Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Özet

Primer hücre kültürü özellikle belirli gelişim aşamalarında transgenik fare embriyolardan, hücrelerin belirli nüfus analiz etmek için yararlı bir tekniktir. Burada, embriyonik ventriküller disseke ve ayrışmış ve antikor konjuge boncuk tanımak ve daha fazla analiz için endotel hücreleri ayırmak vardır.

Özet

Hücre kültürü büyük ölçüde sayısız kültür koşulları altında hücrelerin tek tek nüfus değerlendirmek için yeteneğimizi geliştirdi. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve bunların kullanım kolaylığı için önemli avantajlar sunmasına rağmen, bu hücre hatları tüm potansiyel hücre tipleri için kullanılamaz. Özellikle transgenik fare ilgi belirli bir bölgesinden birincil hücreleri, izole ederek, daha nüanslı çalışmalar yapılabilir. Temel teknik organ veya ilgi kısmi organı (kalp ve kalbin belirli bir bölge gibi) diseksiyon ve tek hücrelere organ dissociating içerir. Bu hücreler daha sonra ilgi hücre türünü tanıyan bir antikor ile konjuge manyetik boncukları ile inkübe edilir. İlgi hücreleri daha sonra, taneciklerden hücreleri ayırmasıyla kısa bir tripsin ile inkübasyon sonucunda, bir mıknatısın kullanılması ile izole edilebilir. Bu izole edilmiş hücreler daha sonra kültüre ve benzeri gibi arzu edilen analiz edilebilir. Bu teknik, aslında yetişkin fare organ için tasarlanmıştırs ancak kolayca burada gösterdiği gibi, embriyonik organları ile kullanım için küçültülmüş olabilir. Bizim ilgi gelişmekte olan koroner damar olduğu için, biz özel embriyonik aşamalarında hücrelerin bu nüfus okumak istedim. Bu nedenle, orijinal protokole embriyonik ventriküllerin küçük boyutu ve bu gelişim aşamalarında endotel hücrelerinin potansiyeli düşük verim ile uyumlu olacak şekilde modifiye edilmesi gerekiyordu. Bu ölçekli aşağıya bir yaklaşım kullanarak, biz transgenik embriyonik ventriküler endotel hücreleri koroner pleksus yeniden değerlendirilmiştir.

Giriş

Ölümsüzleştirdi hücre hatları gelişi temel hücre biyolojisi ¹ devrim yarattı. Hali hazırda mevcut olan hücre hatları organların geniş elde edilen ve bütün büyük hücre tipleri kapsamaktadır edilir. Ancak, kurulan hücre hatları bazı sınırlamalar var. Ölümsüzleşme işlemi belli özel kullanım ömrü ve çoğalma ile ilgili olarak, hücre davranışını değiştirir, aynı zamanda, örneğin ² sitoskeletal proteinler gibi beklenmedik proteinlerin ifade etkileyebilir. Pek çok farklı hücre hatları kullanılabilir olsa da buna ek olarak, bütün bir organizma içinde tek bir hücre türü arasında anlamlı bir farklılık yoktur. Özellikle gösteri çeşitli davranışlarda endotel hücreleri arter veya ven ve akış ne tür geminin ³ mevcut onlar hat olmasına göre. Gelişimsel olarak daha acil, ancak, (bakınız, örneğin, t mevcut hücre hatlarının büyük çoğunluğu yetişkin dokusundan elde edilen olmasıdırATCC ile kullanılabilir o toplama). Bu yetişkin hücre hatları büyük olasılıkla embriyonik öncüleri dinamik yapısı özetlemek yok. Gelişimi sırasında gözlenen hızla değişen uzaysal gen ifade desenleri belirli bir gelişim aşamasında bir organı bir endotel hücre farklı bir gelişim aşamasında aynı organdan bir endotel hücre ile aynı şekilde davranır değil olabileceğini düşündürmektedir.

