Biz mikro ölçekli hücre stimülasyonu deneyler için otomatik bir hücre kültürü ve sorgulama platformu geliştirdik. Platform yetiştirilmesi ve hücrelerin küçük nüfus uyarıcı ve moleküler analizler için lizatları kurtarma, basit, çok yönlü ve hassas kontrol sağlar. Platform de değerli hücreleri ve / veya reaktif kullanmak çalışmalar için uygundur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu
Bu makalede
Özet
Özet
Kültür hücreleri (in vitro analizi) çalışması karmaşık biyolojik sistemlerin içine önemli fikir sağlamıştır. In vitro analizi için geleneksel yöntemler ve sistemler de mililitre ölçekli birimleri (≥ 0.1 ml) hücreleri (≥ 10 5), çok sayıda çalışma için uygundur. Ancak, bu ilgi ve / veya kültür, uyarılma ya da işlem için gerekli reaktiflerin hücre tüketimini azaltmak için kültür boyutunu aşağı ölçekte gerekli ya da arzu edilir olduğu birçok örneği vardır. Ne yazık ki, geleneksel yaklaşımlar mikro ölçekli kültürlerin hassas ve tekrarlanabilir manipülasyon desteklemez ve mevcut Mikroakiskan tabanlı otomatik sistemler çok karmaşık ve en laboratuvarlar tarafından rutin kullanım için uzmanlaşmıştır. Mikro ölçekli hacminde - Bu sorunu çözmek için, otomatik kültür, stimülasyon ve hücrelerin küçük nüfus (2.000 hücre 100) geri kazanımı için basit ve çok yönlü teknoloji platformu geliştirdiks (1-20 ul). Platform mikro ölçekli kültür, kurulan muhafaza ve uyarılır, içinde fibronektin kaplı mikrokapilerler ("hücre perfüzyon odaları"), bir dizi oluşur "transfer" mikrokapilerler ("merkez ile donatılmış bir dijital Mikroakiskan (DMF) cihazı "), ve perfüzyon odalarından yolları hücreleri ve reaktif olan, güçler perfüzyon odaları ve merkez arasında malzeme nakliyesi bir yüksek hassasiyetli şırınga pompası, hangi ve malzeme nakliyesi üzerinde kontrol sağlayan bir elektronik arayüz, hangi koordine ve önceden belirlenmiş komut ile otomatik. Bir örnek olarak, bakteri ile meydan bağlı bağışıklık hücrelerinde ortaya çıkardı transkripsiyonel yanıtlar çalışmayı kolaylaştırmak için platform kullanılır. Platformun kullanın bize, hücre ve reaktif tüketimini azaltmak deneme-için-deney değişkenliği en aza indirmek için etkin ve yeniden doğrudan eller emek. Bu bahşeder avantajları, hem de onun erişilebilirlik ve çok yönlülük, o göz önüne alındığındaur platformu laboratuar ve geniş bir uygulama çeşitli kullanım alanı bulur ve sadece sınırlı miktarlarda mevcut olan hücrelerin ve uyaranların çözümlenmesini kolaylaştıran çok özellikle faydalı olabilir gerekir.
Giriş
(In vitro analizinde) kültür muhafaza hücrelerin çalışma karmaşık biyolojik sistemlerin ve insan sağlığı düzenleyen temel ilke ve moleküler mekanizmaları içine değerli fikir sağlamıştır. Kültür, uyarılma ve Petri kutularına ve mikro-titer plakalar kullanmak analizi için hücreler, toplanması için konvansiyonel yöntemler mililitre çapta kültür hacmi hücreleri (≥ 10 5) (≥ 0.1 ml) arasında geniş popülasyonların çalışması için tasarlanmıştır. Ancak, hücrelerin sadece sınırlı bir miktarda mevcut olduğu bir çok durumda (örneğin, birincil hücreler), ya da küçük hücre popülasyonları (örneğin nüfus içerisindeki hücre-hücre değişkenliği aza....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu genel bir protokol çalışmaları geniş bir yelpazede için platformun uygulamayı desteklemek için tasarlanmıştır, bu raporda açıklanan temsilcisi çalışma özgü yönleri parantez içinde dışarı ayrılır Şekil 2 protokolü kullanılarak gerçekleştirilen temsili bir çalışma göstermektedir.. Protokolde, tüm "talimat" komutları önceden belirlenmiş komut kullanımı ile otomatik unutmayın. Adım 2 Adım 1 (Adım 1.7 ve 1.8 sırasında örneğin) paralel olarak yapılabilir bu da unutmayın ve bu adım 2.1 genellikle atlanır (desenli / kaplı DMF cihaz levhalar yıkanır ve tekrar kullanılabilir, çünkü; Adım 5.2) .
