Method Article

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

DOI:

10.3791/50521

⸱

July 23rd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım rapor Agrobacterium tumefaciens'in Protein geçici ekspresyonu için bitkiler içine.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücre kültürü İnsan aşısı ve terapötik proteinler bölgesinin ticari bir üretimi için gerekli ana bir platform olduğunu. Ancak, onun sınırlı ölçeklenebilirlik ve yüksek maliyet nedeniyle ilaç için artan dünya çapında talep karşılamak değildir. Bitkiler sağlam, ölçeklenebilir, düşük maliyetli ve güvenli olan en umut verici alternatif ilaç üretim platformlarından biri olduğu gösterilmiştir var. Virüs-temelli Vektörel Çizimler bölgesinin son gelişme bitkilerde otelinin yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin çabuk ve daha yüksek-düzey geçici ifade izin verdi biriktirdi. Daha da geçici ifade sisteminin yardımcı programı optimize etmek için, biz bu çalışmada bitki doku içine hedef-genini içeren Agrobacterium tanıtmak için bir, basit, verimli ve ölçeklenebilir metodoloji göstermek. GFP ve DsRed; Bizim sonuçlarımız yöntemleri yaprakları ve, iki floresan proteinleri bölgesinin sağlam bir üretim haline Agrobacterium'un bölgesinin etkin bir şekilde giriş sonuçlandı oylandı şırınga ve vakum her ikisi de ile bu agroinfiltration işaret etmektedir. Bundan başka,biz her iki yöntem tarafından sunulan benzersiz avantajlar göstermek. Şırınga infiltrasyon basittir ve pahalı ekipman gerekmez. Bu, aynı zamanda esneklik ya da tek bir hedef geni ile olmak üzere bütün bir izni içine süzülmek maksadıyla, ya da bir yaprak ilgili sayısız birden fazla hedeflere bölgesinin genleri tanıtmak için fiyatları karşılaştırın. Bu nedenle, bu yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin laboratuar ölçekli bir ekspresyonu için yanı sıra tekrarlamalı olarak verim ya da ifade kinetiği, için farklı proteinler ya da Vektörel Çizimler fiyatları karşılaştırırken için ikinci el edilebilir. Şırınga infiltrasyon sadeliği, aynı zamanda biyoteknoloji konusunu için lise ve üniversite eğitimi yılında kendi programını göstermektedir. Buna karşılık yılında, vakum infiltrasyonu ile daha sağlam bir olduğunu ve farmasötik bir proteinlerin bölgesinin ticari bir Üretim yılı için ölçekli-kadar olabilir. Ayrıca bu tür marul ve Arabidopsis olarak şırınga infiltrasyon için mükellef değildir bitki türleri agroinfiltrate mümkün olmanın avantajı sunuyor. Genel olarak değiştirin, şırıngayı ve vakum agroinfiltration bölgesinin bir kombinasyon araştırmacı ve eğitimci tarafından görüşler sağlar, bir, basit, verimli, ve sağlamgeçici protein ekspresyonu için metodoloji. Bu büyük ölçüde ilaç proteinlerin gelişimi kolaylaştırmak ve fen eğitimi teşvik edecektir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1970'lerden bu yana, bitkiler rekombinant proteinler ve protein tedavi 1 en ticari üretimi için, memeli böcek, ve bakteriyel hücre kültürleri alternatif olarak araştırılmıştır. Biyofarmasötik ifadesi için bitki-tabanlı sistemler klinik çalışmalarda başarı göstermiştir, Gaucher Hastalığı 2, ve kuş H5N1 gribi 3 gibi hastalıklar, için birkaç yeni tedaviler olarak son yıllarda söz göstermiştir. Bu ilk deneyleri yılından bu yana on yıllarda bitkilerde rekombinant protein ekspresyonu için yetkili mekanizmaların gelişimi üç ana nedenden dolayı protein Mevcut üretim paradigma değiştirmek için bitki-tabanlı sistemler için potansiyel yarattı. İlk olarak,, memeli böcek, ve bakteriyel biyoreaktörler hatırı sayılır başlangıç ​​maliyetleri, pahalı büyüme ortamı, ve aşağı akım saflaştırma 4 için karmaşık süreçler gerektiren olarak maliyet yılında kayda değer bir azalma var. Istikrarlı bir transgenik bir bitki bölgesinin yaratılması,hatları da protein ifade bitkilerin yetiştirildiği ve bir tarım ölçeği 5 üzerinde hasat olabilir gibi onları diğer ifade sistemlerinin ölçeklenebilirlik geride için izin verir. İkinci olarak, bitki-tabanlı ifade sistemleri önemli ölçüde kamu güvenliği 6 içinde üstünlüğünü gösteren, insanlara protein-ifade ana bilgisayardan bir insan veya hayvan patojen verici riskini azaltmak. Son olarak, bitkiler glikosilasyon ve birden çok-alt-birimi proteinlerin 7 bölgesinin derleme dahil olmak üzere proteinleri bölgesinin düzgün bir yazılan Mesajı göster-translasyonel modifikasyonu için izin veren, memeli hücreleri için 'e benzer olduğunu, bir ökariyotik endomembran sistemi kullanmaktadır. Bu yetenek bir daha karmaşık yapıya sahip ve kapsamlı posttranslasyonel değişiklikler veya montaj 8 gerektiren, monoklonal antikorlar (mAbs) de dahil olmak üzere ilaç rekombinant proteinlerin daha geniş bir dizi, yılından bu yana, bakteriler gibi prokaryotik sistemleri, dayalı olanlar öncesinde bitki-tabanlı sistemler koyar.