Ticari olarak temin edilebilen ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri kullanılarak bir alternatif olarak, primer hücrelerde ilgilenilen belirli bir dokusundan izole edilebilir. Bu tekniğin avantajı ise, bu birincil hücrelerde bile belirli bir organ ya da belirli bir gelişme aşamasında bir organ parçası izole edilebilir. Ayrıca, bu birincil hücreler gen nakavt ve bu transfeksiyon verimi gibi başka sorunlar kaçınarak Knock-in vitro çalışma sağlayan, mevcut transgenik hayvanların çeşitli izole edilebilir. Beklendiği gibi, pek çokteknikleri özel hücre tipleri ^4,5 izole etmek için nasıl ayrıntılı yayınlanmıştır. Genel olarak, bu teknikler, hücreler, etiketleme ilgilenilen belirli bir hücre tipi, tutmuş ve daha fazla analiz için bu hücrelerin izole edilmesi, ilgili bölgenin toplama içerir.

Koroner endotel hücrelerinin erken embriyonik nüfus incelemek için, daha küçük bir organı ile kullanmak için daha önce yayınlanmış teknik ^4. küçültülmüş. Bu ölçekli aşağı prosedürü ile, özel embriyonik aşamalarında embriyonik kalp koroner endotel hücreleri izole olabilir. Bu hücreler daha sonra bu geçiş analizleri gibi geleneksel endotel deneyleri, de kullanılabilir. Erken evredeki embriyonik hücre hatları daha yaygın hale gelinceye kadar, birincil hücreler ile çalışan bir çok değerli bir tekniktir.

Protokol

1. Antikor-konjuge boncuk hazırlayın

1. Diseksiyon önce bir gün, üreticinin talimatlarına göre, uygun Dynabeads (sıçan yükseltilmiş bir antikor örneğin fare IgG Dynabeads, 4 x 10 ⁸ boncuk / ml), seçilen antikor bir araya getirir. BD sıçan anti-CD31 antikoru (0.5 mg / ml, endotel hücreleri izole etmek için kullanılan) için 3 ul antikor, bir son 1.5 mg anti-CD31 antikoru konsantrasyonu ve / 1 x 10 ⁷ boncuklar için, her 25 ul boncuk ilave edilir 25 ul tampon.
2. 4 ° C'de boncuk ve gece antikor inkübe

2. Kollajen Plaka hazırlanması

1. Sadece bir kollajen kaplı plaka aksine bir kollajen jel üzerinde büyüdüğü zaman izole hücreler daha hızlı tübüller oluştururlar. ^6'da tarif edildiği gibi bu nedenle, kollajen jel, diseksiyon gece önce yapılır. Bir doku kültürü kaputu buz üzerinde, aşağıdaki reaktifler (yeterli 19 kuyu için) birleştirmek: 206,4 ul steril H 2, O, 140.4 ul kollajen tip I (4.08 mg / ml), 38.4 ul 10x M199 ve 1.15 ul 5 M NaOH.
2. , 384-çukurlu bir doku kültür plakasının deliklerine içine bu kollajen jel Pipet 20 ul. 30 dakika boyunca 37 ° C doku kültürü inkübatöründe plaka koyun.
3. Her kuyuya 80 ul DMEM ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe ° C Kültür ortamı çıkarın ve iki kez daha tekrarlayın.
4. Son durulama sonra, iyi FBS / DMEM her 80 ul% 10 ekleyin ve 37 gece boyunca inkübe ° C İzole hücrelerin eklenmesinden önce, kültür ortamı çıkarın.