1. Hücre Perfüzyon Odalar m....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Otomatik platformunun bir gösteri olarak, bu bakteri ile meydan bağışıklık hücrelerinin küçük nüfus mikro ölçekli Üreyen edildiği bir çalışma, yürütmek için kullanılan ve (Şekil 2 pro-inflamatuar yanıtların kapalı platform analizi için parçalanmış .)
Altı hücre perfüzyonu odaların her büyüme ortamı 10 ml içinde tekrar süspanse 10 4 bağışıklık hücreleri (P388D.1 sıçangil makrofaj) ile tohumlandı. Bir bağlılık süresi (37 ° C, 2 saat) ve bir ortam değiştirme sonra, ~.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu mikro ölçekli hücre kültürü deneyleri ve uyarılması için basit ve çok yönlü bir otomatik bir platform geliştirdik. Kültür boyutları daha küçük çaplı mikrokapilerler kullanımı ile azaltılabilir; platformu bize küçük kültür hacimleri ve hücre popülasyonlarının (- - 20 ul ve 100 2.000 hücreleri, oda başına 1) ile çalışmasını sağlar. Bu ölçeklerde çalışan rutin çalışmaların maliyetini düşürür ve değerli reaktifler ve / veya hücrelerin kullanımı gerektiren mümkün çalışmalar yapar. Platform-idam deneyler de hücre .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Yazarlar DMF cihazları ve DMF merkezi tasarım ve geliştirme katkıları için Ronald F. Renzi ve Michael S. Bartsch teşekkür ederim. Bu araştırma tam Sandia Ulusal Laboratuarlarında Laboratuvarı Yönetmen Araştırma ve Geliştirme Programı tarafından desteklenmiştir. Sandia sözleşme DE-AC04-94AL85000 altında Enerji Ulusal Nükleer Güvenlik İdaresi ABD için Sandia A.Ş., Lockheed Martin Corporation'ın iştiraki, tarafından yönetilen ve işletilen bir çok programı laboratuvardır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Prelude Doğrudan Lizis Modülü | NuGEN | 1400-24 | |
| Tripan Mavisi (%0,4 w/h) | GIBCO | 15250-061 | |
| Hücre Sıyırıcı | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo Biyopartiküller | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR testi | Uygulamalı Biyosistemler | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR testi | Uygulamalı Biyosistemler | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR testi | Uygulamalı Biyosistemler | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR testi | GAPDH | Mm00443258_m1 | |
| TaqMan qRT-PCR testi | |||
| S-11928 | |||
| İndiyum kalay oksit (ITO) kaplı cam yüzeyler | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon kaplı erimiş silika mikro kılcal damarlar | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfüzyon odası mikro kılcal damarları | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Boru ve mikrokılcal bağlantı parçaları | Sandia Ulusal Laboratuvarları | ||
| Polikarbonat boru | Paradigma Optics | CTPC100-500-5 | |
| 30 mm (500 & # 956; l kapasite) şırıngalar | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C buhar biriktirme aleti | Özel Kaplama Sistemleri | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| Yüksek voltajlı fonksiyon jeneratörü | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 mikroskop | Olympus | İsteğe Bağlı (DMF hub'ında damlacıkların izlenmesini kolaylaştırır) | |
| QIClick dijital CCD kamera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | İsteğe bağlı (DMF hub'ındaki damlacıkların izlenmesini kolaylaştırır) |
Kaynaklar
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small. 7, 12-48 (2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