Iki büyük beğenme vardır Birbitkiler otelinin yeniden birleştirici proteinler ifade eden bulundunuz aşkınla kanıyor. Olanlar önce Herhangi, hedef ilgili protein için kodlama DNA'nın bir ifade kaset içine klonlandı ve nükleer ya da kloroplast, genomların Her iki durumda da için tanıtıldı, bir stabil bir şekilde transgenik hattı ile, bölgesinin bir gelişmedir. Bunu yaparken, yabancı DNA nesiller başarılı yoluyla kalıtsal hale gelir ve kadar diğer ekspresyon sistemleri 1 özelliğinin ötesinde bir, muazzam geliştirilmiş ölçeklenebilirlik için izin verir. Nükleer genom için bunlara dışarıdan ayrıca DNA sokulması; Ortalama gönderim süresi doku, 9 takım arasından mikroprojektil bombardımanı edenler tarafından, daha az sıklıkta,, bir bitki dokusu bölgesinin Agrobacterium tumefaciens'in enfeksiyon edenler tarafından gerçekleştirildiğini ya da edilir. Bitki hormonları O zamanki farklılaşma ve kökleri ve yaprakları gibi bu tür transgenik bir bitki dokusunun bölgesinin büyümesini teşvik etmek için ikinci el uygulanır. Olan kloroplastın genom bölgesinin dönüştürülmesi A ile birlikte elde edilebilir değil, olabilir DNA ile kaplanmış tumefaciens ', fakat altın veya tungsten partikülleri, ilgili sayısız tamamen güvenir bitki hücrelerine yerleştirmek için balistik olarak ateş etti. Recombina ifade İkinci yöntembitkiler otelinin nt protein geçici ifade aracılığıyla 10 olduğunu. Bu senaryoda yılında, faiz bölgesinin edilen geni taşıyan virüs-Türetilmiş bir Vektörel Çizimler A. cihaz aracılığıyla teslim edilir bir süreç yoluyla tam gelişmiş bitkiler için tumefaciens agroinfiltration çağırdı. Bunun yerine, bitki genomuna içine entegre bölgesinin idarelerce, teslim alınan gen yapısı, O zamanki, kısa bir kuluçka bir süre sonra hasat edildi ve izole edilebilir verebiliriz, böylelikle istenilen proteinin, bölgesinin geçici doğrudan üretimde bulunmak bulundunuz başlayacak doyurmaya. Bitkiler agroinfiltration 11 sonra yaklaşık 1-2 hafta hasat için hazır olacak gibi geçici gen ekspresyonu, daha büyük bir genel protein birikimi yanı sıra protein üretim geliştirilmiş bir zaman avantajı sunuyor. Bu, bir yıl için birkaç ay sürebilir istikrarlı transgenik bitki hatları, nesil, seçimi, ve onay süreçleri daha önemli ölçüde daha hızlı olduğunu. Bu genetik olarak istikrarlı bitki li verim olmayacak gibi Ancak bu,, aynı zamanda geçici ifade sisteminin sınırlamasıdırbüyük bir ölçekli ticari üretim için bir tohum bankası oluşturmak için de kullanılabilir olabilir Nes. Bu rağmen, yaklaşımları büyük ölçekli bir geçici ifade iyileştirmek için geliştirilmiştir oylandı oylandı. Burada, biz A. edenler tarafından teslim edilen yapıbozuma viral bir Vektörel Çizimler kullanarak geçici bir proteini-ifade eden Nicotiana benthamiana bitkilerin bölgesinin nesil bölgesinin biri yöntem ortaya koymaktadır tumefaciens.