3. Vergi ve Kalp Digest

1. Onaylanmış bir ötenazi tekniği kullanarak istenen embriyonik gün bir zamanlı hamile fare Euthanize. Tüm deneyler Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
2. Bir yatar pozisyonda fare ile, liberal önce% 70 etanol ile kadın ventral tarafı spreydiseksiyonu. Iç organların uzak alt karın cilt ve kas kaldırmak için forseps kullanarak, iç organları görselleştirmek için dişinin alt karın boşluğu açmak kesti.
3. Forseps ile serviks Holding, dikkatle forseps için kuyruk kesme ve karın boşluğundan uterin horn kaldırma başlar. Uterin boynuz kaldırırken, yerine boynuz tutan herhangi bir bağ dokusu kesip. Uterin boynuz eksize bitirmek için, rahim boynuz boşaltmak için yumurtalık ile rahim boynuzu kavşak kesti.
4. Soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve gerektiğinde durulama içeren bir Petri kabındaki uterin horn yerleştirin. Ekli embriyonik kesesi ortaya çıkarmak için orta hat üzerinden uterin horn açın kesin.
5. Embriyo kesme yanlışlıkla önlemek ve bir embriyo almak için plasentanın kavşakta bir embriyonik kese ve embriyo açın kesin. Soğuk PBS ile ikinci bir Petri tabağına yerleştirin embriyo. Buz rahim boynuz ile Petri kabı dönün.
6. Dgöğüs duvarı erişimi artırmak için embriyo ecapitate. Genotiplendirme gerekli ise, çıkarın ve buz üzerinde yerleştirilen bir Eppendorf tüp kaydetmek için kuyruk kesti.
7. Sırtında embriyo ile kalp ve akciğer görselleştirmek için göğüs duvarı açın kesti. Sonra, yavaşça yol göğüs duvarı yukarı çekin ve dışarı, kalp kesim önlemek için, kaburga alt kısmında yatay bir kesim tarafından izlenen bir ön ayakları yakın göğüs kafesinin sol tarafındaki dikey bir kesim, yapmak. Yaklaşık embriyonik gün 13.5 ile, göğüs duvarı görselleştirme yardım, şeffaftır.
8. Dikkatlice forseps kullanarak kalp kaldırın ve aşağıdaki damarları kesti. Daha sonra, kalp boşaltmak için büyük damarların üzerinde kesti. Akciğer damarları kesilmiş değilseniz, akciğer kalp ile kaldırılabilir. Gerekirse Böylece, akciğer gibi, yabancı dokuları çıkarın.
9. Ayırın ve ventriküllerden kulakçıklar ve büyük damarları atın. Makas kullanarak, küçük parçalar (yaklaşık 1 mm ^{3 ventrikül kıyma/> Sup) ile yaklaşık 500 ul kolajenaz (steril PBS içinde 1 mg / ml) içinde bir yer. Tüm ventrikül kıyılmış ve kollajenaz yerleştirilmiştir kadar buz üzerinde örnekleri tutun.}
10. Ventrikül ayrı bir Eppendorf tüp her kalp toplama, tüm embriyolardan eksize edilmiştir kadar önceki adımları tekrarlayın. Tüm embriyolar aynı genotip varsa, kalpleri tek bir Eppendorf tüp toplanmış olabilir. Tek bir seferde işlenen örneklerin sayısını izolasyonu için kullanılan mıknatıs dayalı sınırlı olabilir; DynaMag (123-21D) 16 Eppendorf tüpleri en fazla tutar Burada kullanılan.
11. 45 dakika süre ile sallanan ile 37 ° C de kıyılmış ventriküller yerleştirin. Her 15 dakika, hafifçe örnekleri çıkarın ve mekanik hücreleri ayırmak aşağı yukarı pipet ve.

