sentezi
Kontrol Peptit (SRGGEKNVFIV)Özel peptit sentezi
siRNA1 Cx43 (anlamlı: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Tavlanmış siRNA şu adresten satın alındı: Eurogentec (Luik, Belçika)
siRNA2 Cx43 (anlamlı: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Tavlanmış siRNA, Eurogentec'ten (Luik, Belçika) satın alındı)
siRNA karıştırma: siCx43-1'in şifreli dizisi (anlamlı: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Tavlanmış siRNA, Eurogentec'ten (Luik, Belçika)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)Termo Elektron (Ulm, Almanya)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Almanya)
İki odacıklı cam slaytlarLaboratory-Tek Nunc (Roskilde, Danimarka)155380
Konfokal mikroskop Carl Zeiss Meditec (Jena, Almanya)LSM510
Piez– lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)PI Polytech (Karlsruhe, Almanya)P-280
HVPZT-amplifikatörPI Polytech (Karlsruhe, Almanya)E463 HVPZT-amplifikatör
Cam tüpler (cam değiştirme 3.5 nanolitre)World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, ABD4878
Micr– lektrode çektirme Zeitz Instrumente (München, Almanya)WZ DMZ-Üniversal çektirme
satın alındı)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074(2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6(2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451(2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8(2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gap Junction KanallarHemikanal AktivitesiKonfokal MikroskopiFluo4 AM Y klemesiMikromanip lat r Stim lasyonuATP Sal n m l mKonneksin zoform Analizi

İlgili makaleler