İki büyük Yöntemleri A. bölgesinin Sevkiyat için geliştirilen ediliyor edilmektedir bitki doku içine tumefaciens: vakum odası aracılığı ile şırınga ve büyük ölçekli infiltrasyon aracılığı ile tezgah ölçek infiltrasyonu. Her iki protokol N. kullanıyorsanız burada açıklanmıştır yakından ortak tütün bitki ile ilgilidir benthamiana,, iki floresan proteinleri geçici ifadesi için ev sahibi bitki olarak: denizanası Aequorea victoria ve Discosoma mercan (DsRed) 12,13 gelen kırmızı floresan proteini gelen yeşil floresan proteini (GFP). N. benthamiana için var En sık görülen ev sahibi bitki olduğunubu genetik transformasyon için uygun, çünkü rekombinant protein, hızlı bir şekilde biyokütle yüksek miktarda verim, ve ölçek-up üretim 14 için bir üretken tohum üreticisidir olabilir. N kullanarak bölgesinin bir diğer gibi olanaklar protein ekspresyonu için hosts olarak benthamiana ekspresyon Vektörel Çizimler 2,5 bölgesinin, bir ve çeşitli bölgesinin Rezervasyon durumuna olduğunu. Bu çalışmada, yılında, iki yapıbozuma viral bir Vektörel Çizimler de, bir tütün mozaik virüsü (TMV) RNA dır replikon da içerebilir sistemi (MagnICON Vektörel Çizimler) ve fasulye sarı, cüce bir virüsü (BeYDV), DNA replikon da içerebilir sistemi (geminiviral Vektörel Çizimler) 4,11 adlı işletmeye türeyen diğer, ilgili sayısız dayalı bir 15-18, GFP ve DsRed gen taşımak ve N. içine onları teslim etmek için kullanılan edilir A. yoluyla benthamiana hücreleri tumefaciens '. Üç DNA yapıları GFP ile veya MagnICON Vektörel Çizimler ile birlikte DsRed ekspresyon için ikinci el uygulanmaz doyurmaya. Onlar İlgi bölgesinin ait geni ihtiva eden modülü (PiCh 5 en ', hedef gen, normal gene 3 bölgesinin ifade sürüş için en promotör ve diğer genetik elementler içeren modülü (pICH15879)' include-GFP veya PiCh-DsRed) eklenmiş ve, integraz modülü (pICH14011) ifade 8,15 üzerine doğrudan 5 've 3' modüllerin birlikte başarılı çalışmalarını entegre eden bir enzim için kodlama tekniklerinin anlaşılması. Üç DNA yapıları, aynı zamanda geminiviral Vektörel Çizimler ile ilgili yeni biçimler için ihtiyaç vardır. , Hedef genin (pBYGFP ya da pBYDsRed) bölgesinin replikon da içerebilir ihtiva eden Vektörel Çizimler bulundunuz Buna ek olarak yani, çoğaltma proteini (pREP110) Şunun için kodlama yapan bir Vektörel çizim, hedef replikon da içerebilir 11,14,16 bölgesinin amplifikasyonu için gereklidir. Bundan başka, domates bushy stunt virus adlı işletmeye susturma bastırıcı syf 19 kodlayan bir Vektörel çizim bölgesinin eklenmesi yüksek seviyesi hedef gen ekspresyonu 11,16 için arzu edilir.

Bitki büyüme, A. de dahil olmak üzere agroinfiltration edenler tarafından bitki hücrelerine yerleştirmek için yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin genlerin bölgesinin tanıtımı yılı için üç büyük adımlar genel olarak, vardır Bir tumefaciens kültür hazırlanması, ve infiltrasyon. Her biri için her adımda Bu yordamı bölgesinin nihai başarısı için kritik öneme sahiptir gibi, bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama verilmedi edilmektedirşırınga infiltrasyon ve aşağıda vakum infiltrasyon her ikisi için de.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bitki Büyüme

  1. Bir yayılma tepsiye Sıra 60 turba pelet. Musluk suyu bölgesinin 4 L-ekleyin ve bunları turba peletler, 2 saat için en su emme izin ver.
  2. 2 N. Ekle bir ekme makinesi kullanarak her bir turba pelet içine benthamiana tohumları, bir şeffaf plastik kubbe ile tepsiyi kapağı, ve onları bir 16/8 saat gündüz / gece döngüsü (Şekil 1A) ile bir 25 ° C, 84% nemli bir ortamda çimlenmeye için izin verir.
  3. , Iki hafta içinde tohumlama sonra kubbe Filtreyi kaldır kaseti adlı işletmeye su tahliye, ve 1.48 Kullanıcı g / L olarak (Şekil 1B) bölgesinin bir konsantrasyonda Jack at ait Kullanıcı gübre bölgesinin 2 L ekleyin. Bir 16/8 saat gündüz / gece döngüsü ile bir 25 ° C, 50% nemli bir ortamda bitkiler büyümek için devam edin. Jack'in gübre 2 L tepsi başına her 2 gün Tedarik.
  4. Onlar yaş 6 hafta (Şekil de infiltre edilecek hazır olana kadar hafta 4 anda, daha fazla büyüme (Şekil 1C) için yeterli alan sağlamak için altı bitkiler barındıran bir yeni bir tepsiye turba pelet ile bitkiler transferi1D).

2. A. tumefaciens Kültür Hazırlık

Şırınga İnfiltrasyon için 2.1 Hazırlık

  1. Streak A. geminiviral Vektörel Çizimler P19, pREP110, pBYGFP, ve kanamisin (100 ug / ml), içeren LB Agar, plakalar ilgili sayısız pBYDsRed ihtiva eden tumefaciens 'GV3101 suşlarında rastlanmaktadır. Streak tek bir plaka başına şekil değiştirme ve, 48 saat boyunca 30 ° ° C de büyür.
  2. Benzer bir şekilde, çizgi ve LB, Agar, ilgili sayısız GV3101 5 en bölgesinin MagnICON Vektörel Çizimler yataklık suşları 'modülü (pICH15879), nin 3' GFP ile veya DsRed (PiCh-GFP veya PiCh-DsRed) bölgesinin söz konusu hedef gen ihtiva eden modülünü yüklemekte ve İntegraz (pCH14011 sahip) giderek büyümeye karbenisilin (100 ug / ml), ihtiva eden plakalar için mükemmeldir.
  3. LB Agar plağı ilgili sayısız, bir tek bir koloni Şu kaynaktan, YENB medya, 3 ml (% 0.75 Bacto maya özü,% 0,8 'i Besin Elementi Broth,, İN NaOH, ile 7.5' pH değeri ayarlamak) içine geminiviral Vektörel Çizimler yataklık GV3101 suşları inoküle edin +, kanamisin (100 İsim: ug / ml) bölgesindeki , bir 15 ml lik yuvarlak-alt kültür tüp, ° C olarak 30 okuyun sıvı kültürü büyümekbir 300 rpm dönme oranı ile bir gecede bir çalkalayıcı.
  4. Benzer bir şekilde, inoküle ve 30 okuyun, çalkalayıcı gece boyunca otelinin YENB ortamı + karbenisilin (100 ug / ml), otelinin MagnICON Vektörel Çizimler barındıran GV3101 suşları ° ° C. büyümek
  5. , Bir Spektrofotometre ayarlandıktan ve uygun antibiyotikler ile YENB medya bölgesinin 10 mi bölgesindeki 0.025 'bölgesinin bir başlangıç ​​OD 600 ile birlikte, bir yeni bir kültür için alt-kültürlenmiştir biçimde duyulabilmesi için gerekli ses seviyesi (V alt) hesaplamak almak için aşağıdaki şu formülü kullanınız ile birlikte her bir sıvı kültür için uygun şekilde ölçü ve kayıt OD 600 ile değerleri, .
    V sub (mi) = (10 mi) x (0.025) daha kötü / OD 600 ile
  6. Için gecede kültür Devri V alt (ml) (10 - V alt) her bir suş için uygun antibiyotik ile YENB medya ml. , Yeni kültürü 30 okuyun bir gecede bir 250 rpm Eksende Dönme oran na sahip bir çalkalayıcı ° C de OD 600 değeri var 1.7-2.0 bölgesinin olan erim içinde bulunmaktadır e kadar. Büyütün
  7. Ölçün ve kayıt OD her bir sıvı kültür için 600 değerleri ve kalk için aşağıdaki formülü kullanınher bir suş için 0.12 bölgesinin, bir yarıyıl sonu OD 600 vermek üzere infiltrasyon tamponu bölgesinin to 50 ml 'otelinin seyreltilerek kullanılır için en gerekli hacim (V inf) içeren dizine ulate.
    V Inf (mi) = (50 mi) x (0,12 inç) / OD 600 ile
  8. Transferi, türbindeki V bir mikrosantrifüj tüp bulundunuz, her kültürün bölgesinin Inf (ml) ve 2 dakika Ülke: boyunca 12.000 xg'de okuyun santrifüj edenler tarafından hücreleri aşağı doğru döndürün, yüzer tabakanın kaldırmak ve daha sonra (10 mM MES, pH = 5.5 10 ml 'infiltrasyon tampon içinde hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin; 10 mM MgSO 4) kısaca vorteks tarafından.
  9. Mix pBYGFP + pREP110 + p19 hücreleri yeniden süspanse, 2 dakika süreyle 12.000 xg'de hücreleri aşağı spin, ve infiltrasyon tampon 50 ml toplam tekrar süspansiyon haline getirin. Bu, Agrobacteria'nın bir kombinasyon, GFP bölgesinin geminiviral ekspresyon için olduğunu.
  10. Benzer şekilde,, Agrobacterium hücrelerin aşağıdaki kombinasyonları karıştırın aşağı spin ve infiltrasyon tampon 50 ml bunları tekrar süspansiyon haline getirin. Bunlar şunlardır (1) pBYDsRed + pREP110 DsRed bir geminiviral ifadesi, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110 için + p19GFP ve DsRed, (3) pREp110, GFP bölgesinin MagnICON ekspresyonu, (5) Şunun için geminiviral ekspresyon bölgesinin negatif kontrol olarak B + syf 19, (4) PiCh GFP +-pICH15879 + pCH14011 PiCh-DsRed + pICH15879 + bölgesinin eş-ekspresyonu geminiviral + için syf 19 MagnICON DsRed ifade, ve MagnICON ifade için negatif kontrol olarak (6) pICH15879 + pCH14011 için pCH14011.

Vakum İnfiltrasyon için 2.2 Hazırlık

  1. Inoküle edin ve kültür, her GV3101, bir to 50 ml 'otoklavlanmış şişeye otelinin uygun antibiyotikler ile YENB medya bölgesinin 15 mi içine geminiviral Vektörel Çizimler ya da MagnICON Vektörel Çizimler ihtiva eden şekil değiştirme ve büyümek gibi bir gecede yukarıda bulunan şırınga infiltrasyon için tarif edildiği.
  2. Bir spektrofotometre ve uygun antibiyotik ile YENB medya 250 ml içinde 0.025 bir başlangıç ​​OD 600 ile bir yeni bir kültür için alt kültürlenmeli için gerekli hacmi (V alt) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanınız ile her bir sıvı kültür için ölçün ve kayıt OD 600 değerleri .
    V alt (Ml) = (250 mi) x (0.025) daha kötü / OD 600 ile
  3. Transferi V için gecede kültür alt (ml) (250 - V alt) her bir suş için uygun antibiyotik ile bir 1 L otoklavlanmış şişesi içinde YENB medya ml ve bir gece boyunca yukarıdaki gibi şırınga infiltrasyon için açıklanan yeni bir kültür büyür.
  4. Ölçün ve kayıt OD her bir sıvı kültür için 600 değerleri ve her bir suş için 0.12 bir son OD 600 vermek için infiltrasyon tampon 3 L içinde seyreltilerek kullanılır gerekli hacmi (V inf) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.
    V Inf (mi) = (3000 ml) x (0,12 inç) / OD 600 ile
  5. Pelet ve şırınga bulunduğu infiltrasyon için tarif edildiği ve şırınga bulunduğu infiltrasyon için tarif edildiği her kombinasyonu için bir göre olan yeniden süspanse kültürler kaynaşır olduğu gibi infiltrasyon tamponu içinde, her kültürün bölgesinin Pastör pipetiyle V Inf (ml) eklenmiştir. Repellet karışık Agrobacteria'nın hücreleri ve infiltrasyon tamponu 3 L 'si otelinin onları tekrar süspansiyon haline getirin.

3. Sızma

3.1 Şırınga Sızma

  1. Dört 6-hafta eski N. seçin 5'te ile birlikte benthamiana bitki her bir bırakır. Her bitkinin bölgesinin En iyi adlı işletmeye sayma olanlar önce Herhangi üç yaprak çıkar A. bölgesinin kombinasyonları bölgesinin tek bir tıklamayla tamamen infiltre edilmelidir doyurmaya infiltrasyon tamponu içinde suşları Hüseyin Avni ÖKTEM. Dördüncü yaprak olacak nokta-sızmış geminiviral ifade için tüm dört gerginlik kombinasyonları veya MagnICON ifade için her üç kombinasyonları ile. Her bir bitki üzerinde son yaprak negatif kontrollerin kombinasyonları ile infiltre edilecektir.
  2. Yaprak arka yüzünde (Şekil 2A) üzerindeki epidermiste bir iğne ile bir küçük bir nick oluşturun. Dikkat: infiltrasyon karışımdaki edildiği gibi Agrobacterium hücrelerin yaprağın diğer tarafına ponksiyon geçecek gibi, her iki tarafın yoluyla yaprak delmek için olarak çok zor çizmemeye emin olun.
  3. Yaprak ön tarafında sağlam bir tutun alın ve nazik uygularkenbir elin başparmak ile nick için karşı basınç, bir iğne (Şekil 2B) olmadan bir şırınga ile nick içine infiltrasyon tampon içinde Agrobacterium karışımları enjekte. Not: Agrobacterium karışımın yaprak en hücreler arası alanı girer olarak, infiltre alanı (Şekil 2C) gözle görülür bir şekilde koyu yeşile döner.
  4. Koyu yeşil bir daire genişletmek için durana kadar nick içine Agrobacterium karışımlar enjekte etmek için devam edin. Tüm yaprak sızmış ve bütün yaprak ilk üç yaprak ve son yaprak için daha koyu yeşil döner edilir kadar başka bir nick ve adımları tekrarlayın 3.1.2-3.1.4 oluşturun.
  5. Her bitkinin dördüncü yaprak için, Tüm dört (geminiviral vektör) ya da üç (MagnICON vektör) kombinasyonları içine sızmış edilecektir. Agrobacterium suşların her bir kombinasyon için bir tane nick yapmak, ve bir kombinasyonu ile her nick sızmak.
  6. Infiltrasyon sonra, büyüme oda ve monitör için bitkiler geri hareket2-15 gün sonrası infiltrasyon (dpi) arasında tor protein ekspresyonu.

3.2 Vakum Sızma

  1. Bir vakum desikatörde ve küvet için Agrobacterium suşları içeren transferi 3 L infiltrasyonu tampon içine bir küvet yerleştirin. , Bir Vacuubrand diyafram vakum pompası (Şekil 3A) için en desikatöre iletişime geç.
  2. Desikatöre plaka (Şekil 3B) üzerinde baş aşağı bir bitki yerleştirin ve tüm yaprak ve kök sistemi küvet tepesine dinlenme plaka ile infiltrasyon tampon içine batık kadar bitki ile plaka daha düşük. Kenarı boyunca desikatöre O-ring yerleştirin ve odası (Şekil 3C) üzerindeki desikatöre kapak koymak.
  3. Vakum pompası açın ve vakum 100 mbar ulaştığında zamanlama başlar. Yavaş yavaş sular altında bitki dokusu bölgesinin interstisyel boşluk içine Agrobacteria'nın bölgesinin girişinde izin vermek için 100 İsim: mbar az 1 dakika Ülke: sonra, kurutma cihazı ile ilgili en serbest bırakma valfi açık. Bu adımı bir Additi yılında tekrarlayıniyi infiltrasyon sağlamak için Önal zaman.
  4. Infiltrasyon sonra, desikatöre en bitki dışarı almak ve dik konuma onu geri koymak. 2-15 dpi arasındaki büyüme oda ve monitör protein ekspresyonu için bitkiler geri hareket ettirin.

4. Floresan Protein Algılama ve Fotoğrafçılık

  1. Karanlık bir odada içine dpi, hareket bitkiler 2 başlayarak ve bir el-tutulan UV lamba ile infiltre yaprakların arka tarafında UV ışığı parlaklık.
  2. GFP veya DsRed en kırmızı floresan en yeşil floresan gözlemlemek. DsRed kısa dalga UV ışığı altında daha güçlü iken GFP, uzun dalga UV ışığı ile bir güçlü bir sinyal kapalı verir.
  3. Hiçbir flaş ile bir normal bir dijital kamera ile floresan yaprakların foto ¤ raf çekin.
  4. Gözlem ya da fotoğraf sonra büyüme odasına bitkiler geri hareket ettirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Şırınga İnfiltrasyon tarafından Floresan Proteinlerin İfade

Geminiviral ve MagnICON - - N. iki farklı yapıbozuma bitki viral vektörler tarafından - GFP ve DsRed - bitki doku içine Agrobacterium şırınga infiltrasyonu etkinliğini göstermek için, biz iki floresan proteinleri ifadesi test benthamiana. N. için tamamen Agrobacteria'nın ihtiva eden geminiviral Vektörel Çizimler ile birlikte infiltre edildi benthamiana yaprakları, GFP ifade gibi erken bir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein bazlı ilaç için artan talepleri tüm dünyada sağlam, ölçeklenebilir, düşük maliyetli ve güvenli yeni üretim platformları gerektirir. Bitkiler ilaç protein üretimi için en umut verici alternatif üretim sistemlerinden biri olarak göstermiştir. Son yıllarda, yıkılıp virüs esaslı vektörler geliştirilmesine büyük ölçüde hız ve bitki ekspresyon sistemleri 2,10 verimi artırır bitkilerdeki protein, geçici ifade sağladı. Daha da geçici ifade sisteminin programı optimize etmek için, biz bitki doku içine hedef-ge...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarının rakip var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz R. Güneş ve katkılarından dolayı Chen'in Laboratuvarı diğer öğrencilere malzeme üretimi bitki teşekkür ederim. Ayrıca Teknoloji ve Yenilik (CTI) ve College lisans araştırma verdiği destek için Dr D. Yeşil teşekkür ederim. Bu araştırma S. Chen NIH hibe U01 AI075549 ve 1R21AI101329 ve S. Chen için Arizona Devlet Üniversitesi CTI bir SSE hibe ile kısmen desteklenmiştir. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, ve J. Stahnke SSE hibe ile desteklenen lisans öğrencileridir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
GFP InvitrogenV353-20www.invitrogen.com Referansa bakın: Lico ve Chen, et al 2008
DsRedClontech632152www.clontech.com Referansa bakın: Baird ve Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector IconGeneticsn/awww.icongenetics.com Referansa bakın: giritch ve Marillonnet, et al 2006
Geminiviral VektörYazarı' s Labn/aReferansa bakın: Chen ve He, et al 2011
N. benthamianaYazar' s Labn/aherbalistics.com.au
>Agrobacterium tumefaciens strain gv3101Yazar' s Labn/aReferansa bakın: Lai ve Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plakalarSigmaL0418www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamisin-50, plakalarSigmaL0543www.sigmaaldrich.com
Magnezyum sülfat hepa hidratSigmaM2773-500 gwww.sigmaaldrich.com
Bacto-TryptoneFisher73049-73-7www.fishersci.com
Bacto Maya ÖzüBecton, Dickinson CO.REF 212750www.bd.com
Difco Besin SuyuBecton, Dickinson CO.REF 234000www.bd.com
MES hidrat TamponuSigmaM8250-1kgwww.sigmaaldrich.com
CarbenicillinSigmaC1613-1ML www.sigmaaldrich.com
KanamisinSigma70560-51-9www.sigmaaldrich.com
Sodyum HidroksitSigma221465www.sigmaaldrich.com
Jack' s GübreHummert InternationalTem-25www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vakum PompasıFisher13-878-113www.fishersci.com
Vakumlu Hava Regülatör ValfiFisherNC9386590www.fishersci.com
Kurutucu 12 1/8", O halkalıFisher08-594-15Cwww.fishersci.com
3 L KüvetKauçuk Hizmetçin/aRubbermaid Servn' Saver Bowl, 10 fincan çalışacak
plaka/raf 230MLFisherNC9489269www.fishersci.com
Turba PeletHummert Uluslararası14-2370-1www.hummert.com
Yayılma Tepsisi Kubbesihidro çiftlik132052www.hydroponics.net
Propagaiton Tepsisihydrofarm138758www.hydroponics.net
Virbo El MibzerGro-Mor INCn/awww.gro-morent.com
Flora Arabası 4 raflıHummert International65-6924-1www.hummert.com
15 ml Yuvarlak Tabanlı Kültür TüpleriSigmaCLS430172-500EAhttp://www.sigmaaldrich.com
SpektrofotometreBio-Rad170-2525www.bio-rad.com
Spektrofotometre KüvetleriBio-Rad223-9950www.bio-rad.com
Mikrosantrifüj TüpleriABD Bilimsel1415-2500www.usascientific.com
SantrifüjBio-Rad166-0602EDUwww.bio-rad.com
İnkübatör/ÇalkalayıcıEppendorfExcella E25 www.eppendorf.com
Ultraviyole Işık Modeli#: UVGL-25UVP95-0021-12www.uvp.com
Masaüstü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
  2. Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
  3. Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559(2010).
  4. Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
  5. Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
  6. Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
  7. Chen, Q., et al. New Generation Vaccines. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).
  8. Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
  9. Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
  10. Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
  11. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
  12. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  13. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
  14. Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
  15. Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
  16. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
  17. Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
  18. He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
  19. Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
  20. Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
  21. Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
  22. Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
  23. Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
  24. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AgroinfiltrationTransient ExpressionRecombinant ProteinsSyringe InfiltrationVacuum InfiltrationPlant BiotechnologyGFP ExpressionDsRed ExpressionAgrobacterium CulturePlant Transformation

Related Articles