4. Endotel Hücreleri İzolasyon

1. Hücrelerin kalan kümeleri kaldırmak için filtre 70 mikron ile ventrikül-kollajenaz çözüm geçmek.
2. 10 dakika için 400 xg'de hücreleri santrifüj. Iskartasüpernatant, DMEM yaklaşık 200 ul% 10 FBS ile değiştirin, ve hücreleri ayırmak aşağı yukarı pipet ve.
3. Bir kez bir önceki adımı yineleyin. Ikinci% 10 FBS / DMEM yıkamadan sonra 10 dakika için 400 xg'de hücreleri santrifüj. 50 ul% 10 FBS / DMEM hücrelerin tekrar.
4. Son santrifüjleme basamağı sırasında, boncuklar hazırlar.
   1. 1 dakika boyunca bir mıknatıs üzerinde antikoru ve boncuklar içeren Eppendorf tüpüne koyun.
   2. Mıknatıs üzerinde yerinde borusu ile süpernatantı. Mıknatıstan tüp çıkarın ve yaklaşık 100 ul% 10 FBS / DMEM ekleyin.
   3. 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüp yerleştirin. Süpernatantı ve% 10 FBS / DMEM ile tekrar yıkayın. 3 yıkar toplam tekrarlayın.
   4. Son yıkamadan sonra,% 10 FBS / DMEM-konjuge antikor boncuklar (numune başına 5 ul) tekrar süspansiyon haline getirin.
5. Her bir hücre örneği için, antikor-konjuge boncuk 5 ul ekleyin. Sallanan gıda ile 4 ° C de boncuk hücre süspansiyonları yerleştirinr 30 dakika.
6. , Bir laminar akış başlığı içinde, 1 dakika için mıknatısla hücreleri ve antikor-konjuge boncuklar içeren Eppendorf tüpleri. Süpernatantı, mıknatıs gelen tüpleri çıkarın ve yaklaşık 100 ul% 10 FBS / DMEM ile yıkayın. 5 yıkama için tekrarlayın.
7. Son yıkamadan sonra, 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpleri süpernatantı ve mıknatıs tüpleri çıkarın. Yaklaşık 100 ul DMEM ekleyin.
8. 1 dakika için mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin, süpernatant kaldırmak ve mıknatıs gelen tüpleri çıkarın. 100-200 ul ekle% 0.25 tripsin-EDTA ile önceden ılıtılır. 37 ° C'de numunelerin ve 5 dakika boyunca% 5 _CO2.
9. 2 dakika için mıknatıs tüpler yerleştirin. Taze Eppendorf tüplerine hücre içeren süpernatant dikkatlice aktarın. 400 x g hızında 5 dakika santrifüjlenir.
10. Süpernatantı. Beklenen verim bağlı olarak, ya da 384-iyi muamele kültür çanak - 80-100 ul büyüme ortamı ve plaka 96 hücrelerin tekrar süspansiyon(E14.5-E16.5 embriyoların ventrikül yaklaşık 450-600 hücreleri). Endotel hücreleri için, (aşağıda tanımlandığı gibi) endotelyal büyüme kültür ortamı kullanın.

Sonuçlar

CD31 tanıyan bir endotel spesifik antikor kullanarak, endotel hücreleri embriyonik (E) 13.5 (Şekil 1A), 18.5 (Şekiller 1B-1D) embriyoların ventriküller izole edilmiştir. Işlenmemiş bir kültür çanak yetişen, bu hücreler yuvarlak kalır ve yakın birleşik (Şekil 1A), bir Arnavut kaldırımı deseni oluşturacak. Sulandırmak kollajen de kuyu kat için kullanılmıştır ve endotel hücreler (Şekil 1B) bağlı olurken, onlar daha az zincirleri oluşturmak zaman bir kollaj...

Tartışma

Primer embriyonik hücreler ile çalışma yeni deneyler geliştirme in vitro kritik adımda ele sağlar. Ancak, izolasyon prosedürü önemsiz değildir. Hücrelerin her türlü izole etmek için kritik adımlar hücreleri de onlar iyi yıkama adımları sırasında askıya alınır o zaman kollajenaz sindirim üzerine ayrılır ve olmasını sağlamak yer alıyor. Pipetleme mekanik diseksiyon ölçüde kolajenaz adımı sırasında hücrelerinin ayrılmasında yardımcı olur ve filtreleme adımı hücre kümeleri kaldırır. Bu adımlar, nüfusun saf...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
REAGENTS
Timed-gebe fareler			İlgilenilen embriyonik aşamada diseke edilecek
Anti-fare CD31	BD Bioscience	553370
Sıçan IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
Kollajen	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
Kollajenaz, tip I	Worthington Biyokimyasal	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Endotel hücre büyüme ortamı	(notlarda açıklandığı gibi laboratuvarda yapılmıştır)		% 20 FBS, 5 & içeren DMEM; M β-mercapt– Thanol, 50 & mu; g/ml EKG ve 1x penisilin/streptomisin
β-mercapt– thanol	Sigma-Aldrich	M6250
EKGS Biyomedikal	Teknolojileri A.Ş.	BT-203
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140
Tripsin-EDTA	Gibco	25300
384 oyuklu kültür plakası	Greiner	T-3037-6	Plakası, 6< / sup> çalışma yüzey alanı 10 mm 2< / sup>Kollajen tip I BD'de tarif edildiği gibi ince bir kollajen jeli ile hazırlandı
		354236.	Finalde kullanın 1.5 mg / ml
M199 konsantrasyonu, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	13< / sup>
< güçlü > < / >
streoskopik mikroskop	Nikon	SMZ645
Hücre kültürü inkübatörü	Thermo	3110
DynaMag	Invitrogen	123-21D
Masa üstü santrifüj	Termo	75